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      大豆中不同除草劑作用靶標(biāo)酶的miRNA前體克

      2016-11-28 01:47:40陶波劉洋李向勇金龍國(guó)邱麗娟
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年9期
      關(guān)鍵詞:內(nèi)含子文庫(kù)前體

      陶波+劉洋+李向勇+金龍國(guó)+邱麗娟

      摘要:對(duì)前人已預(yù)測(cè)的大豆miRNA的4個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、克隆miRNA前體,先將設(shè)計(jì)好的接頭與大豆小RNA的3′末端連接,然后利用與接頭序列互補(bǔ)的引物對(duì)小RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,即可得到加接頭的第1鏈cDNA,再用基因特異引物GSP和通用接頭引物的組合,經(jīng)PCR擴(kuò)增后即可捕獲位于已知序列區(qū)和接頭之間的3′端RNA序列。結(jié)合3′端引物的測(cè)序結(jié)果,初步預(yù)測(cè)成熟miRNA可能的6個(gè)組合是同一家族。

      關(guān)鍵詞:miRNA;EPSPS(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶);基因序列;草甘膦;克隆

      中圖分類號(hào): S482.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

      文章編號(hào):1002-1302(2016)09-0024-04

      草甘膦是一類具有特異性,且能有效抑制葉綠體酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的除草劑[1-2]。對(duì)EPSPS作用的草甘膦能阻斷莽草酸酯途徑,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與EPSPS結(jié)合,形成穩(wěn)定的三元絡(luò)合物,從而阻斷PEP與3-磷酸莽草酸(S3P)反應(yīng)生成EPSPS,最終阻止芳香族氨基酸的生物合成,抑制芳香族氨基酸的生成,導(dǎo)致植物死亡[3-4]。

      microRNA(miRNA)是指真核生物中長(zhǎng)度約為21~25 nt的小型內(nèi)源的非編碼單鏈RNA家族。microRNA是Lee等于1993年在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的。此后,大量的microRNA在植物和動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)和克隆[5],到目前為止,植物中發(fā)現(xiàn)的microRNA分子已逾200種[6]。microRNA是近年來(lái)非編碼RNA研究的熱點(diǎn)。它們?cè)诮M織發(fā)育和細(xì)胞分化的特定階段表達(dá),可以在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)許多基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用[7]。miRNA通過(guò)2種途徑發(fā)揮其作用:(1)miRNA與靶mRNA序列不完全互補(bǔ),它主要通過(guò)與靶mRNA的不完全互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)而阻抑mRNA的翻譯過(guò)程,這種途徑對(duì)mRNA的穩(wěn)定性無(wú)任何影響,屬于翻譯水平基因調(diào)節(jié);(2)miRNA與靶mRNA序列完全互補(bǔ),它可以通過(guò)與小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)類似的途徑與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)而降解靶mRNA,屬于轉(zhuǎn)錄后水平基因調(diào)節(jié)[8]。

      在各類小分子RNA中,miRNA具有最廣泛的基因調(diào)節(jié)功能[9],內(nèi)含子miRNA具有反向調(diào)節(jié)其宿主基因的功能[10-11],可能有以下幾種情況:(1)當(dāng)宿主基因是內(nèi)含子miRNA的靶基因時(shí),內(nèi)含子miRNA直接下調(diào)宿主基因的表達(dá),抑制其功能的發(fā)揮,這是直接作用。譬如,內(nèi)含子miR-204被預(yù)測(cè)可直接靶向其宿主基因[WTBX][STBX]TRPM3[WTBZ][STBZ][12]。(2)內(nèi)含子miRNA還可以通過(guò)下調(diào)促進(jìn)宿主基因功能的靶基因,從而拮抗宿主基因的功能。目前還未見(jiàn)有這方面的試驗(yàn)證據(jù),但不能否定這種情況存在的可能性。文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)含子miR-25的可能靶基因是[WTBX][STBX]FHL2[WTBZ][STBZ]基因,而FHL2蛋白則通過(guò)與宿主基因編碼的蛋白MCM7相互作用從而促進(jìn)其功能[13]。因此,我們推測(cè)內(nèi)含子miR-25有可能有反向調(diào)節(jié)宿主基因[WTBX][STBX]FHL2[WTBZ][STBZ]的功能,當(dāng)然這還有待今后進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。擬南芥中的miR160通過(guò)負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(auxin response factors)ARF10和ARF16的表達(dá)而控制根冠細(xì)胞的形成[14]。玉米中的GL15活性增高不僅使幼年期葉片增多,而且延緩生殖發(fā)育,而miR172對(duì)GL15mRNA水平進(jìn)行負(fù)調(diào)控,從而促進(jìn)玉米幼葉向成熟葉片轉(zhuǎn)變[15]。賈小云等發(fā)現(xiàn),miR828可以通過(guò)靶向SlMyb7-like負(fù)調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而負(fù)調(diào)控番茄植株中花青素的生物合成[2]。這些都表明植物中miRNA具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[16]。

      本研究對(duì)前人預(yù)測(cè)的除草劑作用靶標(biāo)酶的大豆miRNA的4個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),克隆miRNA前體,從而進(jìn)一步研究它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育中的生物學(xué)意義和分子水平上的調(diào)節(jié)機(jī)制,而且還可以有目的、有計(jì)劃地利用它們進(jìn)行植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和生理結(jié)構(gòu)的改造,使植物更大限度地表現(xiàn)出對(duì)人類研究有利的性狀,從而為人類生產(chǎn)生活造福。

      1 材料與方法

      1.1 供試材料

      大豆基因組EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/;RNA-fold predict:http://frontend.bioinfo.rpi.edu/zukerm/home.html;Mipred confirm:http://www.bioinf.seu.edu.cn。

      1.2 試驗(yàn)方法

      利用生物信息學(xué)方法,對(duì)不同除草劑作用靶標(biāo)酶EST序列進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)。通過(guò)RNA-fold predict軟件對(duì)原始EST序列預(yù)測(cè),初步得到12個(gè)microRNA二級(jí)結(jié)構(gòu),利用Mipred confirm(http://www.bioinf.seu.edu.cn)進(jìn)一步篩選,共篩選到4個(gè)miRNA前體,其中2個(gè)EPSP合成酶、1個(gè)谷氨酰胺合成酶、1個(gè)原卟啉原氧化酶。

      本試驗(yàn)中,先將設(shè)計(jì)好的接頭與大豆小RNA的3′末端連接,然后利用與接頭序列互補(bǔ)的引物對(duì)小RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,即可得到加接頭的第1鏈cDNA;再用基因特異引物GSP和通用接頭引物的組合,經(jīng)PCR擴(kuò)增即可捕獲位于已知序列區(qū)和接頭之間的3′ 端RNA序列。

      1.2.1 連接3′接頭 3′接頭序列:5′-PO4-UUUCACTAGCACGAGCTCGCTACGCTCACTACTCGGCATTATGTACGCTAACTAACTCGTGGTC(idT)-3′。首先將總RNA與3′接頭均勻混合,80 ℃下處理2 min后置于冰中冷卻。配制反應(yīng)體系:無(wú)核酸酶的水18.6 μL、10×T4 RNA 連接酶緩沖液[不含牛血清白蛋白(BSA-free)]4.0 μL、BSA(0.1%)2.4 μL 、3′接頭2.0 μL、總RNA 11 μL、T4 RNA連接酶(40 U/μL)2.0 μL(100 μmol/L),5 ℃反應(yīng)16 h后,加入2 μL 0.5 mol/L EDTA終止反應(yīng);70 ℃下處理10 min以滅活連接酶,之后置于冰中保存。需要注意的是,配制反應(yīng)體系時(shí)須按照以下順序:無(wú)核酸酶的水→10×T4 RNA連接酶緩沖液→0.1% BSA→總RNA & 3′接頭混合液。

      1.2.2 連接5′接頭 5′接頭序列:5′-GGAATTCGGATC-3′,通過(guò)TaKaRa生產(chǎn)的末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用,使5′接頭poly(G)連接到cDNAs的3′末端,隨后利用BamHⅠ(dC)16引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果5′接頭被克隆到質(zhì)粒pTZ18上。

      1.2.3 合成cDNA cDNA文庫(kù)合成反應(yīng)體系:10×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液8.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)16 μL、dNTP(10 mmol/L)8.0 μL、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(20 U/μL)4.0 μL、RNasin(RNA酶抑制劑,40 U/μL) 2.0 μL、 RT引物(100 μmol/L)4.0 μL、連接有3′接頭的總RNA38 μL。首先將反應(yīng)液與RT引物均勻混合,80 ℃下處理2 min后置于冰中冷卻。RT引物序列:5′-GACCACGAGTTAGTTAGCGTACAT-3′。然后參照配制反應(yīng)體系(Promega公司試劑盒),按照以下程序合成cDNA文庫(kù):30 ℃ 10 min→42~55 ℃1 h→95 ℃ 5 min→5 ℃ 5 min。

      1.2.4 PCR檢測(cè)反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 遞減PCR(Touchdown PCR)是在引物的最高退火溫度與最適退火溫度之間,以一定溫度梯度逐步遞減至最適退火溫度,即通過(guò)在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)退火條件以提高擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的方法。例如循環(huán)可設(shè)在比估算的退火溫度高約5 ℃的退火溫度下開(kāi)始,然后每個(gè)循環(huán)降低1~2 ℃,直到降至退火溫度(也可低于退火溫度5 ℃)。特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增,這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增并占據(jù)優(yōu)勢(shì)。

      1.2.5 割膠回收、轉(zhuǎn)化連接、測(cè)序 DNA純化后利用瓊脂糖凝膠DNA回收方法割膠回收。在微量離心管中配制下列DNA溶液(全量為5 μL):pMD19-T載體1 μL;Control Insert(TaKaRa提供的DNA片段) 1 μL;ddH2O 3 μL。加入5 μL(等量)的 Solution I,16 ℃反應(yīng)30 min。全量(10 μL)加入至100 μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中,冰中放置30 min。42 ℃加熱45 s 后,再在冰中放置1 min。加入890 μL SOC培養(yǎng)基,37 ℃ 振蕩培養(yǎng)60 min。在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落;挑選白色菌落,使用PCR法確認(rèn)載體中插入片段的大??;將培養(yǎng)液送出測(cè)序。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 對(duì)已預(yù)測(cè)的4個(gè)miRNA前體序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)

      確定3′端對(duì)預(yù)測(cè)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)3′端引物。設(shè)計(jì)原則:在4個(gè)莖環(huán)上游,根據(jù)堿基配對(duì)比例設(shè)計(jì)1條引物,分別前移3個(gè)堿基、后移3個(gè)堿基,設(shè)計(jì)3條引物(表1)。

      由于microRNA本身序列較短,加接頭的目的是與 microRNA 連接便于擴(kuò)增與識(shí)別,3′接頭(64 bp)為:5′-PUUUCACTAGCACGAGCTCGCTACGCTCACTACTCGGCATTATGTACGCTAACTAACTCGTGGTCX-3′。

      2.2 小RNA的回收、轉(zhuǎn)化連接、PCR檢測(cè)及測(cè)序

      對(duì)設(shè)計(jì)的12條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收、轉(zhuǎn)化連接和PCR檢測(cè)。圖1顯示,每個(gè)引物挑5個(gè)克隆,目標(biāo)片段大小約85 bp(3′接頭64 bp,小RNA 20 bp左右),每個(gè)引物選1管菌液送去測(cè)序。

      測(cè)序結(jié)果表明:引物EPSP-2-1在3′端擴(kuò)出TGG,而引物EPSP-2-2在3′端擴(kuò)出AA,而且堿基TGG和AA均存在于已經(jīng)預(yù)測(cè)的小RNA前體序列中,如果這種3′端多態(tài)性確實(shí)存在,那么這個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的miRNA初步認(rèn)為是家族式的。

      為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種多態(tài)性的可靠性,在2個(gè)cDNA文庫(kù)中去擴(kuò)增:“B Lib.”文庫(kù)(含豆粒)和“R Lib.”(不含豆粒)文庫(kù)(圖2),每個(gè)平板挑10個(gè)克隆,進(jìn)行測(cè)序。

      測(cè)序結(jié)果表明:在上述2個(gè)文庫(kù)中,每個(gè)文庫(kù)挑10個(gè)克隆,可以看出3′端序列存在多態(tài)性,且重復(fù)性較高,3′端端點(diǎn)有4種可能(表3)。

      測(cè)序結(jié)果表明:在上述2引物中,每個(gè)引物挑5個(gè)克隆,可以看出5′端序列存在多態(tài)性,5′端序列有5種可能,詳見(jiàn)表4。

      后續(xù)的試驗(yàn)將主要依賴核酸雜交技術(shù)。利用試驗(yàn)認(rèn)定是同一家族的可能6個(gè)microRNA組合基因序列作為探針進(jìn)行Northern Blotting,可以在RACE的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA是否表達(dá)。

      3 討論

      本試驗(yàn)從4個(gè)靶標(biāo)酶入手,首先通過(guò)軟件預(yù)測(cè)miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),可知miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是莖環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)已知miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)堿基配對(duì)比例,通過(guò)篩選,挑選出可能的miRNA前體,miRNA前體在形成成熟miRNA的過(guò)程中,莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的一條莖被降解,另一條莖形成成熟的miRNA[17]。盡管從理論上來(lái)說(shuō),成熟的miRNA產(chǎn)生是隨機(jī)選擇的結(jié)果,但由于2條鏈的穩(wěn)定性有所不同,導(dǎo)致機(jī)會(huì)的不等[18]。而本研究只是對(duì)4個(gè)莖環(huán)中其中1條莖設(shè)計(jì)引物,沒(méi)有對(duì)另外的莖設(shè)計(jì)引物,所以不能排除其他3個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中也含有成熟的miRNA。本研究確定6個(gè)miRNA組合,可能是同一家族。植物miRNA具有簇集現(xiàn)象,多數(shù)miRNA不是分散分布的,而是2個(gè)或多個(gè)基因由1個(gè)前體miRNA加工而來(lái),成簇排列的基因協(xié)同表達(dá),顯現(xiàn)出在基因表達(dá)方面的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)[19]。

      后續(xù)試驗(yàn)將主要依賴核酸雜交技術(shù)[20]。利用試驗(yàn)認(rèn)定為同一家族可能的6個(gè)microRNA組合基因序列作為探針進(jìn)行Northern Blotting,可以在RACE的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA的表達(dá)與否。由于microRNA基因的表達(dá)比蛋白基因更迅速,且不受翻譯過(guò)程影響,對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控效率更高,我們可以把它作為一種強(qiáng)有力的工具,借助它來(lái)完成突變體的構(gòu)建與特定基因表達(dá)的調(diào)控。雖然對(duì)植物microRNA的研究取得了很大進(jìn)展,但是植物miRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上其本身如何被調(diào)控及其被調(diào)控后的結(jié)果是怎樣的,這些問(wèn)題都需要人們?nèi)パ芯亢吞剿鱗21]。隨著植物microRNA越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn),可以繼續(xù)研究它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育中的生物學(xué)意義和在分子水平上的調(diào)節(jié)機(jī)制,而且還可以有目的、有計(jì)劃地對(duì)它們進(jìn)行植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和生理結(jié)構(gòu)的改造,使植物更大限度地表現(xiàn)出對(duì)我們有利的性狀,從而為人類的生產(chǎn)生活造福。

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