不同靈芝菌株功能性成分含量及其抗氧化活性比較

曹正+凡軍民+謝春芹+呂興萍+朱怡婷

摘要：采用不同方法提取并比較4種不同靈芝菌株功能性成分的含量及其抗氧化活性。結(jié)果表明：黑靈芝的多糖含量最高（P<0.05），達(dá)6.55 mg/g；大紅芝的甘露醇含量最高（P<0.05），達(dá)21.92 mg/g；黑靈芝的總?cè)坪孔罡撸≒<0.05），達(dá)170.53 mg/g；在1.0 mg/mL濃度下，赤芝、大紅芝、黑靈芝、靈芝902多糖對(duì)DPPH自由基的清除率分別為81.88%、80.92%、80.30%、76.38%。由結(jié)果可見，不同靈芝菌株間的多糖、甘露醇和總?cè)坪看嬖诓町悺？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，4種靈芝菌株多糖清除DPPH自由基活性均較強(qiáng)，隨著濃度的增大而升高。

關(guān)鍵詞：靈芝；多糖；甘露醇；總?cè)?；抗氧化活?/p>

中圖分類號(hào)： S567.3+10.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0281-02

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種名貴的藥用真菌，在亞洲作為藥材使用已有2 000多年的歷史。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，靈芝具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜安神、強(qiáng)心及抗心肌缺血、調(diào)節(jié)血脂、平喘、保肝、降血糖、抗缺氧、清除自由基以及延緩衰老等藥理作用[1-2]。這些藥理活性與靈芝中多糖、三萜類、腺苷、生物堿、油脂類、甾醇類等功能性成分密切相關(guān)，其中多糖、三萜類化合物被認(rèn)為是其主要藥效成分，其含量成為衡量靈芝質(zhì)量高低的重要指標(biāo)[3-4]。目前，對(duì)不同靈芝菌株甘露醇含量的比較分析尚未見報(bào)道。

由于靈芝種類繁多，品種間的不同均可能會(huì)引起功能性成分在產(chǎn)量表達(dá)上的差異[3]。因此，本研究選取不同靈芝菌株，對(duì)其多糖、甘露醇及總?cè)坪窟M(jìn)行測(cè)定比較，并對(duì)多糖抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為靈芝的進(jìn)一步研究和開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大紅芝、黑靈芝、靈芝902、赤芝，均采于江蘇農(nóng)博園食用菌基地。

1.2 試劑

95%乙醇、濃硫酸、苯酚、香草醛、高氯酸、冰乙酸、乙酸銨、乙酰丙酮、濃鹽酸、高碘酸鈉、L-鼠李糖、無水乙醇，均為國(guó)產(chǎn)分析純；葡萄糖、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自南京替斯艾么中藥研究所；1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 儀器

756型紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FA2004N 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ 3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；TDL-5A低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；LGJ-12普通型冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 靈芝的預(yù)處理 將新鮮靈芝子實(shí)體去雜、切塊、烘干、粉碎。

1.4.2 靈芝功能性成分的提取

1.4.2.1 多糖的提取與制備 脫脂：取靈芝子實(shí)體粉末，加入6倍體積的95%乙醇室溫浸泡48 h，重復(fù)3次，濾渣風(fēng)干待用。沸水提?。壕_稱取0.500 0 g脫脂的靈芝粉末，加100 mL 水，沸水浴提取2 h，冷卻至室溫，過濾，上清液定容至100 mL；移取20.0 mL提取液，緩緩加入80.0mL 95%乙醇，靜置過夜，3 000 r/min離心15 min，沉淀物溶解定容至100 mL，溶液待測(cè)。多糖的制備：將沸水提取液減壓濃縮，濃縮5～10倍，離心除沉淀；在濃縮液中緩緩加入95%乙醇（體積比1 ∶4），靜置過夜、離心，沉淀物用蒸餾水溶解。透析：截留分子量為10 ku，截留液冷凍干燥。

1.4.2.2 甘露醇的提取 精確稱取0.500 0 g靈芝粉末，加100 mL水，沸水浴提取2 h，冷卻至室溫，過濾，上清液加水定容至100 mL，溶液待測(cè)。

1.4.2.3 總?cè)频奶崛?精確稱取0.500 0 g靈芝粉末，加入10.0 mL無水乙醇，浸泡20 min，超聲波提取30 min后，搖勻、過濾，濾液加水定容至50 mL，溶液待測(cè)。

1.4.3 靈芝功能性成分的測(cè)定

1.4.3.1 多糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[5]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別移取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL的100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支試管中，加水至總體積為2.0 mL，再加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻后迅速加入5 mL硫酸搖勻冷卻，室溫放置 20 min，于490 nm處測(cè)吸光度。以質(zhì)量為橫坐標(biāo)、D490 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定：移取多糖提取液1.0 mL，按上述同樣操作顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.4.3.2 甘露醇含量測(cè)定 采用高碘酸鈉比色法[6]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別移取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 25 μg/mL甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，加蒸餾水至總體積為2.0 mL，加1.0 mL高碘酸鈉試液，混勻，室溫放置 10 min；加2.0 mL 0.1 %鼠李糖，再加4.0 mL新配制的Nash 試劑，53 ℃ 水浴 15 min，于420 nm測(cè)吸光度。以質(zhì)量為橫坐標(biāo)、D420 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定：移取1.0 mL甘露醇提取液，按上述同樣操作顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甘露醇含量。

1.4.3.3 總?cè)坪繙y(cè)定 采用高氯酸-香草醛顯色法[7]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 200 μg/mL齊墩果酸溶液于具塞試管中，70 ℃水浴揮干；加0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸液，搖勻；再加入0.6 mL高氯酸，于60 ℃水浴20 min，冰浴冷卻，加5.0 mL冰乙酸，搖勻，置室溫15 min，于545 nm處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量為橫坐標(biāo)、D545 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定：移取1.0 mL總?cè)铺崛∫河诰呷嚬苤校瓷鲜鐾瑯硬僮黠@色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜酸含量。

1.4.4 抗氧化活性測(cè)定 用DPPH法測(cè)定[8]，分別吸取4.0 mL 不同濃度樣液與0.2 mmol/L DPPH溶液，加入具塞試管中搖勻，黑暗條件下于37 ℃放置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液于517 nm處測(cè)吸光度，以維生素C作為陽性對(duì)照。清除率計(jì)算公式：清除率=[1-（Di-Dj）/D0]×100%。式中：Di為不同多糖含量下的吸光度；Dj為用無水乙醇代替DPPH溶液時(shí)測(cè)得的不同多糖含量本底吸光度；D0為用水代替多糖樣品時(shí)測(cè)得空白對(duì)照吸光度。每個(gè)濃度平行做3次試驗(yàn)，計(jì)算清除率的平均值。

1.4.5 結(jié)果計(jì)算 采用軟件SPSS 13.0，用Duncans法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同靈芝菌株的多糖含量比較

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程：Y=6.502 4X+0.020 6，r2=0.997 4。式中：Y為D490 nm；X為葡萄糖溶液的濃度，mg/g。

由表1可見，不同靈芝菌株多糖含量間差異明顯，黑靈芝中的多糖含量最高，達(dá)6.55 mg/g；其次是大紅芝、靈芝902，多糖含量分別為6.04、5.76 mg/g（P<0.05）；赤芝含量最低，多糖含量為4.80 mg/g，與其他靈芝中的多糖含量差異極顯著。

2.2 不同靈芝菌株的甘露醇含量

以甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程：Y=8.864X+0.060 1，r2=0.997 7。式中：Y為D420 nm；X為甘露醇溶液的濃度，mg/g。

由表2可見，不同靈芝菌株甘露醇含量差異明顯，大紅芝中所含的甘露醇含量最高，達(dá)21.92 mg/g，其次是赤芝，甘露醇含量達(dá)18.16 mg/g，黑靈芝、靈芝902的甘露醇含量較低，分別為8.80、5.05 mg/g。

2.3 不同靈芝菌株的總?cè)坪康谋容^

以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立線性回歸方程：Y=0.031X+0.069 8，r2 =0.996 3。式中：Y為D545 nm；X為齊墩果酸溶液的濃度，mg/g。

由表3可見，不同靈芝菌株總?cè)坪坎町惷黠@，黑靈芝中的總?cè)坪孔罡?，達(dá)170.53 mg/g；其次是大紅芝、赤芝，總?cè)坪糠謩e達(dá)149.62、131.27 mg/g；靈芝902的總?cè)坪孔畹?，?6.67 mg/g。

2.4 靈芝多糖抗氧化活性比較

由表4可知，4種不同靈芝菌株多糖清除DPPH自由基活性隨著多糖含量的增大而升高。在1.0～4.5 mg/mL多糖含量范圍內(nèi)，同一濃度下赤芝、大紅芝、黑靈芝的提取多糖清除DPPH自由基能力差異不顯著，靈芝902多糖清除能力最差（P<0.05）；在1.0 mg/mL濃度下，赤芝、大紅芝、黑靈芝、靈芝902多糖對(duì)DPPH自由基的清除率分別為81.88%、80.92%、80.30%、76.38%。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，黑靈芝的多糖含量最高，達(dá)6.55 mg/g；大紅芝的甘露醇含量最高，達(dá)21.92 mg/g；黑靈芝的總?cè)坪孔罡撸_(dá)170.53 mg/g；在1.0 mg/mL濃度下，赤芝、大紅芝、黑靈芝、靈芝902清除DPPH自由基活性分別為81.88%、80.92%、80.30%、76.38%。4種靈芝菌株間的功能性成分多糖、甘露醇和總?cè)坪考捌淇寡趸钚源嬖陲@著差異。4種靈芝菌株的多糖清除DPPH自由基活性均隨著濃度的增大而升高。靈芝多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力可能與其他成分如酚類、黃酮、活性物質(zhì)共同作用產(chǎn)生，需要進(jìn)一步對(duì)其他活性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析。

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