葉用甜菜染色體制片條件優(yōu)化及核型分析

孫 勃，田玉肖，夏 雪，李夢嬌，羅玲玲，李 琳，陳 清，張 芬，湯浩茹

(四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130)

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葉用甜菜染色體制片條件優(yōu)化及核型分析

孫 勃，田玉肖，夏 雪，李夢嬌，羅玲玲，李 琳，陳 清，張 芬，湯浩茹*

(四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130)

以葉用甜菜綠梗品種為材料，對影響染色體制片效果的解離時間、預(yù)處理時間和取材時間等條件進行優(yōu)化，并進行核型分析。結(jié)果表明，1 mol·L-1HCl 60 ℃解離12 min，染色體著色良好而且細胞質(zhì)透明，對比度高；0.002 mol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理9 h染色體收縮性最好，形態(tài)最佳，分散性好；上午9：00取材，分裂相細胞和中期分裂相細胞最多。葉用甜菜的染色體數(shù)目為2n=2x=18，核型公式為2n=2x=18=16m+2sm(2SAT)，染色體長度比為1.52，染色體相對長度組成為8M2+10M1，染色體相對長度變化范圍為8.75%～13.29%，著絲粒指數(shù)變化范圍為36.67%～47.04%，臂比值變化范圍為1.13～1.73，其中，第2對染色體為近中部著絲粒染色體(sm)，且具有隨體，其余均為中部著絲粒染色體(m)，核型不對稱系數(shù)為58.50%，核型分類標準屬1A型。同時，該研究還比較了葉用甜菜與已報道的糖用甜菜的核型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者在核型公式、核型分類、隨體和核型不對稱系數(shù)等方面存在明顯差異。研究結(jié)果從細胞遺傳學角度揭示葉用甜菜的核型特征，為今后進行不同類型葉用甜菜的核型比較提供理論依據(jù)。

葉用甜菜；染色體；制片優(yōu)化；核型分析

葉用甜菜(BetavulgarisL. var.ciclaL.)為藜科(Chenopodiaceae)甜菜屬(Beta)甜菜種的變種[1]，別名牛皮菜、莙荙菜、厚皮菜等，原產(chǎn)歐洲地中海沿岸，我國葉用甜菜主要分布于西南地區(qū)及長江黃河部分流域。葉用甜菜易于栽培，產(chǎn)量高并稍耐暑熱，是我國西南地區(qū)夏季常見的食用葉菜，鮮嫩多汁，適口性好。葉用甜菜葉片富含還原糖、粗蛋白、纖維素等營養(yǎng)成分及維生素C、鉀、鐵等微量元素[2]，現(xiàn)代藥理學研究還表明，葉用甜菜萃取物具有降血壓、降血糖和抗氧化活性等保健功效[3]。

核型分析是一種重要的細胞學研究手段，廣泛地應(yīng)用于物種發(fā)育進化及物種間親緣關(guān)系的研究[4-5]。陳瑞陽等[6]報道了同為甜菜屬的糖用甜菜的核型，發(fā)現(xiàn)其同時具有2倍體、3倍體和4倍體。但迄今為止，關(guān)于葉用甜菜的核型尚未見報道。本試驗以葉用甜菜綠梗品種為材料，首先對其染色體制片的關(guān)鍵步驟進行條件優(yōu)化，之后采用最佳制片條件進行葉用甜菜的核型分析，并與已報道的糖用甜菜核型結(jié)果進行比較，從細胞遺傳學角度揭示葉用甜菜的核型特征，也為今后進行不同類型葉用甜菜的核型比較提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試葉用甜菜為產(chǎn)自甘肅的綠梗品種中農(nóng)。

1.2 試驗方法

本試驗以葉用甜菜綠梗品種的根尖為材料，于2015年6月—9月在四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院遺傳育種實驗室進行。挑選籽粒飽滿的葉用甜菜種子4 ℃條件下保存4 d，之后放入鋪有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，25 ℃/16 h和18 ℃/8 h交替進行。4 d后當主根長度至10～15 mm時，以每30 min為1個時間間隔，于上午8：00—11：00剪取根尖，以確定最適的取材時間(預(yù)處理9 h，解離12 min)；4 ℃條件下以0.002 mol·L-18-羥基喹啉溶液分別預(yù)處理1、3、6、9、12和15 h，以確定最優(yōu)預(yù)處理時間(上午9：00取材，解離12 min)。將預(yù)處理好的材料置于V(冰醋酸)∶V(無水乙醇)=1∶3的卡諾固定液4 ℃固定24 h，之后分別用95%、85%和75%的乙醇溶液梯度洗脫，最后保存在75%的乙醇溶液中。解離采用酸解法，將保存好的根尖用1 mol·L-1HCl 60 ℃分別解離1、4、8、12、16和20 min，以確定最優(yōu)解離時間(上午9：00取材，預(yù)處理9 h)。之后用蒸餾水清洗3次，切取葉用甜菜根尖分生區(qū)部分于載玻片上，卡寶品紅染液染色5～10 min，常規(guī)壓片后鏡檢，將裝片中染色體形態(tài)及分散良好的中期分裂相細胞在Olympus CX21光學顯微鏡100倍油鏡下觀察并拍照。

染色體計數(shù)選取30個染色體數(shù)目清晰的中期分裂相細胞進行，核型分析采用李懋學等[4]提出的標準，確定著絲粒位置，根據(jù)染色體的大小和形態(tài)特征對染色體核型進行配對分析，染色體的相對長度、臂比及類型按照Levan等[7]的命名法則計算，著絲粒指數(shù)和染色體相對長度系數(shù)參照李懋學等[4]的標準計算，核型不對稱系數(shù)采用Arano[8]的方法計算，核型類型按照Stebbins[9]的標準劃分。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體制片條件的優(yōu)化

2.1.1 解離時間對制片效果的影響

對不同解離時間對葉用甜菜染色體制片效果的影響進行了分析，各處理統(tǒng)一在上午9：00取材，預(yù)處理9 h。由圖1可知，60 ℃ 1 mol·L-1HCl解離1和4 min，解離不夠充分，細胞內(nèi)部的染色體不易分散，根尖外部的細胞染色體和細胞質(zhì)均著色較深，對比度低，內(nèi)部的細胞由于接觸不到染液而無法著色，導(dǎo)致不易進行染色體觀察和分析(圖1-A、B)；解離8和12 min，細胞較為分散，染色體著色良好且細胞質(zhì)趨于透明，對比度高(圖1-C、D)，相比之下，解離12 min效果最佳(圖1-D)；解離16和20 min，解離程度逐漸過度，不僅細胞質(zhì)不易著色，而且細胞中的染色體也不易著色，從而導(dǎo)致染色體顏色太淺，不利于進行后續(xù)的觀察和分析(圖1-E、F)。綜上可知，12 min為最佳解離時間。

A—F分別表示解離時間1、4、8、12、16、20 min。標尺代表10 μm，下圖同A-F represent 1， 4， 8， 12， 16， 20 min of dissociation times used， respectively. The scale plate represents 10 μm， and the same as the figures below圖1 不同解離時間處理的葉用甜菜染色體圖 (×1 000)Fig.1 Chromosomes of leaf beet under different dissociation times (×1 000)

2.1.2 預(yù)處理時間對制片效果的影響

不同預(yù)處理時間對葉用甜菜染色體制片效果存在明顯影響，所有處理均在上午9：00取材，解離時間均為12 min。結(jié)果如圖2所示，預(yù)處理1和3 h，染色體細長，固縮程度明顯不足，同時染色體分散性差，且拖尾現(xiàn)象嚴重(圖2-A、B)；預(yù)處理6 h染色體分散程度和固縮程度均有所改善，但拖尾現(xiàn)象仍存在，結(jié)果不夠理想(圖2-C)；預(yù)處理9 h，染色體分散性較好，同時收縮性最好，形態(tài)最佳，均呈現(xiàn)X型，著絲粒清晰可見(圖2-D)；預(yù)處理12和15 h，染色體分散性好，但大部分染色體固縮加重，部分染色體甚至固縮過度呈點狀，已不適合用于核型分析(圖2-E、F)。綜上，預(yù)處理9 h的染色體最適合用于葉用甜菜染色體的核型分析。

A—F分別表示預(yù)處理時間1、3、6、9、12、15 hA-F represent 1， 3， 6， 9， 12， 15 h of pretreatment times used， respectively圖2 不同預(yù)處理時間處理的葉用甜菜染色體圖(×1 000)Fig.2 Chromosomes of leaf beet under different pretreatment times (×1 000)

2.1.3 取材時間對分裂相細胞數(shù)的影響

取材時間對葉用甜菜染色體制片也存在明顯影響。由圖3可見，不同取材時間，分裂相細胞百分比和中期分裂相細胞百分比存在顯著差異。上午9：00取材的處理分裂相細胞百分比最高，達到38.5%，其次是9：30和10：00，三者間無顯著性差異；而上午8：00取材的處理分裂相細胞百分比最低，僅為15.8%。而中期分裂相細胞百分比統(tǒng)計結(jié)果仍以上午9：00比例最高，為6.2%，顯著高于其他各處理。綜合分裂相和中期分裂相細胞統(tǒng)計結(jié)果可知，上午9：00取材的處理分裂相和中期分裂相細胞最多，最易篩選出分散良好的染色體分裂相。因此，上午9：00是葉用甜菜染色體制片的最佳取材時間，后續(xù)的研究也采用該時間作為取材時間。

柱狀圖上無相同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義Values without the same lower letters indicate significant difference at the level of 0.05圖3 葉用甜菜不同取材時間分裂相細胞和中期分裂相細胞的百分比Fig.3 The percentage of cells at the mitotic and metaphase stage in leaf beet under different sampling time points

2.2 核型分析

選擇30個染色體分散良好的細胞進行觀察計數(shù)，結(jié)果表明，所有細胞的染色體均為18條，占計數(shù)細胞的100%，所以葉用甜菜的染色體數(shù)目為2n=2x=18。圖4顯示葉用甜菜各染色體清晰可見，均呈X型，且著絲粒明顯，其中，2條染色體具有隨體。核型分析的結(jié)果見表1，葉用甜菜染色體相對長度變化范圍為8.75%～13.29%；染色體相對長度系數(shù)變化范圍為0.79～1.20，其染色體相對長度組成為8M2+10M1；著絲粒指數(shù)變化范圍為36.67%～47.04%，臂比值變化范圍為1.13～1.73，其中，第2對染色體為近中部著絲粒染色體(sm)，其余8對為中部著絲粒染色體(m)，隨體位于第2對染色體上。核型公式為2n=2x=18=16m+2sm(2SAT)，染色體長度比為1.52，沒有臂比值大于2∶1的染色體，根據(jù)Stebbins的核型分類標準，葉用甜菜的核型屬1A型，核型不對稱系數(shù)為58.50%。其核型模式圖如圖5所示。

數(shù)字1—9為染色體編號The numbers 1-9 represent chromosome No.圖4 葉用甜菜根尖染色體中期分裂相與核型圖(×1 000)Fig.4 Metaphase chromosomes and karyotype of leaf beet root tips (×1 000)

表1 葉用甜菜染色體核型參數(shù)

Table 1 Karyotype parameters of leaf beet chromosomes

染色體編號ChromosomeNo.相對長度Relativelength/%短臂Shortarm長臂Longarm全長Totallength相對長度系數(shù)Indexofrelativelength著絲粒指數(shù)Centromereindex/%臂比值A(chǔ)rmra-tio類型Type15.347.9513.291.2040.191.49m2*4.577.8912.461.1236.671.73sm35.456.8012.241.1044.491.25m45.576.2711.841.0747.041.13m54.746.2611.000.9943.091.32m64.046.2510.290.9339.281.55m74.235.9610.190.9241.511.41m83.916.029.930.8939.401.54m93.655.108.750.7941.701.40m

*表示染色體帶有隨體，隨體長度未計算在內(nèi)；m，中部著絲粒染色體；sm，近中部著絲粒染色體。

* means the chromosomes with satellites， and the length of satellites is not included in the chromosome length. m means the metacentric chromosome， and sm means the submetacentric chromosome.

圖5 葉用甜菜染色體核型模式圖Fig.5 Chromosome idiogram of leaf beet

3 討論

很多蔬菜的染色體屬小染色體型，且相鄰染色體形態(tài)又非常相似[10-11]，因此，本試驗首先針對解離時間、預(yù)處理時間和取材時間等因素進行了條件優(yōu)化，確定了葉用甜菜的最佳染色體制片條件。解離是影響染色體制片效果的一項重要因素，其主要目的是軟化和分解部分細胞壁，同時清除部分細胞質(zhì)，使細胞質(zhì)背景透明化，便于染色體的觀察。本試驗發(fā)現(xiàn)，解離時間過短，解離不夠充分，根尖外部的細胞染色體和細胞質(zhì)均著色較深，對比度低，而內(nèi)部的細胞由于接觸不到染液而較難著色，壓片時細胞不易分散，細胞染色體和細胞質(zhì)著色對比度低，不易觀察；解離時間過長，染色體和細胞質(zhì)均不易著色，這也與前人的研究結(jié)果基本一致[12-13]。預(yù)處理是植物染色體制片過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它的主要作用是獲得更多的中期分裂相細胞，同時改變細胞質(zhì)的黏度，促使染色體收縮與分散。預(yù)處理對制片效果的影響主要表現(xiàn)在處理試劑和處理時間兩方面[14]。本試驗中選取的試劑是0.002 mol·L-18-羥基喹啉溶液，8-羥基喹啉處理能使染色體、縊痕和次縊痕清晰，顯示效果良好[13]。不同蔬菜品種的預(yù)處理時間也存在明顯差異，如青花菜、芥藍等甘藍類蔬菜的最優(yōu)預(yù)處理為8-羥基喹啉處理2.0～2.5 h[10-11，15]，而本試驗結(jié)果表明，葉用甜菜預(yù)處理9 h效果最佳。此外，取材時間能夠顯著影響分裂相細胞，特別是中期分裂相細胞的比例，一般植物分裂期的高峰多出現(xiàn)在上午，取材時間也多設(shè)在上午，以獲得更多的分裂相[13，16-18]，如百里香在上午9：00取材最佳[13]，黃瓜在上午8：40—9：10取材最佳[16]。恒溫條件下，根尖長度不同會導(dǎo)致分裂相比例不同，如25 ℃恒溫暗培養(yǎng)條件下青花菜根尖長度13～15 mm時分裂相最多。本試驗中采用25 ℃/18 ℃變溫培養(yǎng)條件，樣品選取時兼顧根尖長度因素，將根尖長度范圍限制在10～15 mm，最終結(jié)果表明，葉用甜菜的最佳取材時間為上午9：00，與黃瓜和百里香等植物的最佳取材時間基本相同。

陳瑞陽等[6]報道了甜菜屬3種糖用甜菜的核型結(jié)果，本試驗將葉用甜菜與糖用甜菜的核型差異進行了比較(表2)。結(jié)果表明，葉用甜菜與糖用甜菜在核型公式、核型分類、隨體、臂比值、著絲粒指數(shù)范圍和核型不對稱系數(shù)等多個方面存在明顯差異，這些差異可能與倍性及種間差異有關(guān)。首先，這3種報道的糖用甜菜，其倍性分別為2倍體、3倍體和4倍體，且隨著倍性的增加，其臂比值范圍、著絲粒指數(shù)范圍和相對長度范圍等范圍逐漸擴大，平均臂比值、臂指數(shù)、核型不對稱系數(shù)等也逐漸增加。同時，2倍體糖用甜菜與3倍體和4倍體間也存在較大差異，如2倍體中僅有中部著絲粒染色體(m)，而3倍體和4倍體中均出現(xiàn)了近中部著絲粒染色體(sm)；核型分類也隨倍性增加呈現(xiàn)從1A、2A和2B的從原始向進化過渡的趨勢[19]；2倍體中未見隨體出現(xiàn)，3倍體和4倍體中均有，且都出現(xiàn)在4號染色體上；2倍體中未見臂比>2的染色體，3倍體和4倍體中均有1/9的染色體臂比>2。本試驗中，葉用甜菜染色體數(shù)目18條，為2倍體。通常同一種的隨體數(shù)量和位置是相對穩(wěn)定的，但同一種的不同變種、不同類型及不同品種間其隨體的數(shù)目、位置和形態(tài)等可能存在不同程度的變異[5，10]。與2倍體糖用甜菜不同，本試驗中的葉用甜菜存在1對隨體，且隨體出現(xiàn)在2號染色體上，這也與3倍體和4倍體糖用甜菜隨體位置不同。同時，葉用甜菜中也出現(xiàn)了sm型染色體，這也是2倍體糖用甜菜中未見到的，而葉用甜菜平均臂比值和核型不對稱系數(shù)也明顯高于3種糖用甜菜，但核型分類、臂指數(shù)、相對長度范圍和著絲粒指數(shù)范圍在葉用甜菜和2倍體糖用甜菜間相同或相似。綜上可知，糖用甜菜隨倍性的增加，逐漸從原始向進化過渡，而葉用甜菜的核型結(jié)果表明，葉用甜菜較2倍體糖用甜菜進化水平更高。

表2 葉用甜菜與已報道的糖用甜菜[6]核型差異比較

Table 2 The differences of chromosome karyotype between leaf beet and reported sugar beet

項目Index葉用甜菜Leafbeet糖用甜菜aSugarbeeta糖用甜菜bSugarbeetb糖用甜菜cSugarbeetc染色體數(shù)目Chromosomenumbers2n=2x=182n=2x=182n=3x=272n=4x=36核型公式Karyotypeformula16m+2sm(2SAT)18m(2SAT)24m(3SAT)+3sm28m(4SAT)+8sm核型分類Karyotypetype1A1A2A2B隨體個數(shù)Satellitenumbers2034隨體所在染色體序號Satellitesposition2—44相對長度范圍Rangeofrelativelength/%8.75～13.297.96～13.048.52～13.187.37～15.38臂比值范圍Rangeofarmratio1.13～1.731.09～1.641.06～2.261.08～2.35平均臂比值A(chǔ)veragearmratio1.421.241.391.46臂比>2的染色體比例Chromosomeratioofarmratio>2000.110.11臂指數(shù)Armindex36365472著絲粒指數(shù)范圍Rangeofcentromericindex36.67～47.0438.15～47.8030.82～48.4629.97～49.17核型不對稱系數(shù)As.K/%58.5054.8957.3158.02

“—”表示沒有隨體。

“—” indicated no satellite in chromosomes.

本試驗對綠梗葉用甜菜的染色體制片條件進行了優(yōu)化，1 mol·L-1HCl 60 ℃解離最佳時間為12 min，0.002 mol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理最佳時間為9 h，取材最佳時間為上午9：00，條件優(yōu)化結(jié)果為葉用甜菜的核型分析、原位雜交及分子標記等研究提供了基礎(chǔ)。本試驗還揭示了葉用甜菜的核型特征，并與已報道的糖用甜菜核型進行比較，豐富了人們對葉用甜菜遺傳組成的認知，為其分類地位、種的進化、種內(nèi)親緣關(guān)系、遺傳多樣性研究及育種工作提供了參考。

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(責任編輯 侯春曉)

Optimization of chromosome preparation and karyotype analysis of leaf beet

SUN Bo， TIAN Yu-xiao， XIA Xue， LI Meng-jiao， LUO Ling-ling， LI Lin， CHEN Qing， ZHANG Fen， TANG Hao-ru*

(CollegeofHorticulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

In the present study， the green-stalk leaf beet cultivar was used as plant material， chromosome staining factors including dissociation duration， pretreatment and sampling time point were optimized， and karyotype characteristics were also investigated. The results showed that the best chromosome staining and cytoplasm transparency as well as the highest contrast were observed at 12 min dissociation; The best contraction， shape and dispersion of chromosomes were found at 9 h pretreatment with 0.002 mol·L-18-hydroxyquinoline; The percentage of the mitotic cells and metaphase cells reached maximum when sampled at 9：00 A.M.. Leaf beet had a total of 18 chromosomes. The karyotype formula was 2n=2x=18=16m+2sm (2SAT)， the ratio of chromosome length (L/S) was 1.52， and the constitution of the relative length was 8M2+10M1. The relative lengths ranged from 8.75% to 13.29%， the centromeric index ranged from 36.67% to 47.04%， and arm ratio ranked from 1.13 to 1.73. Moreover， the second pair of chromosomes， which own two satellites (SAT)， was submetacentric chromosomes (sm)， while other eight pairs of them were metacentric chromosomes (m). Karyotype asymmetry index (As.K) was 58.50%， and karyotype characteristics fell into type 1A according to Stebbins classification criteria. Meanwhile， the obtained results were compared with those from the already reported sugar beet so as to reveal the karyotype differences between the two， and the significant differences were found on karyotype formula， karyotype characteristics， satellites and As.K. In conclusion， the results revealed the karyotype characteristic of leaf beet， and provided a theoretical basis for karyotype comparison among different types of leaf beet.

leaf beet; chromosome; preparation optimization; karyotype analysis

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.11

2016-01-22

四川省教育廳重點項目(14ZA0016)；四川省省級大學生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(201510626060)；四川農(nóng)業(yè)大學本科質(zhì)量工程項目(04051946)；四川農(nóng)業(yè)大學本科論文培育計劃項目(06309007)；四川農(nóng)業(yè)大學本科教學改革研究項目(X2015020)

孫勃(1983—)，男，山西孝義人，博士，副教授，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail: 14099@sicau.edu.cn

*通信作者，湯浩茹，E-mail: htang@sicau.edu.cn

S636

A

1004-1524(2016)10-1704-07

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1704-1710

孫勃，田玉肖，夏雪， 等. 葉用甜菜染色體制片條件優(yōu)化及核型分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報， 2016， 28(10): 1704-1710.