孫曼怡

·論著·

糖尿病結(jié)腸動力障礙大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞凋亡和間隙連接蛋白43的表達

孫曼怡

目的探討糖尿病結(jié)腸動力障礙大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞(ICC)的凋亡及ICC的間隙連接蛋白43(Cx43)表達的變化在結(jié)腸動力障礙發(fā)生中的意義。方法雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，根據(jù)體質(zhì)量及血糖按隨機數(shù)字表法分為正常6周組、正常10周組、糖尿病6周組、糖尿病10周組，每組9只。腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，檢測體質(zhì)量、空腹血糖及胃腸推進率； HE染色觀察ICC；TUNEL法檢測ICC的凋亡指數(shù)；免疫組化檢測ICC的c-Kit、Cx43蛋白表達。結(jié)果(1)糖尿病組較同時間點正常組體質(zhì)量下降，空腹血糖升高，胃腸推進率降低， ICC的c-Kit、Cx43蛋白表達降低(F=76.68,1 397.24,18.87,137.65,87.73,P均<0.05)。(2)糖尿病10周組較糖尿病6周組空腹血糖升高，胃腸推進率降低， ICC的c-Kit、Cx43蛋白表達降低(F=76.68,1 397.24,18.87,137.65,87.73,P均<0.05)。(3)糖尿病組ICC的凋亡指數(shù)與同時間點正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義；糖尿病10周組與糖尿病 6周組ICC的凋亡指數(shù)差異也無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結(jié)論ICC數(shù)量減少、Cx43蛋白表達降低可能是糖尿病結(jié)腸動力障礙的發(fā)生機制之一，且上述改變隨病程發(fā)展而加重；ICC數(shù)量減少可能與ICC凋亡無關(guān)。

Cajal間質(zhì)細胞；細胞凋亡；間隙連接蛋白43；糖尿病

結(jié)腸動力障礙是糖尿病的常見并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚不清楚[1]。結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞(ICC)是胃腸運動的起搏細胞，可調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌運動[2]。本實驗以糖尿病大鼠為研究對象，采用TUNEL法和免疫組化檢測ICC的凋亡和間隙連接蛋白43(Cx43)的表達情況，以探討其與糖尿病結(jié)腸動力障礙的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物分組和糖尿病模型建立 清潔級健康雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(許可證號：SCXK-軍2007-004，批號：0024045) 45只，體質(zhì)量230～270 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，造模前按體質(zhì)量根據(jù)隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為正常組18只和造模組27只。造模組大鼠禁食12 h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌素40 mg/kg 1次，72 h后尾靜脈采血，測得血糖≥16.7 mmol/L且能維持1周以上者為造模成功；正常組給予等量0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液注射。共25只大鼠造模成功，在造模成功大鼠中按照血糖值隨機抽取18只，分為糖尿病6周組和糖尿病10周組。正常組進一步分為正常6周組和正常10周組，每組9只。所有進入實驗的大鼠每周尾靜脈采血，以拜安捷血糖儀測空腹血糖。正常組和糖尿病組分別于造模成功后第6周、第10周處死。

1.1.2 主要試劑 細胞凋亡測試盒購自美國Roche公司，兔抗大鼠c-Kit多克隆抗體購自美國Santa cruz公司，兔抗大鼠Cx43多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 胃腸推進率測定 各組大鼠處死前予100 g/L活性炭(10 ml/kg)灌胃，30 min后處死，取出全胃腸道，計算無張力下胃腸推進率(胃腸推進率=活性炭前端至幽門括約肌的距離/幽門括約肌至肛門距離×100%)。

1.2.2 TUNEL檢測ICC凋亡 石蠟切片于60℃烤60 min，充分融蠟；常規(guī)二甲苯脫蠟；梯度乙醇脫苯，0.01% PBS內(nèi)浸泡2次；3% H2O2/甲醇中浸泡15 min；將細胞通透液0.1% TritonX-100滴加于樣本上，孵育8 min，PBS浸洗2次；另取3 U/ml DNase孵育陽性對照片10 min；配制TUNEL反應(yīng)混合物：50 μl酶溶液 +450 μl標記液=500 μl TUNEL反應(yīng)混合物，離心混勻；切片在PBS中洗2次，擦干樣品周圍區(qū)域，樣本切片和陽性對照片各加50 μl TUNEL反應(yīng)混合物，陰性對照片加50 μl標記液(不加入酶溶液)，放入暗濕化盒，37℃孵育60 min，PBS中洗3次；加1滴PBS在熒光顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)光波長450～500 nm，檢測波范圍515～565 nm(綠色)；擦干標本周圍區(qū)域，加 50 μl Converter-POD，37℃下在無光濕化盒內(nèi)孵育 30 min，PBS浸洗3次；DAB顯色，光學顯微鏡下觀察并適時放入純水中涮洗終止反應(yīng)；蘇木素復染；1%鹽酸乙醇液分化 20 s，自來水充分沖洗10 min；1%碳酸鋰 20 s，自來水洗5 min；梯度乙醇浸泡各3 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡各5 min；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 免疫組化檢測ICC的c-Kit、Cx43表達 對切片進行常規(guī)脫蠟，PBS浸泡；將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐中火加熱5 min，冷卻至室溫，PBS沖洗；3 %H2O2室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗；滴加1∶25兔抗大鼠c-Kit、Cx43多克隆抗體，濕盒孵育，4℃過夜，PBS沖洗；滴加HRP標記山羊抗兔二抗，37℃恒溫箱孵育30 min，PBS沖洗；滴加DAB，室溫顯色，鏡下控制顯色時間，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)；蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡觀察。采用Image Pro-Plus 6.0圖像分析軟件分析處理所有標本免疫組織化學圖像。每張切片在200×鏡下觀察，以積分吸光度(IA)為指標進行圖像分析。

1.2.4 HE染色觀察ICC 對切片進行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯；移入蘇木素中染色，自來水沖洗后移入伊紅液中染色；梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡；中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 糖尿病組較同時間點正常組

表1 各組體質(zhì)量、空腹血糖和胃腸推進率比較

注：與正常6周組相比，aP<0.01； 與同時間點正常組相比，bP<0.01；與糖尿病 6周組相比，cP<0.05

體質(zhì)量下降、空腹血糖升高、胃腸推進率降低(P均<0.01)；糖尿病10周組較糖尿病 6周組空腹血糖升高、胃腸推進率降低(P均<0.05)，見表1。

2.2 ICC的HE染色 ICC分布于環(huán)行肌細胞之間、環(huán)行肌層的內(nèi)表面及環(huán)行肌層與縱行肌層之間，往往與神經(jīng)纖維末梢及神經(jīng)束伴隨存在，并由許多縫隙連接緊密連接在一起(圖1，封3)。

2.3 ICC的TUNEL染色 測定的凋亡指數(shù)，正常6周組為2.64±0.48，正常10周組為2.60±0.50，糖尿病6周組為2.74±0.38，糖尿病10周組為2.62±0.41(F=0.18，P=0.91)。糖尿病組與同時間點正常組ICC的凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。糖尿病10周組與糖尿病6周組ICC的凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。正常6周組與正常10周組ICC的凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2，圖2(封3)。

注：A.正常6周組；B.正常10周組；C.糖尿病 6周組；D.糖尿病10周組；箭頭所指系DAB顯色后凋亡的ICC；ICC：Cajal間質(zhì)細胞圖2 各組ICC 的TUNEL染色 (200×)

2.4 ICC的c-Kit和Cx43表達 c-Kit受體是ICC的特異性標記物，細胞質(zhì)染色呈棕色者判定為c-Kit陽性細胞，檢測c-Kit的表達可用來衡量ICC的數(shù)量。Cx43在ICC胞體和細胞突起上表達，其免疫組化陽性染色呈棕黃色。

糖尿病組較同時間點正常組ICC的c-Kit和Cx43免疫組化IOD值降低，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。糖尿病10周組較糖尿病6周組ICC的c-Kit和Cx43免疫組化IOD值降低，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。正常6周組與正常10周組ICC的c-Kit和Cx43免疫組化IOD值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表2，圖3(封3)。

注：A.正常6周組；B.正常10周組；C.糖尿病 6周組；D.糖尿病10周組；ICC：Cajal間質(zhì)細胞；Cx43：間隙連接蛋白43圖3 各組ICC的Cx43免疫組化染色(400×)

表2 各組ICC的c-Kit和Cx43免疫組化染色IOD值比較

注：與同時間點正常組相比，aP<0.01；與糖尿病6周組相比，bP<0.01；Cx43：間隙連接蛋白43

3 討論

糖尿病結(jié)腸動力障礙以腹脹和便秘為特征，其病理生理特點為結(jié)腸張力和收縮力降低，蠕動減慢，排空延遲[3]。既往對糖尿病胃腸功能障礙發(fā)病機制的研究多集中于自主神經(jīng)病變、高血糖、激素分泌異常等[4-5]。但這些因素不能完全解釋其發(fā)病機制，近年來ICC、胰島素樣生長因子、干細胞因子等在糖尿病胃腸功能紊亂發(fā)病機制中的作用逐漸得到重視[6-8]。ICC以網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)分布于消化道腸神經(jīng)末梢和平滑肌之間，具有兩大主要功能即作為胃腸道運動的起搏點和作為腸神經(jīng)系統(tǒng)控制胃腸平滑肌細胞運動的中介，該細胞產(chǎn)生慢波并在時間、空間上控制胃腸道的收縮活動。本實驗結(jié)果顯示糖尿病結(jié)腸動力障礙大鼠的ICC數(shù)量明顯減少，說明其作為結(jié)腸運動的起搏細胞和作為神經(jīng)細胞控制肌細胞運動的中介功能顯著減弱，導致腸道運動和吸收功能下降從而引起相應(yīng)的癥狀，這一點和既往相關(guān)研究結(jié)果一致。細胞凋亡是指細胞在分化和發(fā)育過程中由基因調(diào)控而發(fā)生的主動的、自發(fā)性的死亡方式，可以被多種生理、病理性刺激誘發(fā)，是細胞對所處環(huán)境中某些特定信息的一種應(yīng)答反應(yīng)。大量研究證實細胞凋亡參與了糖尿病多種并發(fā)癥的發(fā)生[9]。但本實驗發(fā)現(xiàn)模型大鼠ICC的凋亡與正常大鼠相比無顯著差異，提示模型大鼠ICC數(shù)量的減少可能與細胞凋亡無關(guān)。既往文獻報導c-Kit信號是ICC表型發(fā)育的必要因素，缺乏此信號ICC會轉(zhuǎn)化為平滑肌表型細胞。本實驗結(jié)果顯示模型大鼠ICC的c-Kit表達降低，由此推測減少的ICC可能轉(zhuǎn)化為平滑肌細胞。

間隙連接是細胞間主要通訊方式之一，其蛋白成分稱為連接蛋白，與神經(jīng)細胞及平滑肌細胞之間具有豐富的間隙連接是ICC的顯著結(jié)構(gòu)特點[10]。Cx43是最重要的間隙連接蛋白[11]。以Cx43為基礎(chǔ)構(gòu)成的間隙連接是ICC的重要功能型間隙連接通道，是胃腸運動功能活動整合協(xié)調(diào)的主要結(jié)構(gòu)之一，擴布的動作電位在間隙連接通道進行整合，從而刺激或抑制平滑肌細胞收縮。吳漢妮等[12]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病胃輕癱大鼠胃ICC的Cx43表達減少，提示其可能促使胃腸運動障礙的發(fā)生及發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示糖尿病結(jié)腸動力障礙大鼠ICC的Cx43表達降低，由此推測可能存在ICC之間信息及信號轉(zhuǎn)導失控，進而影響ICC介導的慢波傳播和神經(jīng)肌肉信號轉(zhuǎn)導引起結(jié)腸動力障礙。

另外，本實驗結(jié)果還顯示ICC數(shù)量減少和Cx43蛋白表達下降與糖尿病的病程相關(guān)，有隨病程進展而改變愈加明顯的趨勢，同時糖尿病10周組大鼠比糖尿病6周組的胃腸推進率進一步下降，由此推測，ICC異常改變可能是糖尿病結(jié)腸動力障礙的發(fā)病機制之一，同時也為該病的預防和治療提供理論依據(jù)。

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Apoptosisandconnexin43expressionincolonicinterstitialcellsofCajalindiabeticratswithcolonicdysmotility

SunManyi.

DepartmentofGastroenterology,TianjinUnionMedicineCentre,Tianjin300121,China

SunManyi,Email:cdj68000@sina.com

ObjectiveTo investigate the apoptosis and expression of connexin 43 (Cx43) of colonic interstitial cells of Cajal (ICC) in diabetic rats with colonic dysmotility, and explore their value in the development of colonic dysmotility.MethodsThirty-six male Sprague-Dawley(SD) rats were divided into 4 groups which included normal 6 weeks group, normal 10 weeks group, diabetes mellitus (DM) 6 weeks group and DM 10 weeks group (n=9) by random digital table method according to weight and fasting blood glucose (FBG). DM was induced by streptozotocin. Weight, FBG and gastrointestinal transit rate were detected. HE staining was used to examined ICC. TUNEL was used to detect apoptosis index (AI) of ICC. Immunohistochemistry was used to detect the protein expressions of c-Kit and Cx43 of ICC.Results(1)Compared with normal group, level of FBG was higher, while weight, gastrointestinal transit rate,protein expressions of c-Kit and Cx43 of ICC were lower in DM group(F=76.68,1 397.24,18.87,137.65,87.73, allP<0.05).(2)Compared with DM 6 weeks group, level of FBG was higher, while weight, gastrointestinal transit rate, protein expressions of c-Kit and Cx43 of ICC were lower in DM 10 weeks group(F=76.68,1 397.24,18.87,137.65,87.73, allP<0.05).(3)There was no difference between AI of ICC in DM group and normal group, and so was between DM 10 weeks group and DM 6 weeks group(allP>0.05).ConclusionsDecrease of ICC and less expression of Cx43 maybe one of the mechanisms of diabetic colonic dysmotility, and the changes above become more significant with the development of disease. Decrease of ICC may be not associated with the apoptosis of ICC.

Interstitial cells of Cajal; Apoptosis; Connexin 43; Diabetes mellitus

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.03.05

300121 天津市人民醫(yī)院消化科

孫曼怡，Email:cdj68000@sina.com

2015-09-10)