王靜，崔鳳杰，秦燕，賈俊濤，魏瑋，張慧敏

（1.威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東威海264205；2.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266500）

PMA與ddPCR結合檢測單核細胞增生李斯特氏菌

王靜1，崔鳳杰1，秦燕1，賈俊濤2，魏瑋1，張慧敏1

（1.威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東威海264205；2.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266500）

將疊氮溴化丙錠（PMA）與微滴數(shù)字PCR（ddPCR）技術相結合，檢測熱滅活背景下單核細胞增生李斯特氏菌活菌。結果表明，PMA終濃度為5.0 μg/mL、曝光時間為15 min時，可以有效抑制105CFU/mL的單核細胞增生李斯特氏菌死菌DNA的PCR擴增，不抑制單核細胞增生李斯特氏菌活菌DNA擴增的PMA最高濃度是10.0 μg/mL。利用PMA處理死活菌混合液時，PMA-ddPCR可以在死菌存在的條件下，定量檢測活菌，降低了“假陽性”結果的出現(xiàn)。檢測結果顯示：PMA-ddPCR靈敏度是2.0copy/20μL。利用PMA-ddPCR檢測人工污染的鱈魚樣品，最低可檢出102CFU/mL的單核細胞增生李斯特氏菌。結果證明PMA-ddPCR方法的精確度、穩(wěn)定性良好。

疊氮溴化丙錠；微滴式數(shù)字PCR；單核細胞增生李斯特氏菌；活菌

隨著社會的發(fā)展和人們對健康的關注，食品安全已經(jīng)成為影響深遠的社會性問題。然而，食品微生物引起的食源性疾病暴發(fā)事件層出不窮。單核細胞增生李斯特氏菌是一種常見的食源性致病菌，生命力很強，人感染后可導致腦膜炎、腸胃炎、敗血癥等［1-3］，嚴重危害人們身心健康。因此，定量檢測單核細胞增生李斯特氏菌引起各國的高度關注。

目前，檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法有很多，比如實時熒光聚合酶鏈式反應［4］、熒光染色［5］、免疫學方法［6］等，雖然這些方法相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)法有一些優(yōu)勢［7-8］，但是還存在一些無法克服的缺點，諸如操作繁瑣費時，靈敏度低，不能真實反映樣品的污染水平，出現(xiàn)“假陽性”的結果［9-10］等。因此，開發(fā)定量檢測活菌的方法是非常有必要的。疊氮溴化丙錠（PMA）是一種能和DNA共價交聯(lián)的光敏材料，光照可以使PMA的光敏基團轉(zhuǎn)化為氮賓自由基，其可以和DNA發(fā)生共價交聯(lián)，進而阻斷DNA分子的PCR擴增，并且PMA只能選擇性的滲透死菌的細胞膜，因此PMA和PCR技術相結合在定量檢測活菌方面有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?1-14］。

微滴數(shù)字PCR（ddPCR）是近年來發(fā)展起來的可以定量檢測DNA的新方法，通過PCR擴增和熒光信號的積累讀取陽性微滴數(shù)目［15-17］。本方法不需要核酸標準品，又兼具qPCR的優(yōu)勢。本文首次將PMA與ddPCR技術相結合，開發(fā)了高靈敏，高選擇性的檢測食源性致病菌的新方法。

1　材料與方法

1.1菌種

單核細胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes（ATCC19115）：美國Microbiologics公司。

1.2試劑與儀器

PMA：1 mg，美國Biotium公司，溶解于1.0 mL 20%的DMSO溶液，得到1 mg/mL儲備液，于-20℃避光保存；胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）、營養(yǎng)肉湯：北京陸橋；李斯特菌顯色培養(yǎng)基：法國科馬嘉；細菌基因組DNA提取試劑盒：北京Tiangen；引物、探針：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；熒光定量PCR反應體系有關試劑：購自羅氏公司；微滴式數(shù)字PCR反應體系有關試劑：購自美國伯樂公司。

QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)：美國伯樂公司；7900HT Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)：美國應用生物系統(tǒng)公司；CF16RXII高速冷凍離心機：日本日立公司；鹵鎢燈（500 W）：飛利浦燈具（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1細菌培養(yǎng)及熱滅活菌的制備

用接種環(huán)沾取甘油管保存的菌液，在胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

取105CFU/mL單核細胞增生李斯特氏菌于1.5 mL離心管中，80℃水浴10 min后冷卻至室溫，吸取1 mL涂布于科馬嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24 h觀察，未有菌落長出。

1.3.2最佳PMA濃度的選取

取500 μL熱滅活菌于1.5 mL離心管中，分別加入 PMA使其終濃度為0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 μg/mL，充分混勻后暗處孵育15 min，每隔5分鐘顛倒混勻，使PMA最大限度進入受損細胞內(nèi)。將離心管置于500 W鹵鎢燈下20 cm處曝光15 min（管口朝上，置于冰上），期間每隔5分鐘混勻，以使樣品溶液曝光均勻。隨后用試劑盒法提取基因組DNA，進行熒光定量PCR檢測。取500 μL單核細胞增生李斯特氏菌活菌作為對照組，處理同試驗組。

1.3.3最佳曝光時間的選取

取500 μL熱滅活菌于1.5 mL離心管中，加入終濃度5.0 μg/mL的PMA后暗處孵育15 min，置于鹵鎢燈下方20 cm處，分別曝光0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 min，隨后用試劑盒法提取基因組DNA，進行熒光定量PCR檢測。

1.3.4PMA-qPCR及PMA-ddPCR檢測

采取試劑盒法提取的基因組DNA利用7900HT Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)和QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)進行檢測。參考SN/T1870-2007《食品中致病菌檢測方法實時PCR法》合成引物。上游引物為（23 bp）：5′-CTGAATCTCAAGCAAAACGTGGT-3′，下游引物為（18 bp）：5′-CGCGACCGAAGCCAACTA-3′，探針（Pr）：5′-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTG GCTGG-TAMRA-3′。

PMA-qPCR反應體系（25.0 μL）：12.5 μL LightCy clerR480ProbesMaster；10 mmol/L上、下游引物各1.0 μL；10 mmol/L探針0.5 μL；模板DNA 2.0 μL；最后用DEPC水補充至25.0 μL。qPCR擴增條件為：95℃、3 min；94℃、5 s，60℃、40 s，40個循環(huán)，同時收集FAM熒光。

PMA-ddPCR反應體系（20.0 μL）：10.0 μL ddPCRTMSupermix for Probes（No dUTP）；10 mmol/L上、下游引物各1.0 μL；10 mmol/L探針0.5 μL；模板DNA 4.0 μL；最后用DEPC水補充至20.0 μL。ddPCR擴增循環(huán)條件為：95℃，5min；94℃、10s，60℃、45s，40個循環(huán)；98℃，10 min。

1.3.5qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測不同比例活、死菌混合液的比較

配制活菌比例為0%、10%、25%、50%、100%的單核細胞增生李斯特氏菌懸液，分別取500μL于1.5mL離心管中，qPCR組不加入PMA，PMA-qPCR、PMA-ddPCR組用PMA處理（終濃度為5.0 μg/mL，曝光15 min），按照試劑盒法提取基因組DNA，進行qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測。

1.3.6PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度

將1.7×106CFU/mL的單核細胞增生李斯特氏菌菌液10倍梯度稀釋，制得濃度為106、105、104、103、102、101CFU/mL的菌液，分別標記為L6～L1。在優(yōu)化條件下，進行PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測，分析靈敏度和線性關系。

1.3.7PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測人工污染鱈魚樣品中的單核細胞增生李斯特氏菌

取25 g新鮮鱈魚樣品，用均質(zhì)器制成鱈魚勻漿，人工污染10 CFU/mL～106CFU/mL的單核細胞增生李斯特氏菌活菌，同時加入105CFU/mL單李死菌，用PMA處理之后，在優(yōu)化條件下進行PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測。

2　結果與討論

2.1最佳PMA濃度的選擇

PMA濃度的優(yōu)化結果見圖1。

圖1　PMA濃度的優(yōu)化Fig.1　Optimization of PMA concentration

隨著PMA濃度的增大，死菌DNA qPCR擴增的CT值明顯升高，當PMA濃度超過5.0 μg/mL時，反應體系的CT值幾乎不再發(fā)生變化。）當PMA濃度超過10.0 μg/mL時，活菌DNA qPCR擴增的CT值略微高于不加PMA的對照組，可能高濃度PMA影響了活菌DNA的qPCR擴增。本研究選用5.0 μg/mL作為最佳濃度。

2.2最佳曝光時間的選擇

曝光時間的優(yōu)化見圖2。

圖2　曝光時間對PMA處理死細胞的影響Fig.2　Optimization of exposure time

隨著光照時間的增加，體系的循環(huán)數(shù)（CT值）迅速升高，光照時間超過15.0 min后，體系的CT值不發(fā)生明顯變化，本研究選取15.0 min作為最佳曝光時間。

2.3qPCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌的線性曲線

利用qPCR進行單核細胞增生李斯特氏菌的檢測。qPCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌的線性曲線見圖3。

圖3　單核細胞增生李斯特氏菌qPCR標準曲線Fig.3　Standard curve of qPCR

CT值與單核細胞增生李斯特氏菌的濃度在102CFU/mL～108CFU/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系（R=0.998 5），其線性回歸方程為：y=44.01-3.38x，方程中y代表DNA qPCR擴增的CT值，x代表單核細胞增生李斯特氏菌的濃度對數(shù)值。

2.4qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測不同比例活菌的比較

對活菌比例為0%、10%、25%、50%、100%的單核細胞增生李斯特氏菌菌液進行qPCR、PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測，見圖4。

圖4　對不同比例活死菌混合液的檢測Fig.4　Detection of different proportion of living dead bacteria mixture

如圖4所示，不論活菌比例如何變化，qPCR檢測結果為活菌與滅活菌的總量；當活菌比例0%時，PMA-qPCR、PMA-ddPCR未檢出單核細胞增生李斯特氏菌，說明PMA抑制了熱滅活菌的DNA擴增，避免了假陽性；隨著活菌比例的增加，PMA-qPCR和PMA-ddPCR測得濃度值隨之升高，但是PMA-ddPCR檢出結果與平板計數(shù)結果更加靠近，由于PMA-ddPCR把樣本分成上萬個微滴，增加了檢測結果的準確度。

2.5PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度

圖5　PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度Fig.5　Sensitivity of Listeria monocytogenes by PMA-ddPCR and PMA-qPCR detection

將1.7×106CFU/mL的單核細胞增生李斯特氏菌菌液10倍梯度稀釋，分別標記為L6～L1，進行PMA-ddPCR、PMA-qPCR檢測。PMA-ddPCR所有反應生成的微滴數(shù)目均大于10 000（圖5A），表明所有反應微滴生成正常，保證了后續(xù)定量分析的準確性。從一維散點圖（圖5B）上可以看出L1至L6生成的陽性微滴數(shù)分布，陽性微滴數(shù)目隨著濃度的升高而逐漸增多。此外，陰性對照（NTC）中沒有檢測到陽性微滴，可見該體系中沒有污染或非特異性擴增，PMA-ddPCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌有良好的特異性。PMA-ddPCR靈敏度是2copy/20μL，并在2copy/20μL～1.99×104copy/ 20 μL呈良好的線性（R=0.999 1）（圖5C）。PMA-qPCR最少可檢出102CFU/mL的單核細胞增生李斯特氏菌（圖5D），將L1～L6測得CT值代入2.3標準曲線計算濃度值作圖，PMA-qPCR線性相關系數(shù)R=0.996 8。PMA-ddPCR線性優(yōu)于PMA-qPCR。

2.6PMA-ddPCR檢測人工污染樣品中單核細胞增生李斯特氏菌

在熱滅活菌存在的情況下，對不同污染程度的鱈魚樣品進行PMA-qPCR、PMA-ddPCR檢測，如圖6所示。

圖6　檢測人工污染樣本中單核細胞增生李斯特氏菌Fig.6　Detection of Listeria monocytogenes in artificial pollution test samples

PMA-ddPCR檢測人工染菌鱈魚樣品，最低可檢出102CFU/mL的單核細胞增生李斯特氏菌，且與理論添加值基本吻合。當染菌量≤103CFU/mL時，PMA-qPCR測得值與理論添加值偏差較大。PMA-ddPCR檢測低濃度染菌樣品時優(yōu)于PMA-qPCR。PMA-ddPCR對樣品檢測的RSD均小于5.0%，精確度、穩(wěn)定性良好。

3　結論

PMA與ddPCR相結合的方法，可以在熱滅活菌存在的條件下定量檢測單核細胞增生李斯特氏菌活菌，消除了“假陽性”結果的出現(xiàn)，PMA-ddPCR方法整個過程不足2 h，成功檢測鱈魚樣品中單核細胞增生李斯特氏菌活菌的含量。與PMA-qPCR方法相比，具有靈敏度高，檢測限底，精密度高等優(yōu)點。PMA-ddPCR方法具有巨大的發(fā)展空間，有望應用于其他樣品的檢測。

［1］李婧妲，郭慧琴，高曉強，等.免疫磁珠捕獲PCR快速檢測單核細胞增生李斯特氏菌［J］.食品科學，2015，36（12）：226-230

［2］劉書花，魏云波，林小靜，等.食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測方法研究進展［J］.食品科學，2010，19：327-328

［3］張加林，楊林嫻.單增李斯特菌的食源性污染狀況及檢測方法［J］.醫(yī)學理論與實踐，2012，25（8）：910-911

［4］Master C I，Shallcross J A，Mackey B M，et al.Effect of stress treatments on the detection of Listeria monocytogenes and enterotoxigenic Escherichia coli by the polymerase chain reaction［J］.J Appl Biomater，1994，77（1）：73-79

［5］丁建英，韓劍眾.食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測方法研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（12）：171-174

［6］林濤，劉真真，楊雪嬌，等.全自動熒光酶免疫分析儀-國標法檢測水產(chǎn)品中單核細胞增生李斯特氏菌的研究［J］.hinese Journal of Heahh Laboratory Technology，2008，18（4）：655-658

［7］Aricind A，Bhagwat A A.Simultaneous detection of Escherichiacoli O157：H7，Listeria monocytogenes and Salmonella strains by realtime PCR［J］.Int J Food Microbiol，2003，84（2）：217-224

［8］Malorny B，Bunge C，Helmuth R.A real-time PCR for the detection of Salmonella enteritidis in poultry meat and consumption eggs［J］.J Microbiol Meth，2007，70（2）：245-251

［9］SEO K H，Valentin-Bon I E，Brackett R E.Detection and enumeration of Salmonella enteritidis in homemade ice cream associated with outbreak：comparison of conventional and real-time PCR methods［J］.Journal of Food Protection，2006，69（3）：639-643

［10］WHYTE P，GILL K M，COLLINS J，et al.The prevalence and PCR detection of Salmonella contamination in raw poultry［J］.Vet Microbiol，2002，89（1）：53-60

［11］Nocker A，Sossa-Fernandez P，Burr M D，et al.Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73（16）：5111-5117

［12］Cawthorn D M，Witthuhn R C.Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide［J］.J Appl Microbiol，2008，105（4）：1178-1185

［13］Nocker A，Cheung C Y，Camper A K，Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells［J］.J Microbiol Methods，2006，67（2）：310-320

［14］Forghani F，Langaee T，Eskandari M，et al.Rapid detection of viable Bacillus cereus emetic and enterotoxic strains in food by coupling propidium monoazide and multiplex PCR（PMA-mPCR）［J］.Food Control，2015，55：151-157

［15］Morisset D，Stebih D，Milavec M，et al.Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR［J］.PLoS One，2013，8（5）：62583-62588

［16］George D，Czech J，John B，et al.Detection and quantification of chimerism by droplet digital PCR［J］.Chimerism，2013，4（3）：102-108

［17］Beck J，Bierau S，Balzer S，et al.Digital droplet PCR for rapid quantification of donor DNA in the circulation of transplant recipients as a potential universal biomarker of graft injury［J］.Clin Chem，2013，59（12）：1732-1741

Detection of Live Listeria monocytogenes by PMA-ddPCR

WANG Jing1，CUI Feng-jie1，QIN Yan1，JIA Jun-tao2，WEI Wei1，ZHANG Hui-min1
（1.Inspection and Quarantine Technology Center of Weihai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Weihai 264205，Shandong，China；2.Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao
266500，Shandong，China）

A method to detect living cells of Listeria monocytogenes was developed based on propidium monoazide（PMA）and ddPCR.The optimization of experimental parameters showed that a final PMA concentration of 5.0 μg/mL and exposure of 15 min could restrain DNA amplification of 105CFU/mL dead cells，and the maximum PMA against DNA amplification from live Listeria monocytogenes cells was 10.0 μg/mL.Only live Listeria monocytogenes cells was detected by PMA-ddPCR even in the existence of dead Listeria monocytogenes.The detection limit was 2.0 copy/20 μL.PMA-ddPCR could detect 102CFU/mL Listeria monocytogenes in the codfish polluted by manual work.Furthermore，PMA-ddPCR showed better accuracy and stability.

propidium monoazide；ddPCR；Listeria monocytogenes；live cells

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.026

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2014IK114）

王靜（1975—），女（漢），高級工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測。

2015-10-01