馬爽 于國營 郭莉莉 宋新宇 程增青 郭玉廣 范根成 （易邦生物工程有限公司 266114）

我國局部豬胸膜肺炎流行調(diào)查和血清型分析

馬爽 于國營 郭莉莉 宋新宇 程增青 郭玉廣 范根成 （易邦生物工程有限公司 266114）

為了解我國豬傳染性胸膜肺炎的流行情況及其病原胸膜肺炎放線桿菌 （Actinobacillus Pleurnopneumoniae，簡稱APP）的主要血清型，1990年～2014年我們對我國23省市不同養(yǎng)豬場進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查。調(diào)查結(jié)果表明，該病在我國23個(gè)省市均有發(fā)生，先后從山東、深圳、上海、河北、江蘇、河南等省、市的臨床病例和送檢病料中分離到APP病原62株，其中已鑒定、定型的菌株59株，所涉及的型株為1型4株、2型11株、3型3株、5型18株、7型19株、8型1株、未定型3株。根據(jù)我們對全國流行病學(xué)調(diào)查和病原分離鑒定各型分離株的多少及其毒力的強(qiáng)弱比較分析，本病危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要血清型為7型、5型和1型。

豬；傳染性胸膜肺炎；流行病學(xué)調(diào)查；血清型；我國局部地區(qū)

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌引起的一種接觸性傳染病，是豬的一種重要呼吸道疾病，在許多養(yǎng)豬國家流行，已成為世界性工業(yè)化養(yǎng)豬的五大疫病之一[1]，在我國1988年農(nóng)業(yè)部青島動檢所朱士盛等人從403份加拿大進(jìn)口豬血清中檢出23頭APP陽性豬[2]。為了解其流行情況，故開展了此次流行病學(xué)調(diào)查并進(jìn)行了分析。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果如下。

1 材料

1.1 病料

采集山東、深圳、上海和河南等省市發(fā)病死亡豬肺、氣管、肺門淋巴結(jié)等組織。

1.2 菌株

APP1～9型國際參考株由瑞士伯恩大學(xué)獸醫(yī)細(xì)菌研究所J.Nicolet教授惠贈，APP10～12型國際參考株由丹麥獸醫(yī)學(xué)血清實(shí)驗(yàn)室R.Nielsen博士惠贈；雞表皮葡萄球菌由澳大利亞Bendego地區(qū)獸醫(yī)研究所惠贈。

1.3 陽性血清和抗原

APP1～12型陽性血清和ELISA抗原，均由青島易邦生物工程有限公司制備。

1.4 培養(yǎng)基

血瓊脂、S瓊脂、S肉湯等培養(yǎng)基均由青島易邦生物工程有限公司制備。

1.5 微量生化鑒定管

購自杭州微生物試劑有限公司。

1.6 PCR檢測引物

上游引物:5’-TGGCACTGACGGTGATGA-3’，下游引物:5’-GGCCATCGACTCAACCAT-3’，產(chǎn)物大小約為442bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.7 PCR檢測試劑

rTaq酶等PCR檢測試劑套裝、DL2000Marker等PCR檢測試劑購自TaKaRa。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.8 試驗(yàn)豬

5～6周齡健康易感仔豬購自青島平度某健康豬場（APP1～12型ELISA抗體均為陰性）。

2 流行病學(xué)調(diào)查

2.1 血清學(xué)調(diào)查

1990～2014年，我們對我國部分省市無豬傳染性胸膜肺炎疫苗免疫背景的雜交豬血樣抽檢進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，采用ELISA試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測。

2.2 病原學(xué)調(diào)查

2.2.1 細(xì)菌分離

采集發(fā)病豬鼻腔分泌物，或病死豬肺、氣管、肺門淋巴結(jié)等組織，分別接種于S瓊脂培養(yǎng)基上，置5～10%CO2條件下， 37℃培養(yǎng) 16～18h。

2.2.2 細(xì)菌鑒定

（1）形態(tài)觀察。挑取疑似菌落涂片經(jīng)革蘭氏染色，置顯微鏡油鏡下觀察其形態(tài)。然后將疑似菌落純化培養(yǎng)，進(jìn)行下列試驗(yàn)。

（2）生化特性。挑取疑似菌落按常規(guī)方法進(jìn)行溶血性試驗(yàn)、 “衛(wèi)星現(xiàn)象”、CAMP試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)，包括葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇、乳糖、阿拉伯膠糖及棉子糖，試驗(yàn)中同時(shí)用Shope4074株參考株作對照，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

（3）分子生物學(xué)鑒定。分別將分離菌株的16～18hS肉湯培養(yǎng)物經(jīng)過熱處理制備PCR模板。利用上游引物:5’-TGGCACTGACGGTGATGA-3’， 下游 引物:5’ -GGCCATCGACTCAACCAT-3’進(jìn)行PCR鑒定。

（4）血清學(xué)特性鑒定。應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法進(jìn)行血清學(xué)特性鑒定。

（5）部分分離株的動物回歸試驗(yàn)。取分離株HT株 （血清1型）、SZ株 （血清5型）、DY株 （血清7型）、SZ4株（血清2型）進(jìn)行動物回歸試驗(yàn)。分別將分離菌株的16～18hS肉湯培養(yǎng)物3ml滴鼻攻擊5～6周齡健康易感仔豬，每株攻毒菌液的活菌量分別調(diào)節(jié)約為1×106CFU/頭、1×107CFU/頭和5×107CFU/頭，每個(gè)菌株的不同劑量組均攻擊5頭仔豬，另設(shè)同條件對照5頭，觀察14日內(nèi)攻毒仔豬發(fā)病情況。

3 結(jié)果

3.1 豬傳染性胸膜肺炎血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

1990～2014年對我國部分省市雜交豬進(jìn)行了的血清學(xué)調(diào)查，調(diào)查結(jié)果見表1。

3.2 病原學(xué)的調(diào)查結(jié)果

3.2.1 細(xì)菌分離

從23個(gè)省市50多個(gè)發(fā)病豬場，采集132份病料進(jìn)行細(xì)菌分離，共分離到疑似豬胸膜肺炎放線桿菌62株。

3.2.2 細(xì)菌鑒定

（1）形態(tài)觀察。分別挑取分離菌62株培養(yǎng)16～18h疑似菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢均為陰性，呈小桿菌、球桿菌，也可見絲狀菌體等多形態(tài)。

（2）生化特性。經(jīng)純化培養(yǎng)的62株疑似菌株經(jīng)溶血性試驗(yàn)、 “衛(wèi)星生長現(xiàn)象”、CAMP試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)均為陽性，均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇，不發(fā)酵乳糖、阿拉伯膠糖、棉子糖。

（3）培養(yǎng)特性。所有分離菌株在含有V因子和滅活雞血清的S肉湯培養(yǎng)基中生長呈均勻一致混濁。所有分離菌株接種于S瓊脂培養(yǎng)基上于5～10%CO2條件下，37℃培養(yǎng)16～18h，形成直徑達(dá)1mm左右，圓形、邊緣整齊、半透明呈露珠狀的灰白色菌落，于折射光下觀察具有虹彩光澤。在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上不生長。

表1 我國23個(gè)省、市雜交豬APP血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

（4）分子生物學(xué)鑒定。分別制備62株分離菌株模板進(jìn)行PCR檢測，均能擴(kuò)增出長約442bp的特異性DNA片段。部分分離菌株電泳圖像如圖1所示。

圖1 部分分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果

（5）血清學(xué)特性鑒定。對62株分離株進(jìn)行血清學(xué)特性鑒定，結(jié)果其中3株未能定型，已定型的59株中包括血清1型4株、血清2型11株、血清3型3株、血清5型18株、血清7型19株、血清8型1株。結(jié)果見表2。

表2 1990～2014年我國APP分離菌及型株鑒定統(tǒng)計(jì)表

3.2.3 部分分離株動物回歸試驗(yàn)

HT株 1×107CFU/頭、 5×107CFU/頭劑量組均能使攻毒仔豬全部發(fā)病，SZ株和DY株只有5×107CFU/頭劑量組能使攻毒仔豬全部發(fā)病，所有發(fā)病豬的臨床表現(xiàn)為呼吸加快，采食量下降，體溫升高0.5℃以上，持續(xù)1～5d；死亡豬從口鼻腔流出帶紅色泡沬樣血水，剖檢見胸腔、心包內(nèi)積液、肺腫大出血、肺表面附有纖維素性滲出，并與胸腔發(fā)生粘連 （如圖2如示）；而SZ4株各攻毒組仔豬均未發(fā)病，未呈現(xiàn)臨床癥狀，剖檢均無明顯病變 （如圖3所示）；對照豬均未發(fā)病，剖檢各臟器均正常。

圖2 攻毒發(fā)病豬肺

4 討論與分析

（1）哈爾濱獸醫(yī)研究所于1987年發(fā)現(xiàn)臨診病例，并通過病原分離鑒定、病原菌血清分型、人工復(fù)制病變及血清學(xué)檢查等，證明App在我國的存在和流行，楊旭夫于1990年對此進(jìn)行了報(bào)道[3]。此后陸續(xù)許多省市都有關(guān)于發(fā)病的報(bào)道。通過我們對本病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明本病已在我國各規(guī)模化養(yǎng)豬場普遍存在，而且血清陽性檢出率逐年具有上升趨勢。1990～2014年對我國23個(gè)省市的雜交豬35474份血樣檢測結(jié)果陽性4663頭，陽性率平均為13.1%。

（2）我們在豬傳染性胸膜肺炎病原學(xué)調(diào)查中獲得APP分離株62株，其中59株已經(jīng)定型，根據(jù)我們對我國部分省市進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查，病原的分離鑒定、定型[4]和毒力試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，當(dāng)前給我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展帶來危害的豬傳染性胸膜肺炎的主要流行型為7型、5型和1型，應(yīng)引起養(yǎng)殖界和研究學(xué)者們的關(guān)注。

圖3 攻毒未發(fā)病豬肺

[1]陳小玲,楊旭夫,朱士盛.豬傳染性胸膜肺炎的流行現(xiàn)狀和防制措施[J].中國獸醫(yī)雜志,2001（7）:33-35.

[2]朱士盛,蔡衛(wèi)端,杜華宏,等.進(jìn)口豬嗜血桿菌胸膜肺炎血清學(xué)檢查[J].中國畜禽傳染病,1988（1）:31-32.

[3]楊旭夫,彭發(fā)泉.胸膜肺炎嗜血桿菌的分離和鑒定[J].中國畜禽傳染病,1990（4）:1-3.

[4]朱士盛,杜文金,王新,等.豬傳染性胸膜肺炎HT株的分離、鑒定與定型試驗(yàn)[J].中國動檢,1999（2）:7-8.