正交試驗(yàn)法篩選白虎定喘口服液提取工藝研究

趙增成+黃中利+林樹乾

摘要：為了優(yōu)化白虎定喘口服液的煎煮工藝，以干膏量、綠原酸含量、黃芩苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以中藥浸泡時(shí)間、加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為影響因素，采用正交試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行多指標(biāo)綜合篩選。結(jié)果顯示，煎煮次數(shù)對(duì)3個(gè)指標(biāo)有顯著影響，其他因素影響均不顯著；優(yōu)化的工藝條件為加15倍量水、浸泡0.5 h、每次煎煮0.5 h、煎煮3次。優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定可行，有效成分提取率高，能保證制劑質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：正交試驗(yàn)；提取工藝；干膏；綠原酸；黃芩苷

中圖分類號(hào)：S853.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）11-0140-04

Abstract In order to optimize the decoction process of Baihu Dingchuan oral liquid， the extraction process were comprehensively screened by orthogonal test with dry paste volume， contents of chlorogenic acid and baicalin as the evaluation indexes and herbal medicine immersion time， amount of water， decocting time and decocting times as the influence factors. The results showed that decocting times had significant effects on the 3 indicators， and the influences of other factors were not significant. The optimized conditions were adding 15-fold of water， soaking for 0.5 hour， decocting for 3 times and 0.5 hour each time. The optimized extraction process was stable and feasible with high active ingredient extraction rate， and it could guarantee the quality of preparation.

Keywords Orthogonal test； Extraction process； Dry paste； Chlorogenic acid； Baicalin

白虎定喘口服液是由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所研制的新獸藥，主要由石膏、金銀花、黃芩、知母等組成，功效為清瀉肺熱、化痰平喘，主治雞傳染性支氣管炎等外感邪熱入肺所致的發(fā)熱、痰多、咳喘之癥。中藥的煎煮工藝對(duì)制劑的質(zhì)量和療效具有重要影響[1，2]，為了確保制劑質(zhì)量，更好地發(fā)揮臨床療效，采用正交試驗(yàn)法對(duì)其提取工藝進(jìn)行了篩選研究，選定加水量、中藥浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)4個(gè)因素，對(duì)產(chǎn)品中干膏量、綠原酸含量和黃芩苷含量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確定白虎定喘口服液的最佳提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀、AB265-S型雙量程十萬(wàn)分之一電子天平、KQ5200DB型超聲儀。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-201314）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-201318），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。白虎定喘口服液由山東昊泰科技藥業(yè)有限公司試制。乙腈為色譜純?cè)噭状?、磷酸均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取加水量（A）、中藥浸泡時(shí)間（B）、煎煮時(shí)間（C）、煎煮次數(shù)（D）4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平篩選試驗(yàn)（表1）。選用正交表L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

1.4 測(cè)定方法

按處方稱取相同的中藥飲片，按照以上試驗(yàn)方案要求進(jìn)行煎煮提取，提取液最后均濃縮至1 g/mL。

取中藥濃縮液50 mL，置水浴上蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定干膏重量。

取中藥濃縮液，以綠原酸、黃芩苷做為指標(biāo)成分，進(jìn)行含量測(cè)定。具體測(cè)定方法按《白虎定喘口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案》進(jìn)行。

1.5 黃芩苷含量測(cè)定

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

對(duì)照品溶液的制備：取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密量取本品2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20 min，混勻，即得。

測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。

1.6 綠原酸含量測(cè)定

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

對(duì)照品溶液的制備：取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

供試品溶液的制備：精密量取本品2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲20 min，搖勻，即得。

測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

以干膏量、綠原酸含量、黃芩苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用極差法進(jìn)行最佳因素排序，并得出最優(yōu)組合。采用方差分析，得出各因素對(duì)各指標(biāo)的顯著影響程度，確定最佳工藝條件。

1.8 工藝驗(yàn)證

按照確定的最佳工藝條件，進(jìn)行中藥提取，測(cè)定干膏量、綠原酸含量、黃芩苷含量，進(jìn)行工藝驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

根據(jù)極差（R）大小排序，影響制劑中干膏量的因素為D>A>B>C，即煎煮次數(shù)>加水量>浸泡時(shí)間>煎煮時(shí)間，最優(yōu)條件為A3B1C2D3；影響制劑中綠原酸含量的因素為D>C>B>A，即煎煮次數(shù)>煎煮時(shí)間>浸泡時(shí)間>加水量，最佳條件為A3B1C2D3；影響制劑中黃芩苷含量的因素為D>C>A>B，即煎煮次數(shù)>煎煮時(shí)間>加水量>浸泡時(shí)間，最佳條件為A3B3C2D3。

方差分析結(jié)果表明，D因素（煎煮次數(shù)）對(duì)干膏量、綠原酸含量、黃芩苷含量均影響顯著（P<0.05），A因素（加水量）、B因素（浸泡時(shí)間）、C因素（煎煮時(shí)間）對(duì)干膏量、綠原酸含量、黃芩苷含量三項(xiàng)指標(biāo)影響均不顯著（P>0.05）。

綜合分析以上結(jié)論，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4個(gè)因素中，只有煎煮次數(shù)對(duì)3個(gè)指標(biāo)有顯著影響，其他因素影響均不顯著，考慮實(shí)際生產(chǎn)中時(shí)間和能源的節(jié)省，將提取條件確定為A3B1C1D3，即加15倍量水、浸泡0.5 h、煎煮0.5 h、煎煮3次。

2.2 工藝驗(yàn)證結(jié)果

按以上確定的A3B1C1D3工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果干膏量為16.1632 g，綠原酸含量為1.1740 mg/mL，黃芩苷含量為12.4725 mg/mL，3項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到滿意要求。

3 討論與結(jié)論

中獸藥制備工藝是新獸藥研究中的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容，目的就是對(duì)提取工藝條件進(jìn)行科學(xué)篩選，使制備工藝做到科學(xué)、合理、先進(jìn)、可行，使研制的新藥達(dá)到安全、有效、可控和穩(wěn)定[3，4]。煎煮為中藥傳統(tǒng)提取方法，工藝簡(jiǎn)單，往往對(duì)其重視不夠。如果僅按照傳統(tǒng)煎煮經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行，工藝研究不充分，工藝參數(shù)不明確，隨意性大，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性將造成很大影響[5，6]。加強(qiáng)對(duì)中藥新藥工藝過(guò)程的控制，可以提高對(duì)中藥的質(zhì)量控制水平，保證在穩(wěn)定的工藝條件下生產(chǎn)出符合標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品。正交設(shè)計(jì)以其“均勻分散、整齊可比、計(jì)算簡(jiǎn)便”的突出優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用于中藥制劑的提取工藝等研究中[7-9]。中藥水提工藝一般涉及加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)4個(gè)最重要的因素[10]。本研究采用正交試驗(yàn)法，對(duì)以上4個(gè)因素進(jìn)行了考察篩選，綜合各指標(biāo)和經(jīng)濟(jì)效益確定出最佳提取工藝參數(shù)為：總加水量為15倍生藥量，浸泡時(shí)間為0.5 h，共煎煮3次，每次煮沸0.5 h。

本品處方中，黃芩苦寒，歸肺、胃、大腸、膽四經(jīng)，具清熱燥濕、瀉火解毒之功，尤長(zhǎng)于清肺熱。金銀花味甘性寒，入肺胃心脾四經(jīng)，清熱解毒、涼散風(fēng)熱，清熱之中有輕微宣散之功，可助黃芩宣散肺熱。黃芩的主要活性成分為黃芩苷[11，12]，金銀花的主要活性成分為綠原酸[13，14]，二者均是重要的生物活性物質(zhì)，因此將黃芩苷、綠原酸確定為考核指標(biāo)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化的工藝條件可滿足本品中干膏量、綠原酸含量、黃芩苷含量的質(zhì)量要求。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 馬秀璟，張永文，周剛.淺談中藥新藥工藝研究及其對(duì)質(zhì)量控制的意義[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008（6）：557-559.

[2] 殷明陽(yáng)，劉素香，張鐵軍，等.復(fù)方中藥提取工藝研究概況[J].中草藥，2015，46（21）：3279-3283.

[3] 王新鳳，蘇婷婷，傅春升.連參滴丸制備工藝的優(yōu)選[J].山東醫(yī)藥，2015，55（38）：88-90.

[4] 高天曙，王會(huì)麗，趙義紅.多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選清熱解毒口服液的提取工藝[J].中國(guó)生化藥物雜志，2015，35（7）：141-144.

[5] 祁俊，朱應(yīng)成，劉亮鏡，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選歸芪益氣養(yǎng)血合劑的水煎工藝[J].中國(guó)生化藥物雜志，2015，35（10）：151-154.

[6] 李奉勤，史冬霞，馬振嗣，等.正交設(shè)計(jì)在中藥制粒工藝研究中的應(yīng)用概況[J].中國(guó)藥業(yè)，2006，15（13）：67-68.

[7] 郭澄，張純，林厚文，等.正交試驗(yàn)在中藥制劑研究中應(yīng)用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2000， 11（4）：360-362.

[8] 李碧淵，吳鑫，曹崗.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選桂枝和肉桂配伍后揮發(fā)油的最佳提取工藝[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2015（5）：520-521.

[9] 陳貝貝，仝燕，馬振山，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選芪術(shù)顆粒提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（5）：46-49.

[10]鄭奪，張婷，陳冠，等.多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選養(yǎng)心顆粒制備工藝[J].藥物分析雜志， 2015（7）：1218-1222.

[11]王雅芳，李婷，唐正海，等.中藥黃芩的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015（1）：206-211.

[12]雷芳.黃芩苷藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，19（15）：87-88.

[13]李杰，王學(xué)廷，吳銀萍，等.金銀花中綠原酸提取方法的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（16）：4969-4970.

[14]王麗萍，郭棟，王果，等.中藥綠原酸的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2011， 22（4）：961-963.