縫隙連接蛋白43對人非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞吉非替尼獲得性耐藥機制的初步研究

駱 敏, 羅燕妹, 覃貴慧,滕翠芳,王翰林,陽 潔

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1. 藥學(xué)院藥理學(xué)教研室、2.臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021)

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◇論 著◇

縫隙連接蛋白43對人非小細(xì)胞肺癌HCC827細(xì)胞吉非替尼獲得性耐藥機制的初步研究

駱 敏1, 羅燕妹1, 覃貴慧1,滕翠芳1,王翰林2,陽 潔1

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1. 藥學(xué)院藥理學(xué)教研室、2.臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021)

目的 探討縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞產(chǎn)生吉非替尼(Gefitinib)獲得性耐藥的關(guān)系。方法 在Gefitinib敏感細(xì)胞株HCC827上，通過逐步遞增Gefitinib濃度誘導(dǎo)獲得Gefitinib耐藥細(xì)胞株HCC827 GR；MTT法檢測Gefitinib對HCC827/GR細(xì)胞的IC50；RT-PCR檢測Cx43的mRNA水平；Western blot檢測Cx43和磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平；parachute熒光示蹤法檢測細(xì)胞縫隙連接功能(gap junction intercellular communication, GJIC)；免疫熒光技術(shù)檢測Cx43的細(xì)胞定位。結(jié)果 Gefitinib作用于HCC827和HCC827 GR的IC50分別為(0.07±0.019) μmol·L-1、(10.84±0.021) μmol·L-1(P<0.01)；HCC827 GR中Cx43的mRNA和蛋白水平較HCC827明顯降低(P<0.05)，但p-Akt蛋白水平明顯升高(P<0.05)。在HCC827 GR細(xì)胞上加PI3K的特異性抑制劑LY294002(25 μmol·L-1, 24 h)后，p-Akt蛋白水平明顯下降(P<0.01)，且Cx43的蛋白水平明顯升高(P<0.01)。HCC827及HCC827 GR均未檢測到GJIC，用GJIC增強劑RA(retinoic acid)處理(10 μmol·L-1, 24 h)上述細(xì)胞，亦未檢測到熒光傳遞，免疫熒光結(jié)果顯示Cx43表達(dá)在細(xì)胞胞質(zhì)。結(jié)論 胞質(zhì)中Cx43的下調(diào)可能促進(jìn)NSCLC細(xì)胞對Gefitinib的獲得性耐藥，其機制可能與Cx43非GJIC依賴的PI3K/Akt信號通路激活有關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；縫隙連接蛋白43；吉非替尼；獲得性耐藥；PI3K/Akt；縫隙連接功能

吉非替尼(易瑞沙)是目前臨床最常用的一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)，適用于既往接受過化療或不適于手術(shù)的晚期或轉(zhuǎn)移性的非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者，但幾乎所有對吉非替尼治療有效的患者在一定時間的緩解期后會出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)的現(xiàn)象[1]，其機制尚不明確。

縫隙連接蛋白(connexins，Cxs)是一個多基因家族表達(dá)的保守蛋白，其組成的縫隙連接通信 (gap junction intercellular communication，GJIC)能連接溝通相鄰細(xì)胞胞質(zhì)直接傳遞電、化學(xué)及代謝物質(zhì)，調(diào)控同步細(xì)胞活動、細(xì)胞增殖與凋亡、器官發(fā)育等[2]，尤其與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)，Cxs能獨立于GJIC在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。目前已知，Cxs有21個亞型，它們的表達(dá)具有一定的組織特異性，正常肺組織主要表達(dá)Cx26、Cx43[4]。最近我們的研究發(fā)現(xiàn)[5]，Cx26在吉非替尼耐藥細(xì)胞HCC827 GR中明顯升高，并且不依賴于GJIC，Cx26可與PI3K/Akt相互激活，從而誘導(dǎo)了NSCLC細(xì)胞EMT的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC對吉非替尼的耐藥性。非常有趣的是，另一個在肺部分布的重要Cx亞型Cx43，在HCC827 GR中的表達(dá)明顯降低，表現(xiàn)出與Cx26相反的變化。故本研究擬探索Cx43對NSCLC吉非替尼獲得性耐藥的影響，以闡明Cx43在NSCLC中吉非替尼獲得性耐藥的作用及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC細(xì)胞系HCC827購自美國ATCC；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購自美國Gibco公司；吉非替尼(易瑞沙)購自英國AstraZeneca公司；MTT、嘌呤霉素、蛋白質(zhì)提取試劑及鼠抗人Cx43多克隆抗體購自美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Tiangen公司；兔抗人Cx43單克隆抗體購自Santa Cruz公司；兔抗人β-actin多克隆抗體、羊抗兔二抗、驢抗兔熒光二抗購自英國Abcam公司；兔抗人單克隆抗體Akt、兔抗人單克隆抗體 p-Akt(Ser473)購自美國CST公司；羊抗鼠二抗購自美國KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 人NSCLC細(xì)胞HCC827培養(yǎng)、構(gòu)建吉非替尼誘導(dǎo)耐藥株HCC827 GR 人NSCLC細(xì)胞HCC827、HCC827 GR用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。在人NSCLC吉非替尼敏感細(xì)胞株HCC827的培養(yǎng)基中，按0.01、0.05、0.10、0.50、1.0 μmol·L-1濃度梯度逐步增加吉非替尼濃度，使用濃度為1.0 μmol·L-1的吉非替尼維持細(xì)胞耐藥性，以構(gòu)建吉非替尼誘導(dǎo)耐藥株HCC827 GR。

1.2.2 MTT法檢測吉非替尼對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×108·L-1的密度接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔。吉非替尼以0.01、0.10、1.00、10.0、100.0 μmol·L-1濃度作用細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)96 h后，每孔加入0.5 mg·L-1的噻唑藍(lán)20 μL，4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在波長570 nm處檢測各孔吸光值(OD)，以吉非替尼濃度為橫坐標(biāo)，OD570 nm為縱坐標(biāo)，繪制曲線，求出IC50。

1.2.3 RT-PCR檢測細(xì)胞系中Cx43的表達(dá)情況 按照試劑說明書，從HCC827、HCC827 GR細(xì)胞提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR檢測Cx43的mRNA表達(dá)水平。擴增Cx43及GAPDH的上游引物和下游引物分別為：5′-AGGAGTTCAATCACTTGGCG-3′(sense)和5′-GCAGGATTCGGAAAATGAAA-3′ (antisense)、5′-AGCCACATCGCTCAGACA-3′(sense)和5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′ (antisense)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min; 94 ℃ 45 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。用2-ΔΔCt法計算各組的mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測細(xì)胞系中Cx43和p-Akt的表達(dá)水平 根據(jù)我們之前報道過的方法[6]，收集各組細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷的RIPA裂解液(含1%PMSF)冰上裂解5 min，4 ℃、12 000×g離心30 min，取蛋白上清，用BCA蛋白定量試劑盒按照說明書嚴(yán)格操作，測定各組細(xì)胞株蛋白樣品濃度。將蛋白樣品20 μg經(jīng)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到NC膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶(TBST稀釋)室溫封閉1 h后，分別加入鼠抗人Cx43多克隆抗體(1 ∶500)、兔抗人Akt單克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗人p-Akt單克隆抗體(1 ∶1 000)，4 ℃過夜，兔抗人β-actin (1 ∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌后，分別加入羊抗鼠二抗(1 ∶7 500)、羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，PBST洗滌后，Bio Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并以β-actin為內(nèi)參對各細(xì)胞株Cx43及以Akt為內(nèi)參對p-Akt條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 Parachute熒光示蹤法檢測細(xì)胞GJIC 根據(jù)我們之前報道的方法[7]，將各組細(xì)胞分別與熒光指示劑calcine-AM共同孵育，使calcine-AM進(jìn)入細(xì)胞，該細(xì)胞稱為“供體細(xì)胞”(donor cells)。再將donor cells接種到已生長融合至80%的相應(yīng)組HCC827、HCC827 GR細(xì)胞(接受細(xì)胞，receiver cells)上，培養(yǎng)4 h。用GJ功能增強劑RA 10 μmol·L-1處理[8]相應(yīng)組HCC827、HCC827 GR細(xì)胞，24 h后用PBS洗滌3次，將細(xì)胞分別與熒光指示劑calcine-AM共同孵育，并接種到相應(yīng)的細(xì)胞上。待形成穩(wěn)定的GJ后，小分子的calcine(發(fā)綠色熒光)就能通過GJ進(jìn)入相鄰的receiver cells。用熒光顯微鏡觀察、計數(shù)1個donor cell周圍含有calcine的receiver cell數(shù)目，作為GJ功能的指標(biāo)。

1.2.6 免疫熒光法檢測Cx43在細(xì)胞中的蛋白定位 根據(jù)我們之前報道的方法[5]，將細(xì)胞接種在蓋玻片上24 h后，冰甲醇固定10 min，2%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，經(jīng)兔抗人Cx43多克隆抗體(1 ∶50，PBS稀釋)4 ℃孵育過夜后，用驢抗兔熒光二抗(1 ∶200，PBS稀釋)于室溫孵育1 h，接著用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染。激光共聚焦掃描熒光顯微鏡(Nikon A1, Tokyo, Japan)采集成像，并用NIS-Elements軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建人NSCLC吉非替尼誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株HCC827 GR 從細(xì)胞株的表型特點可以看出，通過吉非替尼誘導(dǎo)，HCC827細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，表現(xiàn)為由典型的上皮鵝卵石樣變成散在的、細(xì)長的成纖維細(xì)胞樣外形。MTT實驗結(jié)果顯示，HCC827的IC50值為(0.07±0.019) μmol·L-1(<1.0 μmol·L-1)，HCC827 GR的IC50值為(10.84±0.021) μmol·L-1(>10 μmol·L-1)。上述結(jié)果表明，吉非替尼誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株HCC827 GR已成功構(gòu)建(Fig 1)。

2.2 RT-PCR和Western blot檢測Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)水平 RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，HCC827 GR細(xì)胞中Cx43的mRNA表達(dá)量明顯低于HCC827細(xì)胞(P<0.05)，并且Western blot結(jié)果顯示，HCC827 GR細(xì)胞中的Cx43蛋白表達(dá)量也較HCC827細(xì)胞明顯降低(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 1 Construction of gefitinib induced resistant HCC827 GR cells ±s,n=5)

A: The morphology of HCC827 and HCC827 GR cells; B: The gefitinib cytotoxicity in HCC827 and HCC827 GR cells.*P<0.05,**P<0.01vsparental group

2.3 Western blot檢測p-Akt、Akt的蛋白表達(dá)水平及加抑制劑LY294002后p-Akt、Cx43的蛋白表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞HCC827相比，HCC827 GR細(xì)胞中的p-Akt蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。在HCC827 GR細(xì)胞上加PI3K的特異性抑制劑LY294002(25 μmol·L-1, 24 h)后，p-Akt蛋白水平明顯下降(P<0.01)，且Cx43的蛋白水平明顯升高(P<0.01)(Fig 3)。

2.4 Parachute熒光示蹤法檢測GJIC 為研究NSCLC細(xì)胞中Cx43組成的GJIC是否與吉非替尼獲得性耐藥有關(guān)，我們用parachute法檢測了HCC827、HCC827 GR的GJ功能。如Fig 4所示，以肺癌細(xì)胞NCI-H460作為陽性對照，在HCC827及HCC827 GR細(xì)胞中均未檢測到熒光傳遞。為排除是否有難以檢測到的GJIC存在，我們進(jìn)一步用GJIC增強劑RA處理(10 μmol·L-1，24 h)上述細(xì)胞，亦未檢測到熒光傳遞。這些結(jié)果表明，HCC827、HCC827 GR細(xì)胞中GJIC均缺失。

2.5 免疫熒光法檢測Cx43 蛋白定位 如Fig 5所示，綠色熒光為Cx43蛋白，藍(lán)色熒光為DAPI染色的細(xì)胞核，Cx43在HCC827及HCC827 GR細(xì)胞中均主要表達(dá)在胞質(zhì)，用GJIC增強劑RA處理(10 μmol·L-1，24 h)后，Cx43仍主要表達(dá)在2種細(xì)胞的胞質(zhì)。

3 討論

肺癌是發(fā)病率、死亡率均居全球及我國第一位的惡性腫瘤。肺癌絕大多數(shù)起源于支氣管黏膜上皮，80%為NSCLC。NSCLC早期診斷率極低，大多數(shù)患者確診時已屬晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療的機會，需要化學(xué)藥物治療[9]。目前，臨床常用于NSCLC的藥物吉非替尼是第一個用于NSCLC治療的分子靶向藥物。目前已知，NSCLC患者對吉非替尼獲得性耐藥的主要機制有EGFR T790M突變(50%)[10]和MET擴增(20%)[11]，但仍有約30%的NSCLC患者獲得性耐藥機制未知。因此，探索NSCLC對吉非替尼獲得性耐藥的機制對提高EGFR-TKIs臨床療效，改善NSCLC患者預(yù)后有重要意義。

大量研究表明，Cx及其組成的GJ在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有密切的關(guān)系，大多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，常伴隨著Cx表達(dá)及GJ功能的降低或缺失[12]，如Cx32、Cx43蛋白在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及GJIC的明顯降低可能與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[13]。長期以來，Cxs被認(rèn)為是通過建立GJIC來增強腫瘤藥物的敏感性。例如，Cx26蛋白的上調(diào)可以增強吉西他濱抗胰腺癌的療效，且依賴于GJIC的功能[14]；另一方面，GJIC功能的增強能夠增強順鉑的細(xì)胞毒性作用[15]。然而，近年來一些研究表明，Cxs能夠不依賴GJIC促進(jìn)腫瘤化療耐藥。例如，Cx43可獨立于GJIC，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的耐藥性[16]；Cx43可促進(jìn)惡性間皮瘤對順鉑的耐藥性，而與其GJIC無關(guān)[17]。我們最近的研究也發(fā)現(xiàn)，Cx26可獨立于GJIC，與PI3K/Akt相互激活，從而誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)NSCLC吉非替尼耐藥[5]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與親本細(xì)胞HCC827相比，Cx43在HCC827 GR中的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，并且在親本細(xì)胞HCC827和耐藥細(xì)胞HCC827 GR中GJIC均缺失，Cx43蛋白均主要定位在胞質(zhì)。這提示HCC827 GR細(xì)胞胞質(zhì)中Cx43表達(dá)的下調(diào)可能與促進(jìn)NSCLC吉非替尼的獲得性耐藥有關(guān)，并且GJIC不參與該過程。

最近研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路在EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥性中也發(fā)揮重要作用[18]。PI3K/Akt通路的激活和HCC細(xì)胞發(fā)生EMT，從而對順鉑產(chǎn)生耐藥有關(guān)[19]；在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，PI3K/Akt通路的激活能夠使細(xì)胞對吉非替尼產(chǎn)生抗性[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在HCC827 GR中Cx43蛋白減少的同時，p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在HCC827 GR細(xì)胞上加PI3K特異性抑制劑后，能夠明顯抑制p-Akt蛋白的表達(dá)，且能夠明顯升高Cx43蛋白的表達(dá)。結(jié)合上述文獻(xiàn)報道，我們推測，Cx43本身可能獨立于GJIC，與PI3K/Akt之間形成負(fù)性調(diào)控，從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的獲得性耐藥。但胞質(zhì)中Cx43與PI3K/Akt之間的相互調(diào)控，還需進(jìn)一步的深入研究。

A: The expression of Cx43 was detected in HCC827 and HCC827 GR cells through RT-PCR; B: The expression of Cx43 was detected in HCC827 and HCC827 GR cells through Western blot.*P<0.05vsparental group

Fig 3 The protein expressions of p-Akt (A) and

*P<0.05,**P<0.01vsparental group

綜上所述，我們初步發(fā)現(xiàn)了Cx43在NSCLC吉非替尼獲得性耐藥中的作用及可能的分子機制，即Cx43是抑制NSCLC吉非替尼耐藥的一個重要因素。這一發(fā)現(xiàn)將為深入了解Cx家族在腫瘤化療耐藥中的作用，以及尋找克服NSCLC分子靶向藥物耐藥的靶點，提供新的理論依據(jù)。

Fig 4 GJIC in NCI-H460 as positive control was confirmed

Functional GJIC was detected by parachute assay and no detectable GJIC was found in HCC827 and HCC827 GR cells. No enhancement of GJIC in these cells incubated with 10 μmol·L-1of RA (a well-defined GJIC enhancer) for 24 h. Top: fluorescence images. Bottom: overlaid the corresponding phase-contrast images.Original magnification,×200

Fig 5 Immunofluorescence staining of cellular localization of Cx43 with or without RA treatment

(致謝：感謝廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心提供的實驗條件和技術(shù)支持！)

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Effect of Cx43 on acquired gefitinib-resistance mechanisms in human NSCLC HCC827 cells

LUO-Min1, LUO Yan-mei1, QIN Gui-hui1, TENG Cui-fang1, WANG Han-lin2, YANG-Jie1

(1.DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,2.SchoolofClinicalMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Aim To explore the effect of connexin 43 (Cx43) on acquired gefitinib-resistance in human non small cell lung cancer(NSCLC). Methods HCC827 GR, a gefitinib-resistant (GR) NSCLC cell lines from their parental cells was established by gradually increasing the concentration of gefitinib. Gefitinib efficacy in HCC827 and HCC827 GR cells was detected by MTT assay. Expression of Cx43 mRNA in HCC827 and HCC827 GR cells was determined by RT-PCR. The protein expressions of Cx43 and phospho-Akt (p-Akt) in these cells were detected by Western blot. The functional gap junction intercellular communication(GJIC)was measured by parachute assay. The cellular localization of Cx43 protein was evaluated by immunofluorescence staining. Results MTT assay showed less gefitinib cytotoxicity in HCC827 GR cells than that in their parental cells with IC50of (10.84±0.021) μmol·L-1versus (0.07±0.019) μmol·L-1, respectively. Moreover, both mRNA and protein expressions of Cx43 in HCC827 GR cells were significantly lower than those in HCC827 cells (P<0.05). However, the p-Akt protein in HCC827 GR cells was obviously higher than that in HCC827 cells (P<0.05). Furthermore, treatment with LY294002 caused a significant reduced p-Akt expression, but a significant increased Cx43 expression in HCC827 GR cells. Moreover, no detectable GJIC was found in HCC827 and their GR cells with or without RA (a well-defined GJIC enhancer) treatment. Immunofluorescence staining clearly showed that Cx43 protein accumulated in the cytoplasm of HCC827 and their GR cells. Conclusion The down-regulation of Cx43 expression in cytoplasm of HCC827 GR cells may contribute to the acquired gefitinib resistance in NSCLC cells by GJIC-independent activation of PI3K/Akt signaling pathway.

NSCLC; Cx43; gefitinib; acquired resistance; PI3K/Akt signaling pathway; GJIC

2016-07-01，

2016-07-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81260324)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金新教師類資助項目(No 20124503120008)

駱 敏(1990-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥；E-mail: 83822984@qq.com；

陽 潔(1978-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 0771-5350258, Fax: 0771-5354506，E-mail: yanglz2005@126.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.014.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.007

A

1001-1978(2016)11-1510-07

R329.25；R341；R734.202.2；R977.6