馮湘沅，成莉鳳，段盛文，鄭 科，曾潔，劉正初

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙，410205)

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DCE01菌株降解大麻韌皮的發(fā)酵液成分變化規(guī)律

馮湘沅，成莉鳳，段盛文，鄭 科，曾潔，劉正初*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙，410205)

為闡明草本纖維植物的非纖維素物質(zhì)生物降解機理，采用高效脫膠菌株DCE01對大麻韌皮進行浸泡振蕩發(fā)酵，利用平板活菌計數(shù)法、DNS法、COD測定法、柱前衍生-高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中生物降解非纖維素物質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)的變化趨勢。結(jié)果表明：發(fā)酵液中DCE-01活菌量隨發(fā)酵時間延長而增加，6.5 h以后的增幅變緩；果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶的催化活性在發(fā)酵過程中逐漸增大，在10.5 h時最大，依次為411.4 IU/mL、521.4 IU/mL和45.6 IU/mL；COD值以及酶降解產(chǎn)物鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖等單糖類組分的含量均隨發(fā)酵時間延長而增加，而甘露糖被DCE01菌株用作碳源，其含量在19.8～23.6 μg/mL之間小幅度變化，葡萄糖含量則隨發(fā)酵時間延長呈現(xiàn)兩次先升后降的變化規(guī)律。

脫膠；大麻韌皮；發(fā)酵液；變化規(guī)律

大麻屬于一年生草本纖維植物，其纖維包裹在植株的韌皮部中。只有通過去除非纖維素物質(zhì)，才能獲取天然纖維用作紡織、造紙、生物質(zhì)材料等制造業(yè)的重要基礎(chǔ)材料[1-3]。其非纖維素的化學(xué)成分包括果膠、半纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)。果膠主要是由多聚半乳糖醛酸組成的高分子化合物；半纖維素包括甘露糖基、木糖基、鼠李糖基、半乳糖基、葡萄糖基及糖醛酸等一群復(fù)合聚糖，水解生成單糖類；木質(zhì)素是由多聚苯丙烷等構(gòu)成的天然高分子聚合物[4-5]。大麻韌皮膠質(zhì)中非纖維素成分的半纖維素含量最多[6]。針對這些物質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所開展了從自然界分離并采用基因工程手段，選育具有廣譜性和高效性的菌株能使草本纖維植物的非纖維素物質(zhì)得到降解的研究[7-8]。

本實驗采用高效脫膠菌株DCE01降解大麻韌皮中的非纖維素物質(zhì)并檢測分析其發(fā)酵液中的微生物活菌量、關(guān)鍵酶活力、COD值、酶解產(chǎn)物單糖類組分變化規(guī)律，旨在為草本纖維植物的非纖維素物質(zhì)生物降解機理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DCE01菌株：從自然界分離、篩選以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和紫外線誘變而獲得的一株廣譜性高效菌株。

原料：2013年種植、收獲的大麻韌皮原麻。

活化培養(yǎng)基：蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、牛肉浸膏，自來水，滅菌。

擴大培養(yǎng)基： MgSO4·7H2O、K2HPO4、NH4H2PO4、豆餅粉，自來水，滅菌。

固體培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂，自來水，滅菌。

1.2 主要儀器與試劑

儀器： Dionex Ultimate 3000 液相色譜儀配備VWD-3400紫外檢測器和Thermo Hypersil BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，超濾裝置(Vivaflow 200)，生化培養(yǎng)箱(SPX-250B型)，全溫振蕩器(RH-Q型)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA型)，ET99718COD測定儀(江蘇南通沃特環(huán)?？萍加邢薰?等。

試劑：甘露聚糖、果膠、木聚糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸均為美國Sigma公司產(chǎn)品，醋酸銨、1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮(PMP)、三氯甲烷、乙腈(色譜純)均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，COD試劑系江蘇南通沃特環(huán)?？萍加邢薰井a(chǎn)品。

1.3 色譜條件

流動相： V(乙腈)︰V(0.1 mol/L醋酸銨緩沖液 pH 5.5)=19︰81；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

1.4 菌懸液制備

挑取保存菌株DCE01菌苔一環(huán)接種至5 mL活化培養(yǎng)基，混勻，35 ℃靜置培養(yǎng)5 h；取1 mL稀釋涂布于固體培養(yǎng)基平皿，35 ℃靜置培養(yǎng)20 h；挑取典型菌落1個接入5 mL活化培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)4 h；倒入至100 mL擴大培養(yǎng)基，35 ℃，180 r/min培養(yǎng)6 h；取6 mL接種至300 mL擴大培養(yǎng)基，35 ℃，180 r/min培養(yǎng)6 h。

1.5 接種與脫膠

取6 mL菌懸液放入盛有300 mL自來水的錐形瓶中，混勻，投入15 g大麻(剪切為約3 cm長的片段)，置于35 ℃，180 r/min全溫振蕩器發(fā)酵。

1.6 取樣及樣品處理

從大麻韌皮接種振蕩0.5 h開始至10.5 h結(jié)束，每隔2 h取發(fā)酵液樣品一次。每瓶取樣20 mL(立即補充等量自來水)，混合后取1.0 mL用作活菌計數(shù)，再用0.2 μm 膜包(Vivaflow 200)進行分離，濾過液即為待測樣品。于4 ℃冰箱保存，備用。

1.7 測定方法

1.7.1 微生物活菌量測定

采用稀釋分離-平板活菌計數(shù)法。

1.7.2 關(guān)鍵酶活力測定

甘露聚糖酶底物配制： 0.05 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液(pH 6.0)配置 5.0 mg/mL 的甘露聚糖溶液，預(yù)熱至65 ℃。

果膠酶底物配制：0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0)配置 5.0 mg/mL 的聚半乳糖醛酸鈉溶液，預(yù)熱至50 ℃。

木聚糖酶底物配制：0.05 mol/L 檸檬酸-0.05 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.8)配置 5.0 mg/mL 的木聚糖溶液，預(yù)熱至60 ℃。

取上述底物2.0 mL，加入樣品1.0 mL，在相應(yīng)條件下反應(yīng)5 min后，滅活。加入DNS 2.0 mL，沸水浴顯色5.0 min，冰水浴冷卻，加入 ddH2O 定容至 15 mL。以滅活的發(fā)酵液作相同處理為陰性對照，在相應(yīng)波長下測定 OD值[9-10]。

1.7.3 COD測定

采用COD測定儀，按使用說明書操作。

1.7.4 單糖類組分測定

取濾過液50 mL蒸發(fā)干燥物0.2 g于具塞試管中，用適量濃度的三氟乙酸，110 ℃水解2 h，冷卻后獲得單糖類組分水解液。

混合標(biāo)準(zhǔn)單糖類溶液配制：準(zhǔn)確稱取各0.018 g的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，混合7種單糖類溶于7.5 mL的0.3 mol/L NaOH溶液。

單糖類衍生：依次取50 μL PMP甲醇(0.5 mol/L)和75 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)單糖類溶液或上述水解液混合，70 ℃溫度水浴反應(yīng)30 min，冷卻，加入75 μL HCl(0.3 mol/L)中和，干燥。用去離子水和氯仿各1 mL溶解，取上層水相(此步驟重復(fù)3次)。用0.45 μm濾膜過濾，濾液定容至5 mL，用作HPLC檢測分析[11-12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 微生物活菌量變化規(guī)律

從圖1可以看出：DCE01對大麻韌皮進行生物脫膠過程中，活菌量隨發(fā)酵時間延長而增加，發(fā)酵6.5 h以后的增幅變小，發(fā)酵10.5 h時發(fā)酵液中的活菌數(shù)達到5.01×109cfu/mL。

圖1 大麻韌皮發(fā)酵液中DCE01活菌量變化規(guī)律

2.1.2 關(guān)鍵酶催化活性變化規(guī)律

發(fā)酵過程中關(guān)鍵酶活測定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，三種麻類脫膠關(guān)鍵酶的催化活性均隨發(fā)酵時間延長而提高，發(fā)酵8.5 h以后的增幅變小；發(fā)酵10.5 h時，其果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶活力的最大值依次為411.4 IU/mL、521.4 IU/mL和45.6 IU/mL。

圖2 大麻韌皮發(fā)酵液中關(guān)鍵酶活變化規(guī)律

2.1.3 COD變化規(guī)律

發(fā)酵液的COD值測定結(jié)果(圖3)表明：從0.5 h(0.9 g/L)開始到 10.5 h(4.5 g/L)結(jié)束，COD值增加了5倍。雖然各時段的COD值都在增加，但增加速率最大的時段是4.5 ～ 6.5 h。

圖3 大麻韌皮發(fā)酵液中COD值變化規(guī)律

2.1.4 單糖類組分變化規(guī)律

從高效液相色譜分析結(jié)果(圖4和表1)可以看出：(1)酶降解產(chǎn)物—鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖等單糖類組分的含量均隨發(fā)酵時間延長而增加。半乳糖、木糖的含量由0.5 h的14.48 μg/mL、10.89 μg/mL 增加到10.5 h的97.72 μg/mL、98.24 μg/mL ，其增幅分別達到6.7倍和9倍；(2)另一種酶降解產(chǎn)物—甘露糖的含量一直在20 μg/mL左右波動；(3)葡萄糖的含量在2.5 h之前緩慢上升，由初始含量128.48 μg/mL上升到140.38 μg/mL，隨后出現(xiàn)下降，至6.5 h時含量為105.47 μg/mL，6.5～8.5 h的含量再上升至129.75 μg/mL，隨后再下降，10.5 h時含量為118.88 μg/mL。

圖4 大麻韌皮發(fā)酵液單糖類色譜圖

表1 大麻韌皮發(fā)酵液中單糖類組分含量測定結(jié)果

Tab.1 The results for determination of monosaccharides content in hemp bast fermentation broth

時間(h)發(fā)酵液單糖類組分含量(μg/mL)甘露糖鼠李糖葡萄糖醛酸半乳糖醛酸葡萄糖半乳糖木糖0.519.84.93//128.4814.4810.892.520.3810.91//140.3841.4212.844.520.9132.922.861.72132.7170.0352.376.52240.33.031.76105.4774.2867.928.522.8353.623.171.92129.7595.8496.810.523.1654.495.422118.8897.7298.24

2.2 討論

大麻韌皮接種DCE01菌株后，發(fā)酵過程中的微生物活菌量和關(guān)鍵酶催化活性隨發(fā)酵時間的延長而增加，說明DCE01菌株利用大麻韌皮水溶性物質(zhì)及降解產(chǎn)物為營養(yǎng)，不斷地繁殖并分泌脫膠關(guān)鍵酶。而COD值的增加，顯示發(fā)酵液的有機物增多，體現(xiàn)出酶對非纖維素的降解作用。

果膠酶降解產(chǎn)物半乳糖醛酸、木聚糖酶降解產(chǎn)物木糖的含量隨發(fā)酵時間延長而增加，說明發(fā)酵過程中的果膠酶催化活性較高，但降解的半乳糖醛酸含量偏低；甘露聚糖酶降解產(chǎn)物甘露糖被DCE01菌株當(dāng)作首選碳源而消耗，其含量一直在較低水平波動，表明DCE01有嗜好甘露糖的特性。值得探討的是：(1)葡萄糖含量在整個發(fā)酵液過程中呈兩次先升后降的變化規(guī)律，由此可推斷，起始階段通過原料吸水溶脹逐步溶出(包括淀粉被DCE01菌株的胞外淀粉酶降解)，兩次升降的出現(xiàn)，說明在發(fā)酵過程中有被DCE01菌株(或許包括雜菌)反復(fù)利用的可能。(2)發(fā)酵液中葡萄糖醛酸、半乳糖、鼠李糖等單糖類組分的來源問題有待深入研究，因為葡萄糖醛酸與半乳糖醛酸(果膠的組成成分)、半乳糖與甘露糖(半纖維素的組成成分)的分子式相同、分子結(jié)構(gòu)相近，可能是DCE01的胞外果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶降解聚半乳糖醛酸、甘露聚糖和木聚糖后使它們游離到了發(fā)酵液中。

3 結(jié)論

采用DCE01菌株對大麻韌皮進行浸泡振蕩發(fā)酵，通過定期取樣并分析樣品中生物降解非纖維素物質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)的變化趨勢，獲得結(jié)論如下：

(1)發(fā)酵過程中的DCE01活菌量，果膠酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶的催化活性以及鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖等酶降解單糖類組分的含量，COD值均隨發(fā)酵時間延長而增加。

(2)另一種酶降解產(chǎn)物——甘露糖被DCE01菌株用作碳源，其含量在20 μg/mL左右變化。

(3)來自于大麻韌皮的葡萄糖被DCE01菌株用作補充碳源，其含量隨發(fā)酵時間延長呈兩次先升后降的變化規(guī)律。

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The Change Law of Hemp Bast Fermentation Broth by Degradation using DCE01 Bacterial Strain

FENG Xiangyuan, CHENG Lifeng, DUAN Shengwen, ZHENG Ke, ZENG Jie, LIU Zhengchu*

(Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205, China)

In order to clarify the mechanism of bio-degumming for bast fiber crop by strain DCE01, the degradation data and change law of the fermentation broth were deeply analyzed by bacteria counting method, DNS method, COD detector, HPLC testing. The results indicated that the living cell concentration increased with the extension of fermentation time, and it had descending growth after 6.5 h; pectinase, mannanase and xylanase activity gradually increased during fermentation, followed by 411.4 IU/mL, 521.4 IU/mL and 45.6 IU/mL resepectively; the COD values and the content of enzymatic hydrolysates (rhamnose, glucuronic acid, galacturonic acid, galactose, and xylose) increased with time increasing. Mannose may be used as carbon source by DCE01 strains, and the concentration was 19.8～23.6 μg/mL. The change of glucose levels was presented twice with the rule of rising first and falling later.

degumming；hemp bast； fermentation broth；change rule

1671-3532(2016)05-0202-05

2016-04-28

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IBFC08)；國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(No.CARS-19-E24)；湖南省自然科學(xué)基金(No. 2016jj3126)

馮湘沅(1964-)，女，高級實驗師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工微生物研究。E-mail： fxysun@163.com

*通訊作者：劉正初(1956-)，男，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工微生物研究。E-mail：ibfclzc@189.cn

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