分子模擬方法研究四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物對(duì)GSK3β和CDK5的選擇性

董珂珂　楊雪雨　趙騰騰　朱小蕾

(南京工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009)

分子模擬方法研究四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物對(duì)GSK3β和CDK5的選擇性

董珂珂楊雪雨趙騰騰朱小蕾＊

(南京工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009)

本文通過(guò)分子對(duì)接，分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD)和MM/PBSA能量計(jì)算的方法，從分子水平研究了3個(gè)四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物與CDK5和GSK3β的相互作用，并揭示了這些抑制劑對(duì)GSK3β的選擇性抑制機(jī)理。分子對(duì)接結(jié)果表明，抑制劑對(duì)2種激酶具有相似的結(jié)合模式，結(jié)合口袋處的殘基也都根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)相互對(duì)應(yīng)。研究體系的RMSD隨時(shí)間的穩(wěn)定變化，表明模擬體系已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，因而后續(xù)的分析是可靠的。CDK5/抑制劑體系，RMSD在0.15 nm上下波動(dòng)，CDK5/M1和CDK5/M2骨架輕微波動(dòng)，稍高于CDK5/M3；而GSK3β體系的RMSD值略高于CDK5體系，在0.17 nm上下波動(dòng)，GSK3β/M1和GSK3ββ/M2的骨架波動(dòng)平衡值則稍低于GSK3β/M3?；钚暂^大的抑制劑增強(qiáng)了蛋白骨架整體的“柔性”，即對(duì)激酶構(gòu)象產(chǎn)生一定影響。能量分析表明，靜電能和范德華作用能夠區(qū)分不同抑制劑對(duì)同種激酶的生物活性差異。極性溶劑化自由能對(duì)區(qū)分抑制劑選擇性也很重要，殘基分解表明GSK3β的Glu97、Thr138是造成抑制劑選擇性的主要原因。抑制劑與CDK5和GSK3β結(jié)合的過(guò)程中，蛋白質(zhì)殘基的動(dòng)態(tài)相關(guān)性存在差異，鉸鏈區(qū)域的Thr138與Val135～Gln206區(qū)域殘基正相關(guān)，證實(shí)Thr138殘基是區(qū)分抑制劑選擇性的關(guān)鍵。

四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物；分子動(dòng)力學(xué)模擬；選擇性；穩(wěn)定性

許多人類疾病通常都是由蛋白異常磷酸化所引起的。人類基因組中包含518種蛋白激酶，其中細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(CDKs)和糖原合成激酶-3(GSK3)都屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族[1]，由于兩種激酶在大多數(shù)病理學(xué)中頻繁出現(xiàn)的反?，F(xiàn)象而引起關(guān)注。CDKs包含一個(gè)特定的絲氨酸/蘇氨酸催化位點(diǎn)，與調(diào)控分子的周期蛋白亞基一起控制激酶活性和亞基的特異性，能夠調(diào)控細(xì)胞周期循環(huán)的G1期、M期、S期、G2期的相互轉(zhuǎn)換以及影響其他酶的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞分裂[2-4]，因此在細(xì)胞循環(huán)中起著重要作用。GSK3激酶由兩種單獨(dú)的基因編譯分別得到-α和-β兩種形式的激酶，通過(guò)磷酸化多種蛋白酶，參與多種生物學(xué)過(guò)程如干細(xì)胞自我更新、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、生理節(jié)奏、轉(zhuǎn)錄和胰島素作用，其反常調(diào)節(jié)導(dǎo)致了許多代謝紊亂，神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如雙向性精神障礙、精神分裂癥和阿爾茲海默病(AD)等)以及癌癥的發(fā)生[5-8]。GSK3的兩種亞型激酶結(jié)構(gòu)相似，但作用不同，GSK3活性的抑制通過(guò)保守性絲氨酸殘基GSK3α的Ser21和GSK3β的Ser9的磷酸化控制[9]，在ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位點(diǎn)處也有氨基酸的差異(GSK3α的Glu196和GSK3β的Asp133)。

然而，神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，阿爾茲海默病是癡呆的最為普遍的形式，世界衛(wèi)生組織報(bào)道2015年，全世界近480萬(wàn)人患上AD病，其主要病理為由tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)[10]，β淀粉樣多肽(Aβ)沉積導(dǎo)致的老年斑等有毒特性以及由神經(jīng)元突觸和整個(gè)神經(jīng)元缺失引起的腦萎縮[7]。而GSK3β的活化結(jié)構(gòu)在AD患者中被發(fā)現(xiàn)，與聚集成雙螺旋絲的tau蛋白中tau的過(guò)度磷酸化直接相關(guān)[11]。當(dāng)GSK3β被激活時(shí)，阿爾茲海默病患者的記憶能力衰退，影響突觸可塑性，損傷突觸的形態(tài)和功能[12]，同時(shí)還參與胞內(nèi)和胞外通道，包括wnt信號(hào)和胰島素信號(hào)通道，以及G-蛋白偶聯(lián)受體和其他蛋白酶，主要通過(guò)磷酸化影響。另外，CDK5，作為CDKs家族的一員，不同于其他細(xì)胞周期素依賴性激酶涉及到細(xì)胞的增殖，細(xì)胞分裂等，其與激活因子p35和p39結(jié)合在神經(jīng)元中達(dá)到高的活性，與通過(guò)鈣蛋白酶剪切得到的p25結(jié)合后導(dǎo)致CDK5的過(guò)度活化，導(dǎo)致AD病的發(fā)生；而相反CDK5的缺失則會(huì)抑制過(guò)度興奮，減少焦慮和記憶損傷[13]；CDK5與GSK3β類似在神經(jīng)系統(tǒng)，突觸信號(hào)傳導(dǎo)以及學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。幾個(gè)引起AD的因素如發(fā)炎和氧化應(yīng)激也能夠?qū)е翪DK5活性增加?？偟恼f(shuō)來(lái)，這些研究都強(qiáng)有力地表明CDK5與GSK3β在許多神經(jīng)類疾病中都起著重要作用，目前都已成為治療多種病癥的重要靶標(biāo)和新藥開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。

由于CDKs與GSK3β的結(jié)構(gòu)相似性，不難發(fā)現(xiàn)大多數(shù)GSK3β的抑制劑同樣抑制CDKs，如Indirubin(靛玉紅類)[15]、Aloisines[16]、Hymenialdisine (生物堿類)[17]等。配體誘導(dǎo)的靶標(biāo)蛋白來(lái)調(diào)控其活性在癌癥中已經(jīng)成為有效的治療策略，然而受限于許多因素包括較差的靶向特異性和低的抑制潛能，選擇具有選擇性抑制劑能夠克服藥物抗性，減少毒副作用等[18]。目前研究的GSK3β而非CDK5的選擇性抑制劑有：Pyrazines(吡嗪類)[19]、Paullones(苯醌類)[20]和Valmerins(吡啶并吲哚酮類)[21-22]等。由于對(duì)GSK3β的選擇性機(jī)理并不明確也使得選擇性抑制劑的開(kāi)發(fā)變得緩慢，并且實(shí)驗(yàn)無(wú)法從分子水平詳細(xì)解釋，這就需要通過(guò)計(jì)算來(lái)解決。Dessalew等[23]用3D-QSAR和分子對(duì)接的方法研究了Bisarylmaleimide(二苯馬來(lái)酰亞胺)對(duì)于GSK3β的選擇性抑制，而對(duì)CDK2和CDK4活性較弱，通過(guò)打分評(píng)價(jià)了選擇性的定量差異以及與實(shí)驗(yàn)的一致性。Chen等[20]用動(dòng)力學(xué)模擬以及能量計(jì)算的方法研究了苯醌類抑制劑對(duì)于GSK3的選擇，計(jì)算表明了該抑制劑與GSK3的Val135殘基比與CDK5的Cys83殘基有更強(qiáng)的相互作用，同時(shí)與CDK5的Asp86殘基的相互作用較弱，導(dǎo)致了抑制劑的特異性，結(jié)構(gòu)間的差異分析較少。然而吡啶并吲哚酮類抑制劑對(duì)GSK3β有較大的選擇性，但機(jī)理并不清楚。

本文用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、MM/PBSA (GBSA)能量計(jì)算，以及殘基間相互作用分析的方法首次深入研究由Rajaa Boulahjar合成的四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物[21]為什么對(duì)GSK3β抑制，而對(duì)結(jié)構(gòu)和功能相似的CDK5卻有較低的抑制活性。這對(duì)于潛在的結(jié)構(gòu)修飾以及開(kāi)發(fā)更具潛力和選擇性的GSK3β的吡啶并吲哚酮抑制劑提供深入的指導(dǎo)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1配體和受體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

利用3D畫(huà)圖軟件構(gòu)建3個(gè)四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物(圖1)，并在B3LYP/6-31G(d)水平上用Gaussian 09軟件[24]進(jìn)行優(yōu)化得到最優(yōu)結(jié)構(gòu)。通過(guò)Amber軟件[25]的Antechamber模塊擬合限制性靜電勢(shì)得到原子電荷以及其他的力場(chǎng)參數(shù)等，這種方法在許多文獻(xiàn)[26-28]中被證明是有效的。CDK5(Met1～Pro292)和GSK-3β(Ser35～I(xiàn)le384)的晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(the protein data bank)得到，PDB ID分別為1UNL[29]和2O5K[30]，分辨率為0.20 nm，刪除其中的水分子和抑制劑分子。CDK5的晶體結(jié)構(gòu)為CDK5/p25二聚體，因此僅選取A鏈的CDK5和D鏈的p25作為對(duì)接的初始結(jié)構(gòu)，以下簡(jiǎn)寫(xiě)為CDK5。

圖1　3個(gè)GSK3β選擇性抑制劑的結(jié)構(gòu)和IC50[21]值Fig.1　Structures and in vitro activity of three specific inhibitors of GSK3β

1.2分子對(duì)接

小分子配體與受體的相互作用首先通過(guò)分子對(duì)接研究。分子對(duì)接采用Autodock4.0程序的半柔性對(duì)接方法，將極性氫原子添加到蛋白質(zhì)的各個(gè)殘基上，配體的鍵可自由旋轉(zhuǎn)，受體則為剛性。將格點(diǎn)盒子的中心設(shè)在兩種激酶的ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位點(diǎn)處，以使配體對(duì)接到此處，格點(diǎn)盒子大小設(shè)為90× 90×90，間隔為0.037 5 nm，用遺傳算法共進(jìn)行200次獨(dú)立對(duì)接計(jì)算，其他參數(shù)默認(rèn)，根據(jù)均方根偏差(RMSD)在0.20 nm范圍的標(biāo)準(zhǔn)聚類分析，得到最優(yōu)構(gòu)象。且分別與含有R-roscovitine抑制劑的CDK5復(fù)合物(1UNL)，和含有抑制劑GSK3β的復(fù)合物比對(duì)，RMSD值都在0.10 nm內(nèi)，因此證明對(duì)接結(jié)構(gòu)也是合理的，為后續(xù)的MD分析奠定基礎(chǔ)。

1.3分子動(dòng)力學(xué)模擬

在分子對(duì)接的基礎(chǔ)上，3個(gè)小分子抑制劑與兩種激酶形成的6個(gè)復(fù)合物體系采用Amber10[25]的Sander和Pmemd模塊進(jìn)行MD模擬。與許多研究者[20,23,31-33]一樣，本文配體和受體分別采用GAFF力場(chǎng)[34]和AMBERFF03力場(chǎng)[35]，每個(gè)體系都融入被截?cái)嗟陌嗣骟w的TIP3P水分子類型[36]的水盒子中，復(fù)合物與盒子邊界的最短距離為1 nm。氫原子通過(guò)LEaP模塊添加，殘基的質(zhì)子化狀態(tài)在中性的pH值下采用默認(rèn)，并添加抗衡離子(Na+或Cl-)使體系電荷呈中性。每個(gè)體系的能量最小化采用2 000步的最小化法和2 000步的共軛梯度法，非鍵截?cái)喟霃皆O(shè)為1 nm。MD模擬過(guò)程主要包括200 ps的41 840 kJ·mol-1·nm-2)限制性加熱(0～300 K)，200 ps的密度平衡，200 ps的平衡以及在NPT系綜(P=101 kPa，T=300 K)下，時(shí)間步長(zhǎng)為0.002 ps的20 ns未加限制的MD模擬。通過(guò)SHAKE算法[37]對(duì)氫原子在內(nèi)的所有鍵固定，用Particle-mesh Ewald(PME)方法[38]處理長(zhǎng)程靜電相互作用。MD軌跡坐標(biāo)每1 ps保存一次用于每個(gè)體系的結(jié)構(gòu)和能量分析。

1.4結(jié)合自由能計(jì)算

分子動(dòng)力學(xué)模擬之后，通過(guò)每個(gè)體系的骨架原子的RMSD來(lái)評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。然后通過(guò)MM/PBSA (GBSA)方法[39]，取穩(wěn)定后的5 ns的軌跡，提取200個(gè)構(gòu)象對(duì)抑制劑與兩種激酶的結(jié)合自由能計(jì)算來(lái)研究結(jié)合親和力的差異以及相同抑制劑與不同激酶的能量差異研究抑制劑選擇性。每個(gè)快照(snapshot)，配體與受體結(jié)合自由能差(ΔGbind)可表述為：

其中ΔGcomplex、ΔGprotein和ΔGligand)分別代表復(fù)合物、蛋白質(zhì)以及配體的自由能。結(jié)合自由能又可分解為三部分：氣相結(jié)合能(ΔEgas)、溶劑化自由能(ΔGsol)和熵貢獻(xiàn)(TΔS)三部分(方程2)。ΔEgas又可進(jìn)一步分解成靜電能(ΔEele)和范德華作用能(ΔEvdw)(方程3)。溶劑化自由能(ΔGsol)可以分為兩部分：極性溶劑化自由能(ΔGpolar)和非極性溶劑化自由能(ΔGnonpolar)(方程4)。極性溶劑化自由能通過(guò)amber10中的pbsa模塊解線性的PB(Poisson-Boltzmann)方程得到，溶劑探針半徑設(shè)為0.14 nm。溶質(zhì)和溶劑的介電常數(shù)分別設(shè)為1和80。通過(guò)用Molsurf方法，可以得到溶劑可及表面積(SASA)，將溶劑參數(shù)γ和β分別設(shè)為0.226 77 kJ·mol-1·nm-1)和3.85 kJ·mol-1來(lái)計(jì)算非極性溶劑化自由能(ΔGnonpolar)(方程5)。由于抑制劑的選擇性主要在于CDK5和GSK3β之間的相似度，以及結(jié)合位點(diǎn)附近的殘基的差異。通過(guò)Clustal omega[24]軟件我們得到兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，兩種激酶的序列一致性為29.0%，相似度為45.4%。另一方面，抑制劑對(duì)激酶的選擇性差異也在于兩種激酶相似位置的殘基對(duì)極性溶劑化自由能的貢獻(xiàn)差值，可以表述為(方程6)。一般說(shuō)來(lái)，對(duì)于較大的體系計(jì)算熵非常耗時(shí)，并且對(duì)于相似的受體來(lái)說(shuō)小分子的結(jié)合導(dǎo)致的熵變很接近[40-41]，為減少計(jì)算成本，許多文獻(xiàn)在計(jì)算過(guò)程都忽略了熵變[42-44]，本文我們也忽略熵變。

1.5動(dòng)態(tài)相關(guān)性分析

為了評(píng)價(jià)不同蛋白區(qū)域之間的動(dòng)態(tài)相關(guān)性，對(duì)3個(gè)抑制劑分別與CDK5和GSK3β結(jié)合的6個(gè)體系進(jìn)行了動(dòng)態(tài)相關(guān)性Dynamic Cross-Correlation Map(DCCM)分析[45-46]。兩個(gè)原子i和j之間的相關(guān)系數(shù)Cij定義為：

其中ΔRi表示第i個(gè)原子相對(duì)于它的平均位置的瞬時(shí)波動(dòng)。正相關(guān)表示殘基以相同的方向運(yùn)動(dòng)，Cij=1；負(fù)相關(guān)表示殘基以相反方向運(yùn)動(dòng)，Cij=-1。整個(gè)20 ns模擬過(guò)程中，最低能量結(jié)構(gòu)用于DCCM分析。PyMol v1.8軟件[47]用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作圖分析。

2　結(jié)果與討論

2.1對(duì)接構(gòu)象結(jié)合模式

3個(gè)四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物抑制劑對(duì)接到CDK5和GSK3β的ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合口袋中(圖2)，發(fā)現(xiàn)兩者具有相似的折疊結(jié)構(gòu)，且結(jié)合位點(diǎn)也非常相似，都有一個(gè)很大的空腔，由周?chē)鷼埢?CDK5：I10、C83、L133和N144；GSK3β：I62、V135、L188和D200)包圍，主鏈原子疊合得都很好，與晶體結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)一致[20]。由圖2可知，在3個(gè)抑制劑與CDK5的對(duì)接結(jié)構(gòu)中，3個(gè)抑制劑都處于由殘基Ile10、Glu12、Gly13、Val18、Ala31、Glu81、Phe82、Cys83、Asp84、Asp86、Gln130、Leu133和Asn144組成的疏水口袋中。與之相比，與GSK3β對(duì)接的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，3個(gè)抑制劑位于由Ile62、Val70、Ala83、Asp133、Tyr134、Val135、Pro136、Gln185、Asn186、Leu188和Asp200組成的疏水性口袋中，這與其他文獻(xiàn)的對(duì)接研究結(jié)果一致[48]。值得注意的是，CDK5與M1和M2的相互作用殘基都有Lys33、Gln85、Lys89，而CDK5/M3復(fù)合物中則沒(méi)有，另外，小分子M1周?chē)腃DK5殘基數(shù)目相比M2和M3也是最多的。說(shuō)明這幾個(gè)殘基對(duì)于抑制劑與激酶的結(jié)合比較關(guān)鍵，相應(yīng)地，GSK3β的Lys85、Glu137、Arg141殘基也有此功能。

2.2體系的穩(wěn)定性和柔性分析

由對(duì)接構(gòu)象可知，抑制劑與激酶之間形成的氫鍵作用使得復(fù)合物體系更加穩(wěn)定。結(jié)合抑制劑不同結(jié)構(gòu)構(gòu)象也有差異，且抑制劑與激酶結(jié)合過(guò)程也是動(dòng)態(tài)的，這也造成了動(dòng)力學(xué)特性包括穩(wěn)定性和柔性發(fā)生變化，結(jié)合自由能也由于抑制劑活性與選擇性的不同而不同。因此，本文對(duì)3個(gè)抑制劑與CDK5和GSK3β結(jié)合的6個(gè)體系在300 K下進(jìn)行了20 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。在15 ns后，6個(gè)體系均達(dá)到平衡(圖3)。因而后續(xù)的能量和結(jié)構(gòu)分析是可靠的。對(duì)CDK5/抑制劑體系，RMSD在0.15 nm上下波動(dòng)，CDK5/M1和CDK5/M2骨架輕微波動(dòng)，稍高于CDK5/M3，表明活性較大的抑制劑增強(qiáng)了蛋白骨架的“柔性”；而對(duì)GSK3β體系，RMSD在0.17 nm上下波動(dòng)，GSK3β/M1和GSK3β/M2的骨架波動(dòng)平衡值則稍低于GSK3β/M3。這表明3個(gè)抑制劑對(duì)2個(gè)激酶體系的活性差異有著不同機(jī)理。

圖2　CDK5/抑制劑(藍(lán)色)和GSK3β/抑制劑(紅色)對(duì)接后結(jié)構(gòu)中ATP結(jié)合口袋的疊加Fig.2　Superimposition of the ATP-binding pocket of the CDK5/inhibitor(blue)and GSK3β/inhibitor(red)structures after dock

蛋白質(zhì)柔性也由平均結(jié)構(gòu)的均方根波動(dòng)(RMSF)來(lái)評(píng)判，通過(guò)RMSF值也可以判斷MD模擬過(guò)程是否收斂。本文我們計(jì)算了6個(gè)體系的蛋白質(zhì)骨架原子上的RMSF值，結(jié)果如圖4所示?？傮w上，所有體系的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)晶體結(jié)構(gòu)的RMSF值(由B-factor換算得到)分布基本一致。兩種蛋白質(zhì)柔性略有差異，而3個(gè)抑制劑與兩種激酶的結(jié)合位點(diǎn)處的RMSF值相比幾乎沒(méi)變化，都略小于實(shí)驗(yàn)中CDK5的RMSF值，表明活性區(qū)域有較高的剛性，活性越大，剛性也越強(qiáng)。GSK3β結(jié)構(gòu)符合觀察到的“活化片段”蛋白激酶，包含一個(gè)N端的β-sheet區(qū)域和一個(gè)C端的α-helical區(qū)域。7個(gè)反平行的β折疊形成一個(gè)封閉的正交桶狀結(jié)構(gòu)，即N端(Ser35～Tyr134)，其中在3個(gè)抑制劑與GSK3β結(jié)合的復(fù)合物中較為顯著的β5和β6連接的loop區(qū)域(Ser119～Glu125)，因其活性不同表現(xiàn)了不同的柔性，GSK3β/M3的RMSF值最高，柔性最大；參與催化活化區(qū)域(Gly210～Arg220)無(wú)論磷酸化與否，結(jié)構(gòu)都處于活化狀態(tài)[49]，從圖4中也可以看出與3個(gè)抑制劑結(jié)合都表現(xiàn)了很強(qiáng)的剛性；結(jié)構(gòu)可塑性延伸的loop區(qū)域(Asn285～His299)的柔性變化也與抑制劑活性相關(guān)，正如Dajani等[50]研究的axin和FRAT抑制劑與GSK3β結(jié)合造成的柔性不同，我們發(fā)現(xiàn)活性越大，剛性越強(qiáng)。側(cè)鏈殘基Ile62(G-loop區(qū)域)和Hinge區(qū)域的Val135殘基的柔性變化都不大。這些區(qū)域?qū)τ谝种苿┑倪x擇性也有一定的影響。抑制劑翻轉(zhuǎn)或者其他構(gòu)象改變引起的范德華或靜電作用將對(duì)結(jié)合有一定影響。

圖3　GSK3β和CDK5兩激酶與3個(gè)抑制劑形成的復(fù)合物的RMSD值隨時(shí)間的變化Fig.3　RMSD of backbone atoms of two kinases(GSK3β and CDK5)with three inhibitors as a function of time

圖4　CDK5(左)和GSK3β(右)的每個(gè)殘基主鏈原子對(duì)應(yīng)的RMSF變化Fig.4　Root-mean-squared fluctuation(RMSF)of the backbone atoms of each amino acid residue of CDK5(left)and GSK3β(right)

回旋半徑是蛋白質(zhì)致密性(compactness)的一個(gè)指標(biāo)[51-52]，為了更直觀地從整體上了解抑制劑對(duì)蛋白質(zhì)分子尺寸的影響，本文通過(guò)回旋半徑(Radius of Gyration，Rg)的計(jì)算研究了CDK5和GSK3β兩種激酶殘基的致密程度。CDK5/抑制劑復(fù)合物的回旋半徑平均值為2.364 nm±0.005 nm，這與前人計(jì)算得到的CDK5/p25/roscovitine復(fù)合物體系的Rg(2.384 nm±0.008 nm)，CDK5/p25的Rg(2.360 nm±0.008 nm)較一致，同時(shí)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Rg(CDK5/p25/roscovitine)：2.347 nm)[53]也沒(méi)有很大差異。GSK3β/抑制劑體系的Rg平均值為2.145 nm±0.008 nm，3個(gè)體系Rg值較為類似，但稍小于CDK5體系，這也是由于CDK5/ p25蛋白質(zhì)殘基數(shù)目較多導(dǎo)致的。結(jié)果表明兩種激酶體系并未因?yàn)橐种苿┑慕Y(jié)合而導(dǎo)致蛋白質(zhì)殘基的致密性發(fā)生變化，模擬過(guò)程中蛋白也是穩(wěn)定的。

2.3抑制劑對(duì)CDK5和GSK3β的生物活性

抑制劑與激酶的結(jié)合自由能計(jì)算是衡量抑制劑活性的重要方法，且計(jì)算得到的結(jié)合自由能與實(shí)驗(yàn)活性值比較更進(jìn)一步判斷計(jì)算的適用性和準(zhǔn)確性。MM/PBSA方法和MM/GBSA方法是計(jì)算結(jié)合自由能的常用方法，許多研究工作者用MM/PBSA的方法計(jì)算結(jié)合自由能[39,54-55]，且研究證明MM/PBSA方法比MM/GBSA方法更加準(zhǔn)確[54]。本文我們用MM/PBSA的方法計(jì)算了6個(gè)復(fù)合物體系的結(jié)合自由能以及不同能量項(xiàng)，結(jié)果列在表1中。表1中的能量值，正數(shù)表示這種作用不利于抑制劑與激酶的結(jié)合，負(fù)數(shù)表示這種作用使體系能量降低，有利于結(jié)合，負(fù)數(shù)絕對(duì)值越大，表示這種作用對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)越大。

M1～M3對(duì)CDK5的結(jié)合自由能分別為：-107.57、-89.75、-68.95 kJ·mol-1，與實(shí)驗(yàn)中抑制劑生物活性(IC50值分別為0.13、1.24、1.5 nmol·mL-1)一致；對(duì)GSK3β的結(jié)合自由能分別為：-109.04、-92.72、-91.88 kJ·mol-1，同樣與實(shí)驗(yàn)中的抑制劑抑制活性(IC50值分別為0.076、0.12、0.38 nmol·mL-1) (圖1)[21]相一致。同時(shí)3個(gè)抑制劑也表現(xiàn)出了對(duì)GSK3β的選擇性。為了深入了解哪部分相互作用引起了抑制劑與2種激酶的結(jié)合，我們分析了各個(gè)能量項(xiàng)對(duì)結(jié)合親和力的貢獻(xiàn)大小。如表1所示，靜電能(ΔEele)、范德華作用項(xiàng)(ΔEvdW)和非極性溶劑化自由能(ΔGnonpolar)對(duì)結(jié)合是有利的。6個(gè)體系中，范德華作用都起主導(dǎo)作用。對(duì)于GSK3β體系，范德華作用能區(qū)分3個(gè)抑制劑的生物活性，而對(duì)CDK5體系，CDK5/M2和CDK5/M3的極性溶劑化自由能可區(qū)分其生物活性。盡管氣相的靜電能(ΔEele)對(duì)結(jié)合是有利的，但也不能完全抵消極性溶劑化自由能(ΔGpolar)對(duì)結(jié)合的不利影響。所有體系的非極性溶劑化自由能差別都不大。

表1　用MM-PBSA方法計(jì)算得到的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的結(jié)合自由能項(xiàng)aTable1　Binding free energy components for the proteininhibitor complexes by using the MM-PBSA methoda

為了深入地研究蛋白質(zhì)的每個(gè)殘基在抑制劑的結(jié)合中發(fā)揮的作用，我們對(duì)每個(gè)殘基進(jìn)行了能量分解。6個(gè)體系分解到每個(gè)殘基的結(jié)合自由能如圖6和圖9所示。圖6中我們列出了能量小于-4.184 kJ·mol-1的殘基，M1與GSK3β的結(jié)合親和力主要作用殘基為I62、Val70、Lys85、Thr138、Leu188和Cys199，M3的關(guān)鍵殘基與M1的類似，而M2的關(guān)鍵殘基則略有不同，Lys85殘基貢獻(xiàn)變小，這可能是因?yàn)镸1與M3結(jié)構(gòu)(用嘧啶基取代M1中的3-溴吡啶基)較為相似，而與M2骨架有較大差別有關(guān)。M2的可旋轉(zhuǎn)鍵較少，有極性基團(tuán)的甲基磺?；?，盡管磺?；汪驶笮∠嗨?，并有相似的電荷分布，但其提供2個(gè)氫鍵受體，在復(fù)合物中，伸向帶正電荷極性Lys85殘基(圖7)，兩者間作用力則較弱。另外，Lys85殘基對(duì)3個(gè)抑制劑結(jié)合的貢獻(xiàn)大小在能量上也體現(xiàn)在靜電作用，其靜電能分別為：-38.79、-14.14、-33.39 kJ·mol-1，這個(gè)差異主要是抑制劑骨架結(jié)構(gòu)不同造成的。

由上述總的自由能和自由能分解項(xiàng)可知，范德華作用主要區(qū)分抑制劑對(duì)GSK3β的生物活性，因此我們計(jì)算了每個(gè)殘基的范德華作用能貢獻(xiàn)，如圖8所示，GSK3β/M1～M3復(fù)合物針對(duì)范德華作用貢獻(xiàn)的關(guān)鍵殘基由活性的減小而減小，計(jì)算所得與實(shí)驗(yàn)測(cè)得的生物活性相符。GSK3β/M1的關(guān)鍵殘基為：Ile62、Val70、Tyr134、Thr138、Arg141、Leu188和Cys199，與兩外兩種復(fù)合物相比，作用主要集中在殘基Ile62、Val70、Leu188和Cys199。與總的結(jié)合能殘基分解相一致。

我們研究的3個(gè)抑制劑對(duì)CDK5和GSK3β兩種激酶都有選擇性，CDK5/M1復(fù)合物體系對(duì)能量的殘基分解顯示的關(guān)鍵殘基要少于GSK3β/M1體系，主要表現(xiàn)在殘基：Gly11、Val18、Phe80、Gln130、Asn131、Leu133和Asn144(圖9)，其中Val18和Leu133幾乎與GSK3β/M1的Val70和Leu188殘基發(fā)揮同樣的作用。CDK5/M1與CDK5/M3的關(guān)鍵殘基相似，說(shuō)明有相似的相互作用，而CDK5/M2中Ile10殘基還對(duì)結(jié)合有較大的貢獻(xiàn)，其他2種復(fù)合物則沒(méi)有。另外Lys33殘基在CDK5/M1中起著不利作用，對(duì)應(yīng)于GSK3β中的Lys85殘基，是區(qū)分選擇性的關(guān)鍵性殘基。

圖6　抑制劑(M1、M2和M3)與GSK3β的每個(gè)殘基之間的相互作用能Fig.6　Interaction energies between inhibitors(M1,M2 and M3)and each individual residue of GSK3β

圖7　3個(gè)復(fù)合物MD后最低能量結(jié)構(gòu)構(gòu)象圖Fig.7　Conformations with lowest energy after MD simulations for three complexes

圖8　抑制劑(M1、M2和M3)與GSK3β復(fù)合物抑制劑-殘基的范德華作用Fig.8　Van der Waals interaction energy of inhibitor-residue pair in GSK3β/inhibitor complexes

由上述圖1和表1的能量項(xiàng)分解可知，盡管M1和M3有著較小的差別，其靜電能和范德華能都能夠區(qū)分其生物活性。對(duì)于M1和M2來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)骨架差異較大，但也能通過(guò)這兩項(xiàng)來(lái)區(qū)分。對(duì)于結(jié)構(gòu)極為相似的抑制劑M1和M3，其范德華作用主要?dú)埢彩窍嗨频?圖10)，其中主要區(qū)分其生物活性的殘基是：Asn131和Asn144。這與后續(xù)的氫鍵分析一致，同時(shí)與M1和M3兩個(gè)抑制劑的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)(M1中的3-溴吡啶基和M3中的嘧啶基的差異)。

前面，我們從能量的角度揭示了靜電作用和范德華作用如何影響抑制劑對(duì)激酶的生物活性。下面我們將更詳細(xì)地分析這些作用對(duì)抑制劑的生物活性的影響。如圖11所示，我們用Ligplot+程序[56]討論2種激酶和抑制劑的結(jié)合模式。CDK5/M1體系中，M1與相鄰殘基形成了2個(gè)穩(wěn)定的氫鍵。一個(gè)形成于M1的連接四氫吡啶并吲哚酮大環(huán)和吡啶環(huán)的骨架氮原子(N14)與Gln130的氧原子之間，另一個(gè)形成于M1中的連接3-溴吡啶基的氮原子(N15)與Gln130的氧原子之間；整個(gè)模擬過(guò)程中氫鍵占有率分別為98.15%和96.62%，鍵長(zhǎng)平均為0.298和0.289 nm，且是穩(wěn)定存在的(圖12)。此外，M1還與周?chē)鷼埢纬闪耸杷饔茫?-溴吡啶基與Glu12、Gln130和Asn144殘基之間的疏水作用；四氫吡啶并吲哚酮大環(huán)則與Ile10、Val18、Ala31、Asp86和Leu133殘基形成疏水作用。而GSK3β的更多的殘基與M1產(chǎn)生疏水作用，3-溴吡啶基與Ile62、Tyr134、Pro136和Arg141；四氫吡啶并吲哚酮大環(huán)與Val70、Ala83、Lys85、Leu132、Tyr134、Pro136、Gln185、Asn186、Leu188和Cys199殘基形成的疏水作用，發(fā)現(xiàn)相同基團(tuán)產(chǎn)生的疏水作用卻是不同的，表明M1與GSK3β結(jié)合時(shí)發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，且對(duì)GSK3β表現(xiàn)出了選擇性。

圖9　抑制劑(M1、M2和M3)與CDK5的每個(gè)殘基之間的相互作用能Fig.9　Interaction energies between inhibitors(M1,M2 and M3)and each individual residue of CDK5

圖10　抑制劑(M1和M3)與CDK5復(fù)合物抑制劑-殘基的范德華作用Fig.10　Van der Waals interaction energy of inhibitor-residue pair in CDK5/inhibitor complexes

圖11　氫鍵和疏水作用二維圖Fig.11　2D representation of hydrogen bond and hydrophobic interaction

M2與CDK5形成了3個(gè)氫鍵，其中2個(gè)是與咪唑基相連的羰基氧原子(O20)和氮原子(N21)分別與Cys83殘基的N原子和Asp86殘基上的氧原子(OD1)之間形成的氫鍵(表2)。另外1個(gè)則是磺酰基的氧原子(O24)與Glu12上的氧原子形成的氫鍵，LigPlot+的氫鍵二維圖顯示M2與GSK3β也形成3個(gè)氫鍵，與M2有疏水作用的殘基相比CDK5來(lái)說(shuō)也是增多的。M3與2種激酶的疏水作用殘基數(shù)目一樣，M3的嘧啶環(huán)與CDK5中的Gly13、Lys33、 Phe80、Asn131和Asn144有疏水作用，而在GSK3β中則是Ile62、Tyr134、Val135、Pro136和Arg141殘基，與CDK5中殘基Lys33序列比對(duì)的GSK3β中的殘基Lys85與M3形成了氫鍵，盡管氫鍵占有率較低，但最終是穩(wěn)定的。抑制劑與2種激酶的結(jié)合模式分析表明，GSK3β中的Lys85殘基對(duì)于區(qū)分選擇性比較關(guān)鍵。

2.4抑制劑對(duì)GSK3β的選擇性

基于上述能量分解，我們發(fā)現(xiàn)極性溶劑化自由能能夠區(qū)分抑制劑對(duì)于GSK3β的選擇性。盡管極性溶劑化自由能對(duì)結(jié)合是不利的，但對(duì)比CDK5和GSK3β兩種激酶與抑制劑的復(fù)合物發(fā)現(xiàn)，CDK5與抑制劑之間的極性溶劑化自由能對(duì)結(jié)合更加不利。這是由兩種激酶結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的極性溶劑化自由能的差異，而這體現(xiàn)了四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物對(duì)GSK3β的選擇性。

圖12　抑制劑與CDK5之間形成的H鍵的距離隨MD模擬的時(shí)間變化Fig.12　Interatomic distances in the course of the MD simulations show the stability of formed hydrogen bonds between three inhibitors(M1,M2 and M3)and CDK5

表2　抑制劑與CDK5和GSK3β之間形成的氫鍵Table2　Hydrogen bonds formed between inhibitors and CDK5 or GSK3β

基于2個(gè)激酶的序列比對(duì)，我們通過(guò)比對(duì)殘基的極性溶劑化自由能貢獻(xiàn)的差值來(lái)研究抑制劑的選擇性，如圖13所示?？v坐標(biāo)為了能量間隔顯示一致，對(duì)于M2抑制劑，GSK3β的Thr138與CDK5的Gln85殘基的差值被截?cái)?，?shí)際值為-39.75 kJ· mol-1。M1～M3比較，從圖中不難發(fā)現(xiàn)，GSK3β的Glu97、Thr138是造成抑制劑選擇性的主要原因，而Lys85則對(duì)于抑制劑對(duì)GSK3β的選擇性不利。這與前邊活性和結(jié)構(gòu)差異的討論一致。那么通過(guò)減小抑制劑對(duì)GSK3β中的Glu97和Thr138的不利作用，即增強(qiáng)抑制劑極性，理論上可以提高抑制劑對(duì)GSK3β的特異性。

通過(guò)上述能量分析我們了解到抑制劑與兩種激酶的相互作用機(jī)制以及抑制劑對(duì)GSK3β的選擇性機(jī)制，而在抑制劑與同源性很強(qiáng)的CDK5和GSK3β結(jié)合的過(guò)程中，其對(duì)兩種激酶本身結(jié)構(gòu)，即激酶中各殘基間的相互作用影響的差異也是造成抑制劑選擇性的重要因素。為此我們針對(duì)M1采用了動(dòng)態(tài)相關(guān)性分析(DCCM)，如圖14所示。M1與兩種激酶結(jié)合時(shí)，CDK5的Ile10～Arg36殘基與GSK3β的Ile62～Val70的相關(guān)性比較類似，差別較大的則是Val135～Val272區(qū)域蛋白質(zhì)殘基的相關(guān)性，這些殘基所對(duì)應(yīng)的CDK5的區(qū)域則是Cys83～Leu217殘基。對(duì)于GSK3β的這部分區(qū)域幾乎都是正相關(guān)的，蛋白質(zhì)殘基運(yùn)動(dòng)方向一致，包括鉸鏈(Hinge)區(qū)域的Val135和Thr138與Val135～Gln206區(qū)域殘基的運(yùn)動(dòng)一致。而對(duì)應(yīng)于CDK5的這部分區(qū)域則不顯著。這從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)本身也說(shuō)明了GSK3β的Thr138殘基在篩選CDK5和GSK3β的選擇性抑制劑中的重要性。

圖13　GSK3β和CDK5之間的相對(duì)每個(gè)殘基對(duì)的極性溶劑化自由能的差異Fig.13　Difference in the polar solvation energies ΔΔGpolbetween GSK3β and CDK5 as a function of residue index

圖14　GSK3β/M1和CDK5/M1的動(dòng)態(tài)相關(guān)性(DCCM)分析Fig.14　Dynamic cross-correlation map(DCCM)analyses for GSK3β/M1 and CDK5/M1

3　結(jié)論

本文通過(guò)分子對(duì)接，分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD)、MM/ PBSA能量計(jì)算以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析相結(jié)合的方法，從分子水平研究了3個(gè)四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物與CDK5和GSK3β的相互作用，并揭示了該抑制劑對(duì)GSK3β的選擇性抑制機(jī)理。分子對(duì)接結(jié)果表明，抑制劑對(duì)2種激酶具有相似的結(jié)合模式，結(jié)合口袋處的殘基也都根據(jù)序列比對(duì)相互對(duì)應(yīng)。GSK3β體系的平均RMSD值(0.17 nm)略高于CDK5體系(0.15 nm)，且活性較大的抑制劑RMSD值較低，因?yàn)榛钚暂^大的抑制劑增強(qiáng)了蛋白骨架整體的“柔性”，即對(duì)激酶構(gòu)象產(chǎn)生影響一定影響。能量分析表明，靜電能和范德華作用能夠區(qū)分不同抑制劑對(duì)同種激酶的生物活性差異。極性溶劑化自由能對(duì)區(qū)分抑制劑選擇性很重要，殘基分解表明GSK3β的Glu97、Thr138是造成抑制劑選擇性的主要原因。而CDK5和GSK3β在與抑制劑結(jié)合過(guò)程蛋白質(zhì)殘基的動(dòng)態(tài)相關(guān)性也存在差異，鉸鏈區(qū)域的Thr138與Val135～Gln206區(qū)域殘基正相關(guān)，證實(shí)Thr138殘基是區(qū)分抑制劑選擇性的關(guān)鍵。本文采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法從結(jié)構(gòu)和能量方面較好地解釋了四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物對(duì)GSK3β的選擇性抑制機(jī)理，為改善GSK3β選擇性抑制劑提供數(shù)據(jù)和理論指導(dǎo)。

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Exploring the Selectivity of Tetrahydropyrido[1,2-a]isoindolone Derivatives to GSK3β and CDK5 by Computational Methods

DONG Ke-Ke YANG Xue-Yu ZHAO Teng-Teng ZHU Xiao-Lei＊
(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Chemical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China)

Tetrahydropyrido[1,2-a]isoindolone derivatives are potent inhibitors of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β)instead of homologous cyclin-dependent kinase 5(CDK5).Molecular docking,molecular dynamics simulation,and MM/PBSA energy calculation are utilized to reveal the kinase inhibitors′selective mechanism at the molecular level for improving selectivity.Dynamic cross-correlation map(DCCM)analysis is applied to study the effect of the inhibitor on the interactions between each residue in CDK5 and GSK3β.The results of molecular docking indicate that the binding modes of three inhibitors with two kinases are especially similar,and residues in the binding pockets of two kinases are aligned with each other based on the sequence comparing analysis of crystal structures.The analysis of Root Mean Square Deviation(RMSD)with little fluctuation underlies the stability and reliability of systems.Its values of CDK5(～0.15 nm)are less than GSK3β(～0.17 nm),and the inhibitor with higher value holds stronger flexibility and conformational changes of kinases.In terms of energies,the electrostatic and van der Walls energies are the major interactions for differentiating the activity between thesame inhibitor and two kinases.And the polar solvation energy plays pivotal role in discriminating the selectivity of kinase inhibitor.The residue decomposition indicates that the residues Glu97 and Thr138 of GSK3β are the key residues for differentiating the inhibitor selectivity.On the other hand,in the aspect of inter-residue interaction in one kinase,results indicate that the dynamic correlation of residues is different during the binding process of CDK5 and GSK3β with inhibitors.The correlation of Thr138 in the hinge domain of GSK3β with that of residues Val135～Gln206 is positive,while the correlation of Gln85 and Cys83～Ala150 in CDK5 is unclear,which is a key factor to distinguish inhibitor selectivity.

tetrahydropyrido[1,2-a]isoindolone derivatives;molecular dynamics simulation;selectivity;stability

中國(guó)分類號(hào)：O643.1A

1001-4861(2016)11-1919-12

10.11862/CJIC.2016.263

2016-05-11。收修改稿日期：2016-09-12。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.20706029，20876073，91434109)資助項(xiàng)目。＊通信聯(lián)系人。E-mail：xlzhu@njtech.edu.cn