張?zhí)K文，李小靜，陳 釗，王 暉

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TSG-6對人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響

張?zhí)K文，李小靜，陳 釗，王 暉

目的 探討腫瘤壞死因子α刺激基因6(TSG-6)對人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法 取人病理性瘢痕組織共6例，用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞，體外培養(yǎng)的第3、4代細(xì)胞，用濃度為2 μg/ml的重組人TSG-6蛋白處理，在作用48 h后，用免疫組化法檢測TSG-6作用前后人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的變化，并計算PCNA陽性細(xì)胞率；流式細(xì)胞術(shù)計算、分析人重組TSG-6蛋白作用前后，人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡率；Western blot法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、半胱天冬酶3(caspase-3)表達(dá)的變化。結(jié)果 2 μg/ml TSG-6體外干預(yù)人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h情況下，人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞PCNA的陽性細(xì)胞率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞凋亡率增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Western blot法檢測顯示細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、caspase-3表達(dá)明顯增多。結(jié)論 TSG-6在體外能夠抑制人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，TSG-6對細(xì)胞的抑制作用可能與TSG-6抑制PCNA基因表達(dá)有關(guān)，TSG-6誘導(dǎo)人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的作用可能與TSG-6促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、caspase-3表達(dá)有關(guān)。

腫瘤壞死因子α刺激基因6；病理性瘢痕；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

腫瘤壞死因子α刺激基因6(tumor necrosis fac tor alpha stimulated gene-6，TSG-6)是Lee et al[1]發(fā)現(xiàn)的一種參與多種炎性反應(yīng)的抗炎因子。 病理性瘢痕是由皮膚創(chuàng)傷過度愈合而形成，增生的病理性瘢痕組織高于周圍正常皮膚，不僅影響美觀，而且可出現(xiàn)瘙癢、疼痛等癥狀，甚至?xí)l(fā)生瘢痕攣縮，發(fā)生在關(guān)節(jié)處瘢痕攣縮常造成關(guān)節(jié)嚴(yán)重的功能障礙，因此皮膚創(chuàng)傷后瘢痕形成的防治是創(chuàng)傷愈合領(lǐng)域的一個重要問題。Tan et al[2]首次證明抗炎因子TSG-6表達(dá)的減少可能是導(dǎo)致病理性瘢痕形成的一個重要因素。該研究探討2 μg/ml TSG-6對人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料 人病理性瘢痕組織標(biāo)本均來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科病房與門診手術(shù)中切除的病理性瘢痕組織，全部征得患者同意并簽署知情同意書，組織標(biāo)本共6例(男2例，女4例)，年齡4～27(16.82±1.35)歲，患者均屬于首次治療，未經(jīng)其他治療，且病理性瘢痕癥狀突出，病程6～12個月。

1.2 主要試劑及儀器 TSG-6蛋白購自美國R&D Systems公司；胎牛血清、PBS、DMEM(高糖)培養(yǎng)基均購自美國HyClone公司；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)單克隆抗體及免疫組化SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；BD 556547 AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒、流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；Western blot試劑盒購自美國Sigma公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司；Western blot檢測全套設(shè)備購自Bio-Rad公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 病理性瘢痕成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。每3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，10～14 d可見組織塊周圍有成纖維細(xì)胞萌出，當(dāng)成纖維細(xì)胞爬滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底并連接成片(鋪滿細(xì)胞瓶底80%以上)，可行傳代，待細(xì)胞傳至第3或4代時，可用于實驗。

1.3.2 免疫組化法檢測PCNA 取第3代處于對數(shù)生長期的人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，以 1×105/ml的密度接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中。實驗分為空白對照組和濃度為2 μg/ml的 TSG-6干預(yù)組。細(xì)胞貼壁生長后，棄上清液，分別加入不含TSG-6的完全培養(yǎng)基和TSG-6蛋白終濃度為2 μg/ml的培養(yǎng)基。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h。再經(jīng)過固定、烤片處理，采用檸檬酸(0.01 mol/L，pH=6.0)微波法行抗原修復(fù)。采用SP法，DAB顯色。實驗重復(fù)3次。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取處于對數(shù)生長期的第3代人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，以 1×105/ml的密度接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中。實驗分為空白對照組和2 μg/ml TSG-6干預(yù)組。細(xì)胞貼壁生長后，棄上清液，分別加入不含TSG-6的完全培養(yǎng)基和TSG-6蛋白終濃度2 μg/ml的培養(yǎng)基。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h。收集空白對照組和濃度為2 μg/ml TSG-6干預(yù)組細(xì)胞到試管中，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，用冰PBS漂洗2次，后按BD 556547 AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明書操作，操作完成后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.4 Western blot法檢測p53、半胱天冬酶3(caspase3) 取處于對數(shù)生長期的第3代人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗分為空白對照組和濃度為2 μg/ml TSG-6干預(yù)組。將人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞提取物與上樣緩沖液混合后，加熱變性，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，在50 mA、4 ℃條件下轉(zhuǎn)移8 h，實驗按照Western blot試劑盒說明書操作，將PVDF膜放入另一塑料袋，加含二抗的封閉液，置室溫下1 h，振搖洗滌后，加新配置的DAB顯色液，條帶顯色清楚后終止顯色并拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 TSG-6抑制人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖 免疫組化法結(jié)果顯示：細(xì)胞核內(nèi)含有棕黃色顆粒者為PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞，見圖1，從每張切片中選取5個陽性率較多的視野計數(shù)，陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%，TSG-6干預(yù)組PCNA陽性細(xì)胞率(24.7±4.3)較空白組(40.5±5.0)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，t=5.88，P<0.01)。表明TSG-6在體外能夠抑制人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖。

圖1 PCNA在人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá) DAB×400

2.2 TSG-6促進(jìn)人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：對數(shù)生長期細(xì)胞消化重懸，接種6孔培養(yǎng)板貼壁生長，濃度為0、2 μg/ml的TSG-6處理48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為0、12.43%， TSG-6干預(yù)組細(xì)胞凋亡率較空白對照組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。Western blot法檢測顯示，以β-actin作參照，TSG-6干預(yù)組p53蛋白相對定量明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，t=2.903，P<0.05)；同時TSG-6干預(yù)組caspase3蛋白相對定量明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，t=5.666，P<0.01)，見圖3、4。

圖2 流式細(xì)胞儀分析人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡

圖3 Western blot檢測成纖維細(xì)胞中p53、caspase3蛋白表達(dá)

圖4 TSG-6干預(yù)組及空白對照組成纖維細(xì)胞中p53、caspase3 蛋白相對定量

與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

病理性瘢痕一旦產(chǎn)生就無法完全消除，雖然當(dāng)前病理性瘢痕的治療方法很多，主要包括外科手術(shù)、加壓、放射和藥物注射治療[3]，但治療后病理性瘢痕再次復(fù)發(fā)率高，療效達(dá)不到完全滿意。有關(guān)病理性瘢痕的防治目前仍然是國際上的醫(yī)學(xué)難題，尋求更為有效、理想的病理性瘢痕治療方法為臨床迫切所需。

在臨床治療病理性瘢痕的過程中發(fā)現(xiàn)，組織損傷后形成病理性瘢痕的創(chuàng)面在恢復(fù)的過程中往往伴隨著感染，在一定程度上提示了病理性瘢痕的形成與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4]。近年，越來越多的學(xué)者認(rèn)為病理性瘢痕的形成是一種纖維化的病理過程，組織損傷后的炎癥反應(yīng)與纖維化病理過程以及其反應(yīng)程度緊密相關(guān)，而炎癥反應(yīng)是組織損傷后纖維化病理變化的部分或主要原因[5-6]，有報道[1]稱通過某些抗炎作用減少瘢痕形成是一種已被證實的有效的治療方法。因此，通過抗炎作用以期治療病理性瘢痕為近年相關(guān)領(lǐng)域研究熱點之一。

TSG-6基因位于人染色體2q23.3，mRNA全長為1 440 bp，開放閱讀框為77～910，主要編碼由277個氨基酸殘基組成的一種分泌性蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為31 203×103，第1～19位氨基酸殘基為信號肽。TSG-6基因是一個保護(hù)性的炎癥反應(yīng)基因，其參與多種炎癥反應(yīng)性疾病，主要發(fā)揮抗炎以及細(xì)胞外基質(zhì)重塑等作用[2]。繼Tan et al[2]首次證明抗炎因子TSG-6表達(dá)的減少可能是導(dǎo)致病理性瘢痕形成的一個重要因素以來，洪學(xué)哲 等[7]研究發(fā)現(xiàn)TSG-6可能具有抑制病理性瘢痕形成的作用。唐悅玲 等[8]研究TSG-6對病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)TSG-6對病理性瘢痕有抑制增殖促進(jìn)凋亡的作用，機(jī)制可能與TSG-6調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax表達(dá)有關(guān)。Wang et al[9]通過建立兔耳病理性瘢痕模型，研究證實TSG-6對兔耳病理性瘢痕有顯著抑制作用。

病理性瘢痕組織學(xué)主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的過度增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的過度聚集[10-11]，創(chuàng)傷后的皮膚愈合過程中[12]，作為傷口愈合和瘢痕增生的主要效應(yīng)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞活化增殖合成膠原以及分化異常，可直接導(dǎo)致病理性瘢痕的形成。因此，抑制成纖維細(xì)胞的增殖或誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡成為治療病理性瘢痕的關(guān)鍵[13]。本研究顯示，TSG-6在體外能夠抑制人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，其抑制作用可能與TSG-6通過抑制PCNA基因表達(dá)有關(guān)。另一方面，流式細(xì)胞儀檢測分析顯示2 μg/ml TSG-6作用于人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率明顯增高。因此，TSG-6在體外能誘導(dǎo)或促進(jìn)人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，其作用可能與TSG-6誘導(dǎo)p53、caspase3蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，TSG-6蛋白對體外培養(yǎng)的病理性瘢痕成纖維細(xì)胞具有抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用，這可能與提高細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53及caspase3表達(dá)相關(guān)。成纖維細(xì)胞作為病理性瘢痕主要功能細(xì)胞，抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡是瘢痕治療的重要研究方向，本實驗證實TSG-6對人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與凋亡具有調(diào)控作用，為病理性瘢痕的治療提供了新的研究方向和一定的實驗基礎(chǔ)，然而具體作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步的研究。

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Effects of TSG-6 on the proliferation and apoptosis of human pathological scar fibroblasts

Zhang Suwen,Li Xiaojing,Chen Zhao, et al

(Dept of Plastic Surgery,The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022)

ObjectiveTo observe the effects of tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG-6) on the proliferation and apoptosis of human pathological scar fibroblasts. Methods The samples were harvested from human pathological scar tissue, a total of 6 cases, and then were cultured to pathological scar fibroblasts with adherence method. Cells used in this study were propagated for 3-4 times before use. The pathological scar fibroblasts were cultured with 2 μg/ml of recombinant human TSG-6 protein for 48 h. The effects of TSG-6 on cell proliferation were then assessed by immunohistochemical method at the indicate time. The rate of apoptosis induced by TSG-6 was determined by flow cytometry. Western blot was performed to detect the expression levels of caspase-3 and p53 after TSG-6 was treated. Results After treated with TSG-6 for 48 h,cells expressing proliferating cell nuclear antigen,an indicator of cell proliferation, reduced significantly (P<0.05). On the other hand, the rate of apoptosis of pathological scar fibroblasts induced by TSG-6 with 2 μg/ml was increased (P<0.05). The expression levels of apoptosis related proteins caspase-3 and p53 were significantly increased in TSG-6 treated group. Conclusion TSG-6 may inhibit proliferation and induce apoptosis of human pathological scar fibroblastinvitro. The inhibition of proliferation might be caused by inhibition of PCNA gene expression, and the induction of apoptosis might be associated with promotion expression of caspase-3 and p53.

TSG-6; pathological scar; fibroblasts; cell proliferation; apoptosis

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.048.html

國家自然科學(xué)基金(編號：81272107)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，合肥 230022

張?zhí)K文，男，碩士研究生；

李小靜，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lixiaojing5@163.com

R 619+.6

A

1000-1492(2016)01-0102-04

2015-09-30接收