酶解法提取川貝母組培物總生物堿

廖黎+樊榮+徐文俊+劉昆+王躍華

摘要：為了研究四川道地名貴藥材川貝母及其組織培養(yǎng)物有效藥用成分總生物堿的提取和含量測定方法，以及總生物堿含量的變化規(guī)律。利用纖維素酶酶解細胞壁中纖維素促進生物堿溶出原理，以酶解溫度（A）、pH值（B）、酶用量（C）和酶解時間（D）為影響因素進行總生物堿的酶解法正交提取試驗，結(jié)合飽和Ca（OH）2溶液浸漬和乙醇回流法提取生物堿；通過酸性染料比色法測定總生物堿含量。結(jié)果表明，總生物堿的酶解法最佳提取工藝為A3B3C2D1，采用酶解法最佳提取工藝，川貝母及其組織培養(yǎng)物總生物堿提取得率分別提高28.74%、42.86%，川貝母組培物的總生物堿含量超過川貝母114.07%。酶解法提高了川貝母有效藥用成分總生物堿的得率，經(jīng)過研發(fā)得到的川貝母組織培養(yǎng)物總生物堿含量呈現(xiàn)快速增長規(guī)律，為以名貴道地藥材川貝母的新藥研發(fā)奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：川貝母；組培物；總生物堿；酶解法；正交試驗

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0313-03

川貝母（Fritillaria cirrhosa D. Don）是來源于百合科（Liliaceae）貝母屬（Fririllaria L.）中多種植物的鱗莖，有悠久的使用歷史，早在漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，將其列為中品。按其功能一般分為浙貝母與川貝母兩大類，浙貝母清熱化痰、開郁散結(jié)；川貝母清熱潤肺、化痰止咳，用于肺熱燥咳、陰虛勞嗽、干咳少痰、咯痰帶血[1-3]。本研究以實驗室培養(yǎng)的川貝母組培物為原料，以貝母素乙為對照品，探索在采用酸性染料比色法[4-6]前使用纖維素酶進行酶解，再采用飽和Ca（OH）2溶液浸漬和乙醇回流浸提工藝提取總生物堿以及用酸性染料比色法測定提取物中總生物堿的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ESJ120-4電子分析天平（沈陽龍騰電子儀器有限公司）、UV-1100型紫外可見光分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、DHG9141型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、KG22V11T1/222西門子自動溫控冰箱。

1.2 材料

川貝母組培物（成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院組培實驗室研發(fā)）、貝母素乙標準品（110751-200608，中國藥品生物制品檢定所）、纖維素酶（上海伯奧生物科技有限公司，>15 U/mg）、其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 酸性染料比色法特征吸收波長測定

精確量取貝母素乙標準品4 mL，置60 mL分液漏斗中，加水2 mL，加pH值5.0緩沖液2 mL，加溴麝香草酚蘭試液2 mL，再加一定量氯仿，萃取2次，使2次氯仿加入量與標準品溶液之和為12 mL，充分搖勻，放置分層，將下層液經(jīng)中速干燥濾紙濾過后移入25 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，作測試液。以氯仿同法操作作為空白對照，用UV-1100紫外分光光度儀，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行掃描[7]。得到圖1酸性染料法測定貝母素乙吸光度與波長曲線圖。

由圖1可知，貝母素乙標準品在411.1 nm波長處有最大（特征）吸收峰，故選擇411 nm作為測定貝母素乙的最大（特征）吸收波長。

2.2 酸性染料比色法繪制貝母素乙標準曲線

按表1進行加樣操作，以氯仿同法操作作為空白對照，在411 nm波長處測定其D值。由表2進行微機數(shù)據(jù)處理得到回歸方程：D=0.040C+0.009，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3，貝母素乙在2.08～6.24 μg/mL線性關(guān)系良好（圖2）。

2.3 酶解法提取川貝母組培物樣品總生物堿與含量測定[8-9]

酶解法提取川貝母組培物總生物堿：5 g川貝母組培樣品加10倍量水，用HCl調(diào)節(jié)pH值，按表3要求控制酶解溫度、pH值、纖維素酶加入量、酶解時間， 酶解后用Ca（OH）2飽和溶液浸漬2 h、加入75%乙醇100 mL，在80 ℃水浴中回流浸提4 h，抽濾。

樣品總生物堿含量的測定：將提取液水浴蒸干后，用氯仿溶解殘留物并移入25 mL容量瓶中，加氯仿至刻度。按照標準曲線加樣方法，在411 nm波長處測定樣品D值，代入標準曲線對應(yīng)回歸方程計算出川貝母組培物總生物堿的質(zhì)量濃度。川貝母組培物總生物堿的含量，以質(zhì)量百分率表示，按下式計算：

總生物堿含量=[（D-0.009）×n]/（m×106×0.040 0）×100%。

式中：D為吸光度；n為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

2.4 酶解法提取川貝母組培物總生物堿的正交試驗

通過單因素試驗，選定酶解溫度（A）、pH值（B）、酶用量（C）和酶解時間（D）為提取總生物堿影響因素，選擇3個水平，按表3控制條件進行正交提取試驗[10-11]。

由表4可知：川貝母組培物總生物堿含量的最佳工藝的因素水平組合為A3B3C2D1，根據(jù)各因素極差值的大小，可得出酶解溫度（A）、pH值（B）、酶用量（C）、酶解時間（D）4個影響因素中，對總生物堿的提取結(jié)果影響大小次序是B>C>D>A。

由于L9（34）的4列都已放滿因子，無第1類偏差，因此只能用第2類偏差Se2作為誤差檢驗各因子的顯著性[12]，試驗結(jié)果見方差分析表5。

2.5 纖維素酶對川貝母及其組培物提取總生物堿的驗證試驗

將川貝母及其組培物分成加酶和不加酶處理組，加酶組按A3B3C2D1最佳酶法提取工藝進行酶解處理，每組采用飽和Ca（OH）2溶液浸泡和乙醇回流浸提工藝進行3次平行試驗，對每組提取物用酸性染料比色法測定其總生物堿含量，試驗結(jié)果見表6。

3 分析與討論

3.1 正交試驗結(jié)果分析

通過正交試驗，采用酸性染料比色法測定用飽和Ca（OH）2 溶液浸泡和乙醇回流浸提工藝的川貝母組培物總生物堿的含量。由正交試驗方差分析可知，pH值和加酶量對正交試驗影響達到顯著水平，因此正交試驗因素與水平設(shè)計合理，得到的A3B3C2D1為最佳提取工藝條件，即酶解溫度為60 ℃，酶解時間為2.5 h，最適pH值為5.5，加酶量為0.25 g/L。

3.2 纖維素酶對川貝母及其組培物總生物堿提取得率的影響

從驗證試驗結(jié)果可知川貝母加纖維素酶比未加纖維素酶總生物堿得率平均高出28.74%，川貝母組培物加纖維素酶比未加纖維素酶總生物堿得率平均高出42.86%。纖維素酶在川貝母總生物堿提取中通過降解并破壞植物纖維組織，促進有效成分的溶解，明顯提高了有效成分總生物堿的得率。該提取工藝簡單、操作方便，具有推廣應(yīng)用價值，可以考慮用于實際生產(chǎn)中。

3.3 川貝母組培物總生物堿含量變化規(guī)律分析

從驗證試驗結(jié)果可知：由成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院研發(fā)的川貝母組培物，其總生物堿含量遠遠高出其川貝母本身的總生物堿含量，其加酶提取得率高出114.07%。經(jīng)過研發(fā)得到的川貝母組培物總生物堿含量呈現(xiàn)快速增長規(guī)律，為以名貴道地藥材川貝母的新藥研發(fā)奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

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