劉 祥，孔智翔，殷書平2，毆莎莎，劉成艷，同韓虎，吳三橋，陳 琛，陳春琳

（1.陜西理工大學中德天然產(chǎn)物研究與開發(fā)利用聯(lián)合研究所，陜西 漢中723001；2.陜西醫(yī)藥控股集團生物制品有限公司，陜西 漢中723000）

奶牛乳房炎重要候選疫苗蛋白的抗原表位分析及三聯(lián)重組表位疫苗的氨基酸序列設(shè)計

劉 祥1，孔智翔1，殷書平2，毆莎莎1，劉成艷1，同韓虎1，吳三橋1，陳 琛1，陳春琳1

（1.陜西理工大學中德天然產(chǎn)物研究與開發(fā)利用聯(lián)合研究所，陜西 漢中723001；2.陜西醫(yī)藥控股集團生物制品有限公司，陜西 漢中723000）

為設(shè)計奶牛乳房炎三聯(lián)重組表位多肽疫苗，選取奶牛乳房炎3種主要感染菌的候選疫苗蛋白：金黃色葡萄球菌的Ebps與ClfA，大腸埃希菌的OmpA與OmpC，鏈球菌的SIP與PGK，通過ABCpred和BepiPred方案，預測獲得每種蛋白各有2個優(yōu)勢B細胞表位；利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法預測蛋白的CTL表位。結(jié)果顯示，SIP蛋白無CTL表位，其余蛋白均存在1個CTL細胞表位；采用MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽在線程序預測蛋白的Th表位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每種蛋白各有1個Th細胞表位。使用DNASTAR軟件分析6個蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預測獲得的B/T細胞表位大多處于蛋白易于產(chǎn)生表位的暴露表面、無規(guī)則卷曲與轉(zhuǎn)角等位置。再通過Protean程序重組拼接獲得的B/T細胞抗原表位，最終設(shè)計獲得抗原性較好的三聯(lián)表位疫苗氨基酸序列。為新型奶牛乳房炎三聯(lián)表位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

奶牛乳房炎；表位疫苗；抗原分析

乳房炎是奶牛的多發(fā)病，也是造成牛奶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟損失的重要原因之一［1］，病原菌主要為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）和鏈球菌（Streptococcus）［2］。目前，奶牛乳房炎疾病的防治措施主要是大量使用抗生素，但抗生素濫用易導致牛奶中的藥物殘留，以及細菌耐藥性的增加。此外，防治奶牛乳房炎疾病的疫苗可分為減毒疫苗、滅活疫苗［3］和蛋白亞單位疫苗［4］，但均處于研究的起步階段，商業(yè)化疫苗較少見［5］。而單次免疫可以同時抵御3種主要致病菌感染的蛋白多肽疫苗尚未開發(fā)。

表位疫苗是近年發(fā)展起來的一種新型疫苗，較傳統(tǒng)疫苗，具有安全、穩(wěn)定、產(chǎn)量高、免疫效果好，以及可人為設(shè)計等優(yōu)點。在腫瘤、肝炎、艾滋病、流感、寄生蟲等疾病防治上均有大量研究［6］，是疫苗研究的新方向。對奶牛乳房炎研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的凝集因子A（clumping factor，ClfA）［7］與彈性纖維結(jié)合蛋白（elastin binding protein，EbpS）［8］；大腸埃希菌的外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）［9］與外膜蛋白 C（outermembrane protein C，OmpC）［10］；鏈球菌的膜表面蛋白（surface immunogenic protein，SIP）與磷 酸 甘 油 激 酶 （phosphoglycerate kinase，PGK）［11-13］，這些蛋白具有很好的免疫原性，是很好的候選疫苗蛋白。我們期望通過生物信息學方法，分析這些蛋白的B/T細胞抗原表位，并將表位的氨基酸序列進行重組拼接，旨在設(shè)計安全、免疫簡潔與高效的奶牛乳房炎表位多肽重組疫苗，進而實現(xiàn)奶牛單次免疫就可抵御3種致病菌感染這一目標。

1 材料與方法

1.1 材料

選取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌候選疫苗蛋白各2個。依據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的氨基酸序列：金黃色葡萄球菌ClfA與EbpS蛋白（登錄號分別為EFM05894.1和EFM06457.1）；大腸埃希菌 OmpC和 OmpA（登錄號為AIL15476.1和ELV73478.1）；鏈球菌SIP和PGK（登錄號為AEL21614.1和AKU04271.1）。

1.2 方法

1.2.1 B細胞表位預測

采用BepiPred和ABCpred聯(lián)合預測B細胞表位。BepiPred方法是利用氨基酸的性質(zhì)和隱形馬爾可夫模型在線預測B細胞表位；ABCpred方法采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法［14］。最終B細胞表位選取兩種方案共有的氨基酸序列。

1.2.2 T細胞表位預測

輔助T細胞（Th）抗原表位預測類型選擇DRB1-0101、DRB1-0102和DRB1-0301結(jié)合肽，預測網(wǎng)站為：http://www.imtech.res.in/raghava/propred/。細胞毒性T細胞（CTL）抗原表位采用量化矩陣與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預測，選擇HLA-A2、HLA-A?0201、HLA-A?0202、HLA-A?0203、HLA-A?0205分子結(jié)合肽，通過 CTLpred程序預測［15］。

1.2.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

蛋白二級結(jié)構(gòu)采用DNASTAR軟件的Protean程序進行預測，獲得各個蛋白的抗原表位信息。目的是驗證獲得的B/T細胞表位是否處于蛋白抗原性較好的肽段位置。

1.2.4 重組表位疫苗的設(shè)計

將預測獲得的B/T細胞表位進行選擇性拼接，每個表位之間采用4個甘氨酸（GGGG）短肽進行分割，以減少各個表位間的相互影響。采用DNASTAR Protean軟件分析表位的不同排列方式，以各表位相對獨立且具有較好抗原性參數(shù)的組合方式，作為重組表位疫苗的氨基酸序列。然后，翻譯為核酸序列，最終獲得重組表位疫苗基因序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 B細胞表位預測

采用BepiPred和ABCpred聯(lián)合預測B細胞表位。BepiPred方法預測蛋白B細胞表位結(jié)果如表1所示；ABCpred方法預測結(jié)果見表2。綜合BepiPred和ABCpred兩種方案的共同序列區(qū)段，最終獲得金黃色葡萄球菌ClfA蛋白B細胞表位區(qū)段為：326-330，114-129；Ebps蛋白B細胞表位為：87-102，132-147。大腸埃希菌OmpA蛋白B細胞表位區(qū)段為：44-50，126-135；OmpC蛋白 B細胞表位為19-31，129-144。鏈球菌SIP蛋白B細胞表位區(qū)段為：224-238，346-358；PGK蛋白B細胞表位為：64-79，324-329。

表1 BepiPred方案預測蛋白B細胞表位的肽段位置Table 1 Prediction of B cell epitopes for proteins by BepiPred method

表2 ABCpred方案預測蛋白B細胞表位的肽段位置Table 2 Prediction of B cell epitopes for proteins by ABCpred method

2.2 T細胞表位預測

2.2.1 Th細胞表位預測

采用量化矩陣與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預測Th抗原表位。預測多肽種類選擇DRB1?0101、DRB1?0102、DRB1?0301，結(jié)果如表3所示。綜合多肽共有的區(qū)段，獲得金黃色葡萄球菌 Ebps與ClfA蛋白Th表位區(qū)段分別為：479-487、201-209；大腸埃希桿菌OmpA與OmpC蛋白Th表位區(qū)段分別為：284-292、6-12；鏈球菌SIP與PGK蛋白Th表位區(qū)段分別為：240-248、317-325。

2.2.2 CTL細胞表位預測

CTL表位預測采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法結(jié)合量化矩陣法，選擇HLA-A2、HLA-A?0201、HLA-A?0202、HLA-A?0203、HLA-A?0205分子結(jié)合肽，通過CTLpred程序預測，結(jié)果如表4所示。綜合多肽共有的區(qū)段，獲得金黃色葡萄球菌Ebps與ClfA蛋白CTL表位區(qū)段分別為：318-326、895-902；大腸埃希菌OmpA與OmpC蛋白CTL表位區(qū)段分別為：237-245、295-303；鏈球菌PGK蛋白CTL表位區(qū)段為73-81；鏈球菌SIP蛋白無優(yōu)勢CTL表位。

2.3 候選疫苗蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

為進一步驗證預測獲得的6種蛋白B/T表位的正確性，利用DNASTAR軟件的Protean程序?qū)Φ鞍锥壗Y(jié)構(gòu)進行預測，檢測獲得的蛋白B/T細胞表位區(qū)段是否處于易于蛋白產(chǎn)生抗體的暴露表面、無規(guī)則卷曲與轉(zhuǎn)角等位置。使用Protean程序，從蛋白的親水性、可柔性、表面可極性與抗原指數(shù)方面，預測的6種蛋白抗原性結(jié)果如圖1至圖6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)預測的6種蛋白抗原表位均處于抗原性較好的區(qū)段，支持預測的B/T細胞表位合理性。

表3 蛋白Th抗原表位預測Table 3 Th epitopes prediction for proteins

表4 蛋白CTL抗原表位預測Table 4 CTL epitopes prediction for proteins

圖1 金黃色葡萄球菌EbpS蛋白表位分子的抗原性分析Fig.1 Antigenicity analysis of S.aureus EbpS protein epitopesmolecular

圖2 金黃色葡萄球菌ClfA蛋白表位分子的抗原性分析Fig.2 Antigenicity analysis of S.aureus ClfA protein epitopesmolecular

圖3 大腸埃希菌OmpA蛋白表位分子的抗原性分析Fig.3 Antigenicity analysis of E.coli OmpA protein epitopesmolecular

圖4 大腸埃希菌OmpC蛋白表位分子的抗原性分析Fig.4 Antigenicity analysis of E.coli OmpC protein epitopesmolecular

2.4 重組串聯(lián)抗原表位的設(shè)計

將預測獲得的3種細菌的B/T細胞表位，分別進行拼接組合。每種細菌的2個蛋白表位，按照B細胞表位、CTL表位、Th表位順序進行編號，再通過Protean程序分析線性表位的各種排列方式，以重組的多表位間相對獨立，抗原性參數(shù)較好為標準；并且各多肽間接頭氨基酸采用4個甘氨酸（GGGG）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌Ebps與ClfA蛋白的預測表位排列方式為：epitope 4-epitope 6-epitope 8-epitope 3-epitope 2-epitope1-epitope 5-epitope 7；大腸埃希菌OmpA與OmpC蛋白的預測表位排列方式為：epitope 5-epitope 3-epitope 2-epitope 8-epitope 1-epitope 6-epitope 7-epitope 4；鏈球菌SIP與PGK蛋白的預測表位排列方式為：epitope 5-epitope3-epitope 2-epitope 6-epitope 4-epitope 1-epitope 7。再將3種菌各自預測完成的串聯(lián)表位進一步拼合，并采用Protean程序分析發(fā)現(xiàn)獲得抗原性參數(shù)較好的多肽序列（圖7）。至此，獲得的奶牛乳房炎候選蛋白表位多 肽 序 列 為： IRNGQQIVIGGGG KDDVKGGGGVVNQAVNTSGGGG GMAKVLLPLGGGG PEPIEDNDKHDTIKNAGGGG AGTIDDRQVESSHST EGGGGTGEATTTTTNQANTPAGGGGLLASIGSLGG GG ANAAEVYNKDGNKGGGGALDQLYSQLGGGGD TKSNVYGKNGGGGLSLLVPAGGGGFINNNGPGGGG PEFGGDTYGSDNFMQQGGGGGLRPSVAYLGGGGY LISKGIPAGGGGGVFENPGGGGVRTVAAPRVGGGG TYRAGDPGDHGKGGGGGSLAPVAADLGGGGKEE ADKEGKSLAPVAAGGGGASVAAETPAPVAKVAGG GG VVWNGPMGV（下劃線表示接頭氨基酸）。翻譯為核 酸序 列為：ATTAGAAACGGTCAACAAATCGTTATTGGTGGCGGTGGC AAAGATGATGTAAAAGGTGGCGGTGGC GTAGTTAATCAAGCG GTTAATACAAGTGGTGGCGGTGGC GGCATGGCC AAAGTATTGTTACCATTAGGTGGCGGTGGC CCAG AACCAATCGAAGACAATGATAAACACGATACTA TTAAAAATGCAGGTGGCGGTGGC GCTGGCACAA TAGATGATCGTCAAGTCGAATCATCACACAGTAC TGAAGGTGGCGGTGGC ACTGGTGAAGCTACTACT ACGACAACGAATCAAGCTAATACACCGGCAGGT GGCGGTGGCTTATTAGCATCAATAGGTTCATTA GGTGGCGGTGGC GCAAACGCTGCTGAAGTTTAC AATAAAGACGGCAACAAAGGTGGCGGTGGC GC TCTGGATCAGCTGTACAGCCAGCTGGGTGGCGG TGGC GACACTAAATCCAACGTTTATGGTAAAAA CGGTGGCGGTGGC CTGTCCCTCCTGGTCCCAGC TGGTGGCGGTGGC TTCATCAACAACAATGGCCC GGGTGGCGGTGGC CCAGAATTCGGTGGCGACAC CTACGGTTCTGACAACTTCATGCAGCAGGGTGG CGGTGGC GGTCTGCGTCCGTCTGTAGCATACCT GGGTGGCGGTGGC TACCTGATCTCCAAAGGTAT CCCGGCAGGTGGCGGTGGC GGTGTCTTTGAAAA CCCTGGTGGCGGTGGC GTAAGAACTGTAGCAGC CCCTAGAGTGGGTGGCGGTGGC ACATACCGTGC GGGAGATCCAGGTGATCATGGTAAAGGTGGTGG CGGTGGC TCACTTGCACCGGTAGCTGCTGATTTA GGTGGCGGTGGC AAAGAAGAAGCTGACAAAGA AGGAAAATCACTTGCACCGGTAGCTGCTGGTGGCGGTGGC GCTTCTGTTGCCGCTGAAACACCAGCT CCAGTAGCTAAAGTAGCAGGTGGCGGTGGC GTT GTATGGAACGGACCTATGGGTGTC（下劃線表示接頭氨基酸的核酸序列）。

圖5 鏈球菌SIP蛋白表位分子的抗原性分析Fig.5 Antigenicity analysis of Streptococcus SIP protein epitopesmolecular

圖6 鏈球菌PGK蛋白表位分子的抗原性分析Fig.6 Antigenicity analysis of Streptococcus PGK protein epitopesmolecular

圖7 重組多表位分子的抗原性分析Fig.7 Antigenicity analysis of recombinant multi-epitopes molecular

3 討論

生物信息學具有準確、簡便易行等特點，在蛋白結(jié)構(gòu)，尤其在表位疫苗的設(shè)計上受到人們重視，可極大地減少試驗的盲目性，為人為合成表位多肽疫苗奠定基礎(chǔ)［16-17］。奶牛乳房炎感染菌主要為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鏈球菌，這為利用生物信息學合成多聯(lián)表位疫苗提供可能。通過生物信息學，有實驗對金黃色葡萄球菌FnbpA-A基因進行表位設(shè)計［18］；并合成金黃色葡萄球菌蛋白的串聯(lián)抗原表位［19-20］。大腸埃希菌表位疫苗主要針對人類的致病大腸埃希菌開展了一些研究［21-22］，在奶牛乳房炎研究上尚未展開。鏈球菌表位疫苗主要進行了GapC蛋白［23］與Sao蛋白［24］的設(shè)計合成；在奶牛乳房炎鏈球菌研究上，布日額等將SIP和PGK的主要抗原區(qū)融合表達，獲得抗原性較高的融合蛋白［12-13］。因而，現(xiàn)行的試驗針對單個病原菌開展了一些表位疫苗的初步研究。本試驗利用生物信息學，對奶牛乳房炎三聯(lián)表位疫苗進行研究，獲得了三種致病菌蛋白的B/T細胞優(yōu)勢表位，組裝了各自的表位，最終設(shè)計獲得串聯(lián)表位多肽，填補三聯(lián)表位多肽研究的空白，有望進一步提高奶牛乳房炎的防治效果。而該多肽的免疫作用有待試驗檢測。

B細胞表位預測常見的方法為BepiPred和ABCpred。BepiPred主要利用氨基酸的性質(zhì)和隱形馬爾可夫模型預測線性表位［25］；ABCpred基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，準確率可高達65.9%［26］。前期，我們通過兩種方法的結(jié)合，對綠膿桿菌OprF蛋白、溶藻弧菌OmpU蛋白進行了B細胞表位預測［14-15］。本研究采用BepiPred和ABCpred聯(lián)合預測的方式進行B細胞表位預測。CTL（細胞毒性T淋巴細胞）表位預測采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法結(jié)合量化矩陣法［27］，在病毒、細菌蛋白CTL表位預測上獲得廣泛運用［14，28］。Th表位預測方法較為成熟，在病毒蛋白、細菌蛋白均實現(xiàn)很好的Th表位預測［15，27］。本試驗借助于這些成熟技術(shù)實現(xiàn)CTL、Th細胞表位的預測。

表位間的連接接頭分為柔性和剛性兩種，實現(xiàn)構(gòu)建的多肽各表位間相對獨立，具有一定的分子剛性［29］。常見的表位接頭氨基酸序列有GGGG、AAY、KK與GGGGS［29-31］等。本研究采用GGGG氨基酸接頭，通過DANMAN軟件對不同表位拼接方式進行優(yōu)化，最終預測獲得抗原性較好的重組多肽的氨基酸序列和翻譯的核苷酸序列。為下一步合成表位多肽疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責任編輯 盧福莊）

Epitope analysis of cow mastitis important vaccine candidate proteins and design of am ino acid sequence of trip le recombinant epitope vaccine

LIU Xiang1，KONG Zhi-xiang1，YIN Shu-ping2，OU Sha-sha1，LIU Cheng-yan1，TONG Han-hu1，WU San-qiao1，CHEN Chen1，CHEN Chun-lin1
（1.Chinese-German Joint Institute for Natural Product Research，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，China；2.Shaanxi Pharmaceutical Holding Group Co.，Ltd，Hanzhong 723000，China）

In order to design cow mastitis triple recombinant epitope polypeptide vaccine，six candidate vaccine proteins were selected，which were from three main pathogens of cowmastitis，concluding Ebps and ClfA of Staphylococcus aureus，OmpA and OmpC of Escherichia coli，SIP and PGK of Streptococcus.Using ABCpred and BepiPred prediction program，each protein had 2 B cell epitopes.CTL cell epitopes were obtained by the prediction method of quantitative matrix and artificial neural network，the results showed that the SIP protein had no CTL cell epitope，and there was 1 CTL cell epitope to other proteins.Th cell epitopes were gained using an online server prediction for MHC class Ⅱ peptide binding affinity，the results showed that each protein had 1 Th cell epitope.DNASTAR software was used to analyze the secondary structure for the six proteins，and the results showed that most of the B/T cellepitopes were located on the exposed surface，the random coil and the corner.The B/T cell epitopes were recomposed by DNASTAR Protean software，and triple epitope vaccine amino acid sequence holding better antigen was designed finally.These laid the foundation for the novel triple epitope vaccine of cow mastitis.

cow mastitis；epitope vaccine；antigenic analysis

S858.23；Q816

A

1004-1524（2016）09-1476-09

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.09.04

2015-12-22

國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510720556）；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項目（2016NY-088）；陜西理工大學校級科研項目（SLGKY16-13）

劉祥（1982—），男，安徽合肥人，博士，講師，研究方向為蛋白質(zhì)組學與免疫學。E-mail：liuxiang888525@163.com

浙江農(nóng)業(yè)學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28（9）：1476-1484 http://www.zjnyxb.cn劉祥，孔智翔，殷書平，等.奶牛乳房炎重要候選疫苗蛋白的抗原表位分析及三聯(lián)重組表位疫苗的氨基酸序列設(shè)計［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28（9）：1476-1484.