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      黃花蒿1—脫氧—D—木酮糖—5—磷酸還原異構(gòu)酶基因的生物信息學(xué)分析

      2016-11-28 01:12:02王步勇馬玲
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年9期
      關(guān)鍵詞:青蒿素黃花氨基酸

      王步勇+馬玲

      摘要:以黃花蒿(Artemisia annua L.) 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因(DXR)為研究對(duì)象,利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站及生物信息學(xué)軟件對(duì)堿基分布、氨基酸組成、親疏水性及編碼蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì),用MGEA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),用STRING進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,研究黃花蒿DXR基因特征并預(yù)測(cè)分析DXR蛋白結(jié)構(gòu)與功能。結(jié)果表明:黃花蒿DXR基因mRNA序列長(zhǎng)度為1 419 bp,編碼蛋白包含472個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為6.15;DXR蛋白為疏水性蛋白,無(wú)信號(hào)肽,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明,黃花蒿DXR蛋白與杭白菊DXR(BAE79548.1)的相似度最高,為98%,且處于同一分支,親緣關(guān)系較近。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示,α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲是黃花蒿DXR蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件?;プ骶W(wǎng)絡(luò)分析顯示,黃花蒿DXR在2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)代謝途徑中,可與CMS、DXS、HDS等多個(gè)蛋白發(fā)生互作。黃花蒿DXR基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守,獲得的保守區(qū)序列信息為其他物種DXR基因的克隆奠定了基礎(chǔ),深入研究該蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能特征,也為今后提高青蒿素的生物合成量提供理論支持。

      關(guān)鍵詞:黃花蒿;DXR基因;生物信息學(xué);同源序列;多重序列比對(duì);蛋白結(jié)構(gòu);蛋白互作網(wǎng)絡(luò);青蒿素;生物合成量

      中圖分類號(hào): S188;R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

      文章編號(hào):1002-1302(2016)09-0042-05

      黃花蒿(Artemisia annua L.)為菊科蒿屬的一年生草本植物,生態(tài)適應(yīng)性非常廣,在我國(guó)各地均有分布,已入藥2 000多年,具有清熱解毒的功效,為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥之一。其主要有效成分青蒿素在抗瘧,治中暑、蕁麻疹和滅蚊等方面具有重要功效,是目前世界衛(wèi)生組織推薦治療瘧疾的首選藥物[1-2]。中國(guó)青蒿素產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%左右[3],由于野生資源的黃花蒿中青蒿素含量較低(0.01%~0.8%),致使青蒿素價(jià)格較高,很難滿足醫(yī)藥需求[4]。近年來(lái),利用環(huán)己烯酮[5]、青蒿酸[6-7]等物質(zhì)化學(xué)合成青蒿素取得一定成果,但因青蒿酸的生產(chǎn)主要依賴黃花蒿葉片,青蒿素的全化學(xué)合成幾乎不可能[8]。生物合成青蒿素仍是生產(chǎn)青蒿素的主要途徑,培育黃花蒿則成為提高青蒿素產(chǎn)量的關(guān)鍵。通過(guò)對(duì)青蒿素生物合成中關(guān)鍵酶的研究,利用基因工程獲得高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株是解決這一矛盾的有效途徑。

      青蒿素是含有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯,屬于萜類化合物。絕大多數(shù)萜類化合物的合成前體是異戊烯基焦磷酸(IPP),植物體內(nèi)IPP的生物合成主要存在2條不同的代謝途徑:一是定位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑[9];另一條是定位于質(zhì)體中的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途徑[10]。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)催化1-脫氧-D-葡萄糖-5-磷酸(DXP)產(chǎn)生異構(gòu)并還原生產(chǎn)MEP,是MEP代謝途徑中最重要的限速反應(yīng),也是細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)類異戊二烯化合物代謝中的重要調(diào)控穩(wěn)點(diǎn)[11]。DXR在植物類異戊二烯生物合成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Mahmoud等發(fā)現(xiàn),薄荷過(guò)量表達(dá)DXR,可促進(jìn)葉片中薄荷油等單萜的合成,使薄荷精油量提高50%[12]。Carretero-Paulet等發(fā)現(xiàn),在過(guò)量表達(dá)DXR的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,葉綠素、類胡蘿卜素水平都顯著提高[13]。Graham等通過(guò)對(duì)青蒿基因組測(cè)序并對(duì)青蒿素合成相關(guān)基因進(jìn)行分析表明,DXR與青蒿素合成呈正相關(guān)[14]。

      近年來(lái),擬南芥、番茄、水稻、玉米、銀杏、橡膠樹(shù)及喜樹(shù)等多種植物的DXR基因得到解析[15-16],但尚未有報(bào)道利用生物信息學(xué)的方法系統(tǒng)研究這些基因,制約了其他物種中該基因的克隆與功能驗(yàn)證。本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對(duì)黃花蒿DXR基因以及GenBank上已發(fā)表的其他植物DXR基因進(jìn)行序列分析和功能預(yù)測(cè),利用分子互作技術(shù)對(duì)黃花蒿DXR基因進(jìn)行全面分析,旨在為提高黃花蒿青蒿素產(chǎn)量提供新思路,為其他植物DXR基因的克隆、功能驗(yàn)證提供理論和實(shí)踐參考依據(jù)。

      1 材料與方法

      數(shù)據(jù)來(lái)源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已登陸的黃花蒿DXR基因的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào):AF182287.2)、氨基酸序列(GanBank登錄號(hào):AAD56391.2)[17]。

      黃花蒿DXR序列分析:利用NCBI在線工具ORF-Finder翻譯蛋白并進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(ORF)查找。利用ExPASy ProtParam預(yù)測(cè)分析編碼蛋白的相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)[18]。用Target 1.1 Server在線軟件分析編碼蛋白的導(dǎo)肽[19]。用SignalP 4.1在線軟件分析編碼蛋白信號(hào)肽[20]。用TMHMM Server軟件對(duì)編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[21]。用WOLF PSORT預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位信號(hào)[22]。用ProtScale分析編碼蛋白的親疏水性。用NetPhos 2.0 Server分析編碼蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)[23]。利用NCBI BLAST篩選同源序列,用Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。利用MEGA 5.2 軟件鄰接算法N-J(Neihgbor-Joining)[24],選用JTT+I模型運(yùn)算1 000次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),并利用Bootstraping自展法對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。

      蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及互作網(wǎng)絡(luò)分析:用NCBI CDD工具對(duì)蛋白保守區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;用ExPaSy-SOPMA軟件分析編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu);用SWISS-MODEL自動(dòng)建模方式來(lái)篩選構(gòu)建三維模型,用X射線衍射結(jié)構(gòu)進(jìn)行模型修飾;用Swiss-Pdb viewer構(gòu)建拉氏構(gòu)象圖,對(duì)建模準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估;用STRIG 9.1(http://string.embl.de/)[25]進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 黃花蒿DXR基因分析和蛋白分析

      2.1.1 黃花蒿DXR基因序列分析 NCBI上登錄的黃花蒿DXR序列是從黃花蒿mRNA中克隆得到的全長(zhǎng)CDS(coding sequence)序列。序列全長(zhǎng)為1 419 bp,其中包含多個(gè)起始密碼子(ATG)和1個(gè)終止密碼子(TGA)。其中A有379個(gè),T有415個(gè),A+T含量較高,為55.95%;C有292個(gè),G有333個(gè),C+T含量較少,為44.05%。

      2.1.2 黃花蒿DXR編碼蛋白的氨基酸組成及其理化性質(zhì)分析 通過(guò)ORF-Finder軟件分析發(fā)現(xiàn),黃花蒿DXR編碼蛋白編碼472個(gè)氨基酸。該預(yù)測(cè)蛋白原子總數(shù)為7 204個(gè),分子式為C2 278H3 634N600O677S15,蛋白相對(duì)分子量為50.74 ku;理論半衰期為30 h;不穩(wěn)定系數(shù)為33.53,小于40.0,說(shuō)明該蛋白屬于穩(wěn)定性蛋白。此外,該蛋白脂肪系數(shù)為98.37,親水性系數(shù)為0.020,理論等電點(diǎn)(PI)為6.15。由其氨基酸組分可知,丙氨酸Ala(A)、亮氨酸Leu(L)含量最高,為9.70%;半胱氨酸Cys(C)含量最低,為1.50%;帶負(fù)電荷總殘基數(shù)(Asp+Glu)為49個(gè),帶正電荷總殘基數(shù)(Arg+Lys)為44個(gè)(圖1)。

      2.1.3 DXR蛋白導(dǎo)肽、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析 用TargetP 1.1 Server預(yù)測(cè)DXR導(dǎo)肽,結(jié)果顯示,該序列mTP(定位于線粒體)值為0.030,cTP(定位于葉綠體)值為0.691,SP(信號(hào)肽)值為0.022,推測(cè)該序列不含有線粒體目標(biāo)肽、分類途徑信號(hào)肽,可能為葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。SignalP 4.1預(yù)測(cè)顯示,黃花蒿DXR蛋白為非分泌蛋白。用WOLF PSORT軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),該蛋白最可能定位于細(xì)胞質(zhì)上,可信度高達(dá)76%。

      2.1.4 DXR蛋白親/疏水性及磷酸化位點(diǎn)分析 利用ProtScale預(yù)測(cè)黃花蒿DXR蛋白的親/疏水性,由圖2可見(jiàn):在黃花蒿DXR蛋白氨基酸中,第167~193位氨基酸區(qū)域具有很強(qiáng)的疏水性,在第171位氨基酸處達(dá)到最強(qiáng)疏水性峰值,為2.444;第32~44位氨基酸區(qū)域具有很強(qiáng)的親水性,在第40位氨基酸處達(dá)到最強(qiáng)親水性峰值,為-2.224。由于親水性氨基酸的個(gè)數(shù)多于疏水性氨基酸,預(yù)測(cè)黃花蒿DXR蛋白為親水性蛋白。

      用NetPhos2.0 Server預(yù)測(cè)結(jié)黃花蒿DXR蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),在DXR有17個(gè)絲氨酸(Ser,S)磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸(Thr,T)磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪氨酸(Tyr,Y)磷酸化位點(diǎn)。在整個(gè)氨基酸序列中,第7位氨基酸(S)、第40位氨基酸(S)的磷酸化預(yù)測(cè)值最高,為0.992,可能受蛋白磷酸化激酶磷酸化。

      2.2 多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

      用NCBI BLAST篩選得到14條黃花蒿DXR同源序列(表1),應(yīng)用Clustal W進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。圖3結(jié)果發(fā)現(xiàn),中間功能區(qū)域的氨基酸序列較為保守,兩端區(qū)域的氨基酸序列差異較大,且N-端差異大于C-端差異。用MEGA5.2 軟件N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖4結(jié)果可知:16個(gè)物種的DXR氨基酸序列聚集成2大分支:黃花蒿、艾菊、杭白菊、甜葉菊聚為分支Ⅰ;千金子、蓖麻、毛果楊等聚為分支Ⅱ。由傳統(tǒng)分類學(xué)可知,分支Ⅰ中的黃花蒿、艾菊、杭白菊、甜葉菊4個(gè)物種均屬菊科,分支Ⅱ中的千金子、蓖麻、毛果楊等11個(gè)物種不屬于菊科。這表明DXR是1種相對(duì)保守的蛋白,物種的進(jìn)化速度與物種DXR蛋白的進(jìn)化速度是一致的,DXR可以作為生物遺傳分析、分子進(jìn)化研究的重要因子。

      2.3 DXR蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及互作網(wǎng)絡(luò)分析

      2.3.1 黃花蒿DXR蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè) 利用NCBI CDD在線分析黃花蒿DXR蛋白保守區(qū)域。圖5結(jié)果顯示,DXR蛋白含有DXP_reductoisom、DXP_redisom_C、DXPR_C 3個(gè)保守結(jié)構(gòu)區(qū)域,預(yù)測(cè)該蛋白屬于SDR 超家族、DXP_redisom_C超家族及DXPR_C超家族。

      2.3.2 黃花蒿DXR蛋白結(jié)構(gòu)分析 用ExPaSy-SOPMA軟件分析DXR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖6可知,該蛋白由37.08%無(wú)規(guī)則卷曲、28.81% α-螺旋、23.94%延伸鏈、10.17%β-轉(zhuǎn)角組成,無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋是其主要構(gòu)件,延伸鏈貫穿于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

      利用Swiss-MODEL根據(jù)同源蛋白構(gòu)建黃花蒿DXR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7-A),該蛋白包含28個(gè)α-螺旋、25個(gè)β-折疊和大量無(wú)規(guī)則卷曲。通過(guò)Swiss-Pdb Wiewer構(gòu)建拉氏構(gòu)象圖(圖7-B)對(duì)預(yù)測(cè)的DXR三維模型進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn),預(yù)測(cè)模型的二面角位于黃色核心區(qū)域,其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,該蛋白利用Swiss-MODEL同源建模得到的三維結(jié)構(gòu)的可信度極高。用VAST Search在線軟件預(yù)測(cè)DXR蛋白的功能位點(diǎn)(圖7-C),預(yù)測(cè)DXR蛋白兩端的α-螺旋、β-折疊結(jié)合部位為主要的功能位點(diǎn)。

      2.3.3 黃花蒿DXR蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)黃花蒿DXR蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型,利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果表明,DXR在催化DXP產(chǎn)生異構(gòu)并還原生產(chǎn)MEP代謝過(guò)程中與多個(gè)蛋白發(fā)生互作,主要包括:CMS、DXS、eugene3.09030001、gw1.III.2599.1、gw1.171.35.1、gw1.VI.2744.1、estExt_Genewise1_v1.C_LG_XVIII1471、MCS、gw1.I.8813.1、HDS等(圖8)。

      3 結(jié)論與討論

      次生代謝產(chǎn)物是地球上最豐富的有機(jī)化合物,由于其功能特殊、用途廣泛,現(xiàn)已成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)、焦點(diǎn)。目前已經(jīng)有多種萜類化合物被分離提取,應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等各領(lǐng)域。青蒿素作為黃花蒿的1萜類次生代謝產(chǎn)物,因其具有抗瘧效率高、速度快、毒性低等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為全球抗瘧的主要藥物。2011年,因?qū)η噍锼氐目汞懷芯孔鞒鲐暙I(xiàn),我國(guó)的女藥學(xué)家屠呦呦獲得了拉斯克獎(jiǎng)[26]。青蒿素的獲取主要依賴于黃花蒿的生物合成,全面了解青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶的功能,通過(guò)基因工程等手段調(diào)控其在植物體內(nèi)表達(dá),獲得大量有用的青蒿素,可為提高青蒿素產(chǎn)量開(kāi)辟新的思路。

      DXR在萜類物質(zhì)MEP合成途徑中具有特殊作用,可將DXP異構(gòu)化并還原生產(chǎn)MEP。黃花蒿DXR作為青蒿素生物合成的重要限速酶而倍受關(guān)注。生物信息學(xué)是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的核心領(lǐng)域,是后基因組時(shí)代的重要研究方法。本研究根據(jù)NCBI上登錄的黃花蒿DXR基因序列,應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)該基因及編碼蛋白進(jìn)行比對(duì)、分析、建模等研究,應(yīng)用STRING對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析?;蛐蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn),該基因中A+T堿基含量較高,為55.95%,高于50%,且錯(cuò)配率較低,核苷酸穩(wěn)定。編碼蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),DXR蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為33.53,屬于不穩(wěn)定性蛋白。多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),黃花蒿DXR與杭白菊DXR同源性最高,為98%,親緣關(guān)系最近。DXR在進(jìn)化上高度保守,可作為其他物種生物遺傳分析和分子進(jìn)化研究的重要因子。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示,無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋是其主要結(jié)構(gòu)元件。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明,黃花蒿DXR可能與1-脫氧木桶糖-5-磷酸合成酶(DXS)互作。本研究結(jié)果為深入探討黃花蒿DXR蛋白功能和萜類生物合成的分子機(jī)制提供重要基礎(chǔ)信息,為提高黃花蒿青蒿素的生物合成量提供了理論支持,也為其他植物萜類等次生代謝產(chǎn)物的研究提供了一定依據(jù)。

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