應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析方法檢測鎮(zhèn)江市內(nèi)水域水樣和底泥中的鄰苯二甲酸二乙酯

曾 昆，周 軍，邵 杰，張 禎*

（1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析方法檢測鎮(zhèn)江市內(nèi)水域水樣和底泥中的鄰苯二甲酸二乙酯

曾 昆1，2，周 軍1，邵 杰1，張 禎1*

（1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

應(yīng)用鄰苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate，DEP）抗體，建立了間接競爭性ELISA方法，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而測定了鎮(zhèn)江市內(nèi)水域中DEP含量。結(jié)果顯示優(yōu)化后的ELISA方法檢測范圍為20～320 ng·mL-1，最低檢測限為8.2 ng·mL-1。方法特異性高，與其他鄰苯二甲酸酯類似物幾乎無交叉反應(yīng)。ELISA方法批內(nèi)差在3.38%～9.09%，批間差在3.76%～12.78%。檢測方法檢測水樣和底泥樣本中DEP含量，添加回收率在90.46%～122.75%。鎮(zhèn)江市內(nèi)古運(yùn)河和運(yùn)糧河水樣和底泥樣本中DEP的檢出率分別為62.5%和87.5%，其中水樣中DEP含量最高可為6.61 ng·mL-1，底泥樣本中DEP含量最高為86.9 ng·g-1。

塑化劑；DEP；抗體

目前DEP的檢測方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等[15-18]，這些儀器方法對環(huán)境樣本的前處理方法要求嚴(yán)苛，操作流程繁瑣，并不適用于大量環(huán)境樣本的篩查。以抗原-抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的免疫分析方法，因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)勢，近年來在環(huán)境分析領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。因此，本研究利用自主制備的DEP抗體，建立了靈敏、快速的ELISA方法，優(yōu)化了反應(yīng)條件，并以此對鎮(zhèn)江地區(qū)部分市內(nèi)河流中DEP的污染狀況進(jìn)行調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

抗DEP多克隆抗體和包被抗原OVA-DEP為本實(shí)驗(yàn)室自制，明膠、Tween-20、四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）購自Sigma-Aldrich公司，辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔（IgG-HRP）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DEP、鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸丁酯本甲酯（Butyl benzyl phthalate，BBP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（n-Dioctyl ph thalate，DnOP）、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（Dimethoxyethyl phthalate，MEP）、鄰苯二甲酸單-2-乙基己酯（Monoethylhexyl phthalate，MEHP）、鄰苯二甲酸二異辛酯（Diisooctyl（o-）phthalate，DiOP）、鄰苯二甲酸單丁酯（Monobutyl phthalate，MBP）標(biāo)準(zhǔn)品購自北京北納創(chuàng)聯(lián)研究院，正己烷及其余常規(guī)試劑均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（分析純）。96孔酶標(biāo)板購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。所用酶標(biāo)儀為Multiskan MK3型酶標(biāo)儀；氮吹儀為MD200-2型，購自上海睿玥實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 競爭性ELISA方法檢測流程

96 孔板中加入一定濃度的OVA-DEP，每孔100 μL，4℃過夜。倒掉孔內(nèi)液體，用洗滌液（含0.05% Tween-20的0.01 mol·L-1PBS，pH 7.4）洗滌1次，拍干。每孔加封閉液（含1%明膠的0.01 mol·L-1PBS，pH 7.4）200 μL，37℃孵育2 h，倒掉孔內(nèi)液體，拍干。用抗體稀釋液（含0.1%明膠的0.01 mol·L-1PBS，pH 7.4）將DEP標(biāo)準(zhǔn)品配成系列濃度（1、10、20、40、80、 160、320 ng·mL-1），每孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，再加入50 μL適量濃度的DEP抗體，37℃孵育后洗滌液洗滌3次，拍干。每孔加入適量濃度的IgG-HRP 100 μL，37℃孵育1 h后洗滌液洗滌3次，拍干。每孔加新鮮配制的TMB底物溶液（0.1 mg·mL-1）100 μL，顯色10 min。每孔加終止液（2 mol·L-1H2SO4）50 μL，檢測吸光度OD450nm～OD630nm。

1.3 條件優(yōu)化

1.3.1 包被抗原及一抗最佳反應(yīng)濃度

采用棋盤法摸索抗原抗體最佳反應(yīng)濃度。96孔酶標(biāo)板每行包被不同濃度的OVA-DEP（濃度分別1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16 000），每孔100 μL，4℃過夜。洗滌及封閉同1.2節(jié)。將DEP抗體用抗體稀釋液從1∶2500開始倍比稀釋到1∶40 000，并依次加入不同濃度包被的孔板中，每孔100 μL，37℃孵育1 h后洗滌液洗滌3次，拍干。加入酶標(biāo)記物、顯色、讀值，流程同前。以陽性對照/陰性對照（Positive/ Negative，P/N）≥2.1、吸光度在1.0左右時(shí)的抗原及一抗?jié)舛葹樽罴逊磻?yīng)濃度[P/N=（OD標(biāo)本-OD空白對照）/（OD陰性對照-OD空白對照）]。

1.3.2 最佳競爭反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

在DEP抗體與DEP標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)時(shí)，采用不同的反應(yīng)時(shí)間（5、15、30、45、60 min），按1.2節(jié)方法進(jìn)行檢測，每組3個(gè)平行，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算半數(shù)抑制率（50%Inhibitory Concentration，IC50）。選擇最大吸光度（B0值）較高且IC50值較小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間為最佳競爭反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3 最佳酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊膬?yōu)化

采用不同濃度（1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000）的酶標(biāo)二抗，按1.2節(jié)方法進(jìn)行檢測，每組3個(gè)平行，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算IC50。選擇B0值較高且IC50值較小時(shí)的酶標(biāo)二抗?jié)舛葹樽罴咽褂脻舛取?/p>

1.3.4 最佳反應(yīng)pH值的優(yōu)化

分別配制pH值為6.0、6.5、7.0、7.4、8.0的PBS緩沖液，用該緩沖液將DEP標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋為一系列濃度的DEP標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2節(jié)方法進(jìn)行檢測，每組3個(gè)平行，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算IC50。選擇B0值較高且IC50值較小時(shí)的pH值為最佳反應(yīng)pH值。

1.3.5 最佳離子強(qiáng)度的優(yōu)化

分別配制離子強(qiáng)度為0.01、0.05、0.1、0.15、0.2 mol·L-1的PBS緩沖液，用該緩沖液將DEP標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋為一系列濃度的DEP標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2節(jié)方法進(jìn)行檢測，每組3個(gè)平行，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算IC50。選擇B0值較高且IC50值較小時(shí)的離子強(qiáng)度值為最佳離子強(qiáng)度。

1.4 環(huán)境水樣中DEP測定

采集鎮(zhèn)江市內(nèi)水體（古運(yùn)河和運(yùn)糧河）中的水樣和底泥樣本。水樣采集于水面以下0.5 m處，放入棕色玻璃瓶4℃保存，一周內(nèi)檢測。在各個(gè)水樣采集點(diǎn)周圍布設(shè)3個(gè)底泥采樣點(diǎn)，利用抓斗式采樣器采集表層底泥，然后混合均勻組成一個(gè)底泥樣本，放入棕色玻璃瓶4℃保存，一周內(nèi)檢測。

1.4.1 ELISA方法檢測DEP

取5 mL水樣，加入5 mL正己烷，上下顛倒振蕩30 min，6000 r·min-1離心10 min，取2.5 mL上清，用氮吹儀吹干。最終樣品用0.5 mL PBS復(fù)溶，用于DEP含量測定。底泥樣本在50℃下徹底干燥。取5 g底泥樣本，加入5 mL正己烷，上下顛倒振蕩30 min，6000 r·min-1離心10 min，取1 mL上清，用氮吹儀吹干。最終樣品用0.5 mL PBS復(fù)溶，用于DEP含量測定。

1.4.2 GC-MS方法檢測DEP

1.5 競爭性ELISA方法的性能評估

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和分析方法的靈敏度

基于1.3節(jié)中優(yōu)化后的條件，按照1.2節(jié)中的操作流程，DEP標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10、20、40、80、160、320 ng·mL-1，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3組平行。以DEP標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中B為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的OD值，B0為標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)對應(yīng)的OD值，即最大OD值。B/B0值與標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)呈線性回歸關(guān)系，可以得出回歸曲線的方程，從而計(jì)算IC50和最低檢測限，其中最低檢測限為抑制率在90%時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，檢測范圍為抑制率在20%～80%的標(biāo)準(zhǔn)品濃度區(qū)間[20]。

1.5.2 交叉反應(yīng)

選取DEP結(jié)構(gòu)類似物（DBP、MEP、BBP、MEHP、DiOP、MBP、DnOP）進(jìn)行交叉反應(yīng)測定，評價(jià)本實(shí)驗(yàn)方法的特異性。

交叉反應(yīng)的計(jì)算公式為：交叉反應(yīng)（CR%）=IC50（DEP）/IC50（類似物）×100%

1.5.3 精密度

DEP標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)測定10次，隔日再次檢測，計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）。CV=SD/mean×100%，其中SD為標(biāo)準(zhǔn)差（Standard Deviation）。

式中：j為第i項(xiàng)制約因素的第j項(xiàng)制約子因素，j=0，1，2，…n，； k1為第i層制約因素包含的制約子因素個(gè)數(shù)，k1=1，2， …，n；

1.5.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

陰性水樣選擇全玻璃雙蒸水并儲存在玻璃瓶中，陰性底泥樣本則是在遠(yuǎn)離居民區(qū)的河流區(qū)域采集，并且經(jīng)GC-MS方法檢測，未檢測到DEP。

取1 mL水樣或1 g底泥樣本，添加DEP標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度為20、50、100 ng·mL-1或ng·g-1，充分混合均勻，4℃放置12 h。按照1.4.1節(jié)方法處理樣本后用于ELISA檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

基于抗原抗體特異性反應(yīng)的ELISA方法受到多種因素的影響，包括使用的抗原抗體的濃度、競爭性反應(yīng)的時(shí)間、競爭結(jié)合時(shí)的pH以及離子強(qiáng)度等。

采用棋盤法篩選包被抗原OVA-DEP與特異性抗DEP抗體反應(yīng)的最佳使用濃度，結(jié)果見表1。吸光度在1.0左右的值有3組，分別為抗原1∶1000/抗體1∶20 000、抗原1∶2000/抗體1∶10 000、抗原1∶4000/抗體1∶2500，其中第一組和第三組的空白值較高（＞0.1），故采用抗原1∶2000/抗體1∶10 000作為最佳使用濃度。

酶標(biāo)二抗的使用濃度直接影響ELISA的讀值的高低，也會影響方法的靈敏度。使用的酶標(biāo)二抗?jié)舛冗^高不僅浪費(fèi)試劑，而且過高的OD值會掩蓋掉競爭性反應(yīng)的趨勢，降低方法的靈敏度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看（圖1a），隨著酶標(biāo)物稀釋度的增加，B0值逐漸減?。辉诿笜?biāo)物濃度較高（1∶250）時(shí)，IC50值較高（209 ng· mL-1），隨著稀釋度的增加，IC50值在一定范圍內(nèi)波動(dòng)。其中當(dāng)酶標(biāo)物濃度為1∶500時(shí)，B0值較高而IC50值最低，因此我們認(rèn)為該條件為最佳酶標(biāo)二抗?jié)舛取?/p>

表1 棋盤法篩選最佳包被抗原及一抗反應(yīng)濃度Table 1 Optimal concentration of coating antigen and antibody by checkerboard method

抗原抗體的結(jié)合是非共價(jià)鍵的作用，因此抗原抗體復(fù)合物始終處在結(jié)合-解離-結(jié)合的動(dòng)態(tài)平衡過程中。選擇合適的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，使得特異性抗體更多的與游離DEP而非板上固化的OVA-DEP結(jié)合，對于所建立的方法的靈敏度有顯著影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看（圖1b），在一定的孵育時(shí)間（5～45 min）內(nèi)，隨著時(shí)間延長，B0不斷增加，IC50也呈下降的趨勢，但是當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，IC50卻呈現(xiàn)出升高的趨勢。當(dāng)競爭反應(yīng)時(shí)間為45 min時(shí)，B0值較高而IC50值最低，因此我們認(rèn)為該條件為最佳反應(yīng)時(shí)間。

從圖1c可以看出，pH對B0值的影響并不大，IC50值出現(xiàn)了先降低后又升高的態(tài)勢，當(dāng)pH為7.4時(shí)，IC50值最低。溶液的離子強(qiáng)度對B0值影響較大（圖1d），離子強(qiáng)度越高，B0值越小，而IC50值整體呈上升的趨勢。當(dāng)離子強(qiáng)度為0.01 mol·L-1時(shí)，B0值最高而IC50值最低。

2.2 DEP標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

基于以上優(yōu)化后的反應(yīng)條件，建立了DEP檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。該方法的線性范圍為20～320 ng·mL-1，IC50為72 ng·mL-1，檢測限為8.2 ng·mL-1。

圖1 不同反應(yīng)條件的優(yōu)化Figure 1 Influence of parameters on ELISA

圖2 ELISA方法檢測DEP的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Calibration curve for detection of DEP by ELISA

2.3 ELISA方法的特異性

抗體制備過程中，將抗原特有的抗原決定簇暴露于機(jī)體的免疫系統(tǒng)而獲得相應(yīng)的抗體。如果目標(biāo)化合物與其類似物具有相同的分子結(jié)構(gòu)或者官能團(tuán)，則所得的抗體就會同時(shí)識別目標(biāo)物及其類似物，那么所建立的分析方法測得的物質(zhì)濃度為具有類似官能團(tuán)的化合物的總濃度，不能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的特異性檢測。本研究旨在建立特異性的DEP檢測方法，因此所用抗體與DEP類似物的結(jié)合能力越低，則該方法的特異性就越強(qiáng)。從交叉反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）可以看出，DEP抗體僅與DBP、MEP、BBP有較弱的交叉反應(yīng)，分別為4.29%、2.03%、0.035%，與MEHP、DiOP、MBP、DnOP沒有明顯的交叉反應(yīng)（CR＜0.1%），顯示了本方法具有較好的特異性。

2.4 ELISA方法的精密度

以同一塊板上的孔間平均變異系數(shù)來表示批內(nèi)差異，以不同時(shí)間檢測的孔間平均變異系數(shù)來表示批間差異，結(jié)果見表3。本方法的批內(nèi)差在3.38%～9.09%，平均值為7.15%；批間差在3.76%～12.78%，平均值為8.14%。批內(nèi)差小于10%，批間差小于20%，該方法具有較高的精密度。

2.5 ELISA檢測DEP方法的準(zhǔn)確性

為評估所建立的ELISA方法的準(zhǔn)確性，我們進(jìn)行了添加回收實(shí)驗(yàn)。由于DEP污染的廣泛性，難以獲得有效的空白樣本，因此添加回收實(shí)驗(yàn)是采用由GCMS方法驗(yàn)證的陰性樣本進(jìn)行的，其中水樣來自古運(yùn)河嚴(yán)家橋采樣點(diǎn)，底泥樣本來自玉帶河。進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)的同時(shí)測定未添加時(shí)的本底濃度，如有本底濃度測出，則在計(jì)算回收率時(shí)扣除本底再行計(jì)算。結(jié)果顯示（表4），所采用的水樣和泥樣中并沒有DEP檢出，檢測的回收率在90.46%～122.75%，平均回收率110.88%，說明該方法的準(zhǔn)確性較高。

2.6 環(huán)境樣本中DEP的測定

表2 ELISA方法與DEP類似物的交叉反應(yīng)Table 2 Cross-reactivity of DEP structural compounds

表3 ELISA方法的批內(nèi)和批間差異Table 3 Intra-assay and inter-assay variance of ELISA

表4 添加回收實(shí)驗(yàn)Table 4 Recovery of DEP from spiking waters and sediments samples

由于塑化劑廣泛存在于塑料制品中，為避免采樣工具對樣本的污染，造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，采用棕色玻璃瓶作為采樣和儲存工具。并且玻璃瓶在使用前，先用丙酮浸潤1 h，后用正己烷洗滌3次，最大限度地避免了來自采樣工具的污染。由于水樣中DEP含量相對較低，我們對水樣進(jìn)行了濃縮前處理。采用正己烷提取的前處理方法，應(yīng)用ELISA方法檢測水樣的檢測限為1.19 ng·mL-1，底泥樣本的檢測限為5.95 ng·g-1。

應(yīng)用建立的ELISA方法以及GC-MS方法對鎮(zhèn)江市內(nèi)古運(yùn)河以及運(yùn)糧河水樣及底泥樣本中的DEP進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示（表5），在18個(gè)樣本中，15個(gè)樣本的ELISA和GC-MS檢測結(jié)果一致，具有較好的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)室的自來水樣中并未檢測到DEP，但是采集的其他8個(gè)樣本中，5個(gè)水樣和7個(gè)底泥樣本中有DEP檢出，檢出率分別為62.5%和87.5%。水樣中DEP含量在ND～6.51ng·mL-1，底泥樣本中DEP含量在ND～86.92ng·g-1。同時(shí)對ELISA結(jié)果和GC-MS結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者具有較好的一致性（圖3）。

3 討論

隨著塑料制品的生產(chǎn)、使用和廢棄，PAEs越來越多地滲透到環(huán)境中。由于PAEs是親脂性化合物，正辛醇-水分配系數(shù)（Kow）值較高，因而在水中的揮發(fā)損失小，進(jìn)入水環(huán)境的PAEs很難向大氣環(huán)境遷移轉(zhuǎn)化，易于從水中吸附到沉積物以及土壤等有機(jī)物中。表6匯總了DEP在水樣和底泥樣本中的分布情況，可以看出DEP分布廣泛，在水樣中的含量可達(dá)數(shù)十ng·mL-1水平，而底泥樣本中DEP含量顯著高于水樣，最高達(dá)上千ng·g-1水平。

表5 鎮(zhèn)江市內(nèi)水樣和底泥樣本中的DEP含量Table 5 Analysis DEP in real waters and sediments samples

圖3 ELISA結(jié)果和GC-MS結(jié)果相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis of the results of ELISA and GC-MS

建立快速、靈敏的分析方法監(jiān)測環(huán)境樣本中DEP的分布狀況，是評價(jià)DEP生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。常規(guī)儀器分析方法因設(shè)備昂貴、需要專業(yè)人員等缺陷，不適用于大量環(huán)境樣本的快速篩選與分析。ELISA方法以抗原-抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，通過酶促反應(yīng)放大信號，從而實(shí)現(xiàn)痕量物質(zhì)的快速檢測。其中特異性抗體是ELISA方法建立的關(guān)鍵因素，其靈敏度、特異性等直接影響方法的檢測性能。DEP分子量較小，不能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此需將其與大分子載體蛋白（如牛血清白蛋白、卵清白蛋白等）偶聯(lián)，免疫動(dòng)物才能獲得相應(yīng)的抗體。因此，DEP抗體的獲得較為困難，目前基于DEP抗體的免疫分析方法報(bào)道較少。Zhang等[29]建立了直接競爭ELISA方法，檢測范圍在0.1～3500 ng·mL-1，并用于環(huán)境水樣的檢測；隨后，Zhang等[30]又建立了間接競爭ELISA方法，檢測范圍縮小到0.005～18.6 ng·mL-1。相對于文獻(xiàn)報(bào)道，本研究所建立的方法靈敏度有一定的差距，主要原因可能與所使用的抗體靈敏度不高有關(guān)。由于環(huán)境樣本，尤其是水樣中污染物濃度偏低，許多分析方法（包括LC-MS/MS等儀器分析方法）的固有靈敏度并不足以分析環(huán)境樣本中的痕量污染物。因此，樣品前處理時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的富集，富集倍數(shù)因其前處理方法差異而不同，通?？蛇_(dá)數(shù)十乃至數(shù)百倍。在本研究中，ELISA方法固有靈敏度為8.2 ng·mL-1，但經(jīng)過前處理的10倍富集后檢測限可達(dá)到1.19 ng·mL-1，完全可以滿足水樣中痕量DEP的分析要求。

表6 DEP在水樣和底泥樣本中的分布情況Table 6 Occurrence of DEP in waters and sediments samples

對鎮(zhèn)江市內(nèi)古運(yùn)河以及運(yùn)糧河水樣及底泥樣本的檢測結(jié)果可以看出，DEP污染較為嚴(yán)重，檢出率分別為62.5%（水樣）和87.5%（底泥），原因可能是由于河流周邊人口密集，加劇了污染的發(fā)生。與其他各地水體中的DEP濃度相比，鎮(zhèn)江水體中的DEP濃度與中國松花江、法國索姆河以及西班牙Llobregat河等接近。雖然我國目前未出臺針對地表水中DEP的限量標(biāo)準(zhǔn)，但水體中DEP的嚴(yán)重污染也應(yīng)引起我們的足夠重視。底泥中的DEP的檢出率高于水體，并且其含量也高于同一采樣點(diǎn)水體中DEP的濃度，這一結(jié)果可能是由于DEP易于從水中吸附到沉積物中。底泥沉積于河底，隨著時(shí)間延長，DEP等污染物不斷積累、吸附，容易造成新的生態(tài)環(huán)境隱患。

4 結(jié)論

采用DEP多克隆抗體建立的間接競爭ELISA法，優(yōu)化反應(yīng)條件后，方法的檢測范圍為20～320 ng· mL-1，IC50為72 ng·mL-1，最低檢測限為8.2 ng·mL-1。該方法具有較高的特異性，與其他鄰苯二甲酸酯類似物幾乎無交叉反應(yīng)。ELISA方法準(zhǔn)確性高，與儀器方法比對具有較好的一致性。以建立的方法檢測了鎮(zhèn)江市內(nèi)水體中水樣和底泥樣本中DEP，發(fā)現(xiàn)環(huán)境樣本中DEP有較高的檢出率。酶聯(lián)免疫分析方法的建立可為環(huán)境中塑化劑分布研究，進(jìn)而評估其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供有效的技術(shù)手段。

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Development of a enzyme-linked immunosorbent assay for diethyl phthalate analysis in water and sediment samples from rivers in Zhenjiang City

ZENG Kun1,2,ZHOU Jun1,SHAO Jie1,ZHANG Zhen1*
（1.College of Environmental and Safety Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2.Institute of Environment and Ecology, Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China）

Based on a polyclonal antibody targeting diethyl phthalate（DEP）,a sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was proposed and several parameters were investigated.Under the optimized conditions,the developed method showed high sensitivity to DEP（the limit of detection,8.2 ng·mL-1）and high selectivity with cross-reactivities less than 4.29%to seven structurally related phthalate esters.The linear range was from 20 ng·mL-1to 320 ng·mL-1.The recoveries（90.46%～122.75%）and reproducibility（CV of intra-assay,3.38%～9.09%;CV of inter-assay,3.76%～12.78%）were satisfactory.Our proposed ELISA indicated that it had good agreement with those given by GC-MS,which was applied to detect DEP in waters and sediments from ancient canal and Yunliang River.And DEP was found in most of target areas（the detection rate,62.5%in waters and 87.5%in sediments）,the concentration was up to 6.61 ng·mL-1and 86.9 ng·g-1in water and sediments,respectively.

plasticizer;DEP;antibody

X78

A

1672-2043（2016）11-2237-08

10.11654/jaes.2016-0303

2016-03-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31502118，21577051）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20130507）；中國博士后基金項(xiàng)目（2013M541606）

曾昆（1980—），女，湖北襄陽人，博士，講師，從事污染物快速分析研究。E-mail：kjj80116@163.com

*通信作者：張禎E-mail：zhzhenok@163.com

曾昆，周軍，邵杰，等.應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析方法檢測鎮(zhèn)江市內(nèi)水域水樣和底泥中的鄰苯二甲酸二乙酯[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2016,35（11）：2237-2244.

ZENG Kun,ZHOU Jun,SHAO Jie,et al.Development of a enzyme-linked immunosorbent assay for diethyl phthalate analysis in water and sediment samples from rivers in Zhenjiang City[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（11）：2237-2244.

鄰苯二甲酸酯（Phthalate esters，PAEs）類塑化劑廣泛應(yīng)用于塑料及一次性塑料消費(fèi)品，還可以作為原料用于香味劑、化妝品和冷凝劑[1-3]。隨著工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展及塑料制品的大量使用，PAEs已經(jīng)成為全球性最普遍的一類污染物[4]。其中鄰苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate，DEP）是PAEs中的重要成員，近年來被越來越多地用作增塑劑和食品添加劑[11]，在法國[5]、印度[6]、西班牙[7]以及我國廣州[8]、臺灣[9]等地區(qū)的水體和底泥中均有檢出。研究表明DEP是一類影響嚴(yán)重的環(huán)境激素，易造成生物體內(nèi)分泌失調(diào)，引起生殖功能障礙，甚至還會誘發(fā)惡性腫瘤[10-14]。我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749—2006）中規(guī)定DEP的限值為0.003 mg·L-1。因此，建立簡單、快速、高通量的分析方法，對環(huán)境水體和底泥中此類污染物進(jìn)行分析尤為必要。