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      基因芯片快速檢測分枝桿菌技術(shù)輔助診斷小兒結(jié)核病的臨床研究

      2016-11-30 05:34熊麗君阮琰嚴(yán)紅梅唐偉偉陳曉紅
      中外醫(yī)療 2016年29期
      關(guān)鍵詞:結(jié)核病小兒

      熊麗君+阮琰+嚴(yán)紅梅+唐偉偉+陳曉紅+林劍東+黃明翔

      [摘要] 目的 探討基因芯片快速檢測分枝桿菌技術(shù)在輔助診斷小兒結(jié)核病方面的臨床研究。方法 方便選取2014年7月—2015年7月住于該院的經(jīng)臨床、放射線疑診0~14歲肺結(jié)核77例為觀察對象,采用晶芯@結(jié)核病分子診斷系統(tǒng)對觀察對象痰標(biāo)本進(jìn)行檢測,將檢測結(jié)果與最終診斷相比較,并與羅氏痰培養(yǎng)結(jié)核菌法、痰涂片找結(jié)核菌、DNA檢測、PPD試驗(yàn)、結(jié)核抗體、對INH\RFP耐藥性及對非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果進(jìn)行對比,分別計(jì)算各檢測方法的靈敏度和特異度,從而判斷基因芯片技術(shù)在診斷兒童結(jié)核病可行性、敏感、快速。結(jié)果 重癥結(jié)核感染17例,其中有9例(11.69%)為血行播散型肺結(jié)核,7例(9.09%)合并有結(jié)核性腦膜炎,1例(1.3%)合并骨結(jié)核。檢測異煙肼耐藥相關(guān)基因,基因芯片法和羅氏培養(yǎng)法比較χ2 =2.286,P=0.515,Kappa=0.604,檢測利福平耐藥相關(guān)基因,基因芯片法和羅氏培養(yǎng)法比較χ2 =58.77,P<0.05,Kappa=0.587?;蛐酒ㄅc羅氏培養(yǎng)法、PPD試驗(yàn)、結(jié)核DNA、結(jié)核抗體、痰涂片多重比較,χ2 =64.91,P<0.05。 結(jié)果 基因芯片法可以快速檢測結(jié)核分枝桿菌,與羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌擁有中等一致性,其快速、無創(chuàng),可以用于輔助診斷小兒結(jié)核病。

      [關(guān)鍵詞] 小兒;結(jié)核?。换蛐酒?/p>

      [中圖分類號] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742(2016)10(b)-0050-04

      [Abstract] Objective To investigate the clinical study of rapid detection of Mycobacterium tuberculosis by gene chip in the diagnosis of pediatric tuberculosis. Methods Convenient selection clinical, X-ray suspected 0-14 years old pulmonary tuberculosis 70 cases in July 2014 to July 2015 live in our hospital as the observation object by Jingxin @ TB molecular diagnostic system of the observed object sputum specimens were detected, test results and final diagnosis was compared, in parallel with Roche sputum Mycobacterium tuberculosis, sputum smear, culture on the find tuberculosis bacteria, DNA testing, the PPD test, tuberculosis antibody, on drug resistance of INH\RFP and of non tuberculosis mycobacterium species identification results were compared were calculated sensitivity and specificity of the detection method, in order to determine the gene chip technique in the diagnosis of childhood tuberculosis feasibility, sensitive, rapid. Results 17 cases of severe tuberculosis infection, including 9 cases (11.69%) were blood disseminated pulmonary tuberculosis, 7 cases (9.09%) with tuberculous meningitis, 1 cases (1.3%) with bone tuberculosis. Detection of isoniazid resistant related genes and gene chip method and Roche culture method χ2=2.286, P = 0.515, Kappa = 0.604, detection of rifampin resistance related gene, gene chip method and Roche culture method χ2=58.77, P < 0.05, Kappa =0.587. Gene chip and Roche culture method, PPD test, tuberculosis DNA, tuberculosis antibody, sputum smear multiple comparison. χ2=64.91, P < 0.05. Conclusion The gene chip method can quickly detect Mycobacterium tuberculosis, and the Roche culture method for detection of Mycobacterium tuberculosis with moderate consistency, its rapid, noninvasive, can be used for the diagnosis of tuberculosis in children.

      [Key words] Children; Tuberculosis; Gene chip method

      據(jù)2014年8月國家結(jié)核病預(yù)防控制中心與國際防癆與肺部疾病聯(lián)合會(huì)召開的會(huì)議,WHO人員預(yù)計(jì)我國兒童結(jié)核病的患者例數(shù)應(yīng)占總?cè)丝诨颊呃龜?shù)的6%[1]。多個(gè)地區(qū)的調(diào)查結(jié)果也顯示兒童耐藥結(jié)核病發(fā)病率有所升高。然而由于兒童結(jié)核病痰涂片率及陽性率低,這些都給兒童結(jié)核病的診斷帶來更大困難。兒童結(jié)核病的漏診和誤診較高,在臨床工作中,高靈敏度、高特異性、耗時(shí)短的檢測技術(shù)能帶來更大的便利。眾所周知,各種結(jié)核桿菌的耐藥均由于基因突變或基因轉(zhuǎn)化,該研究采用晶芯@結(jié)核病分子診斷系統(tǒng)完成于2014年7月—2015年7月住于該院77例疑似結(jié)核病兒童的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測,其結(jié)果與最終診斷相比較,并與PPD試驗(yàn)、結(jié)核DNA、痰涂片、痰培養(yǎng)結(jié)核菌檢測結(jié)果進(jìn)行對比,分別計(jì)算各檢測方法在診斷結(jié)核病及判斷異煙肼和利福平耐藥情況的靈敏度和特異度,同時(shí)計(jì)算出檢測非結(jié)核分枝桿菌的靈敏度和漏診率,從而判斷基因芯片技術(shù)在診斷兒童結(jié)核病是否有更可靠、敏感、快速的意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料

      方便選取入住于福州肺科醫(yī)院疑似肺結(jié)核兒童77例,年齡0~14歲,其中男童41例,女童36例,該研究經(jīng)福州肺科醫(yī)院倫理委員會(huì)同意,所有入組患兒均取得患兒家屬知情同意。

      1.2 疑似臨床結(jié)核病判斷指標(biāo)

      臨床上均有咳嗽、發(fā)熱2周以上,同時(shí)具有下列一項(xiàng):①結(jié)核中毒癥狀或結(jié)核病接觸史;②胸片顯示肺結(jié)核征象;③結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)試驗(yàn)48~72 h直徑≥10 mm。排除近期抗結(jié)核治療超過1個(gè)月者。

      1.3 標(biāo)本采集

      入院后24 h內(nèi)完成對標(biāo)本采集,對3歲以下無法自行吐痰者,均于晨起空腹拍背10 min后,吸引器接痰杯負(fù)壓吸引法留取痰標(biāo)本5 mL,3歲及3歲以上兒童鼓勵(lì)患兒漱口后自行咳痰5 mL,分別檢測痰涂片找結(jié)核菌、痰結(jié)核DNA、痰培養(yǎng)結(jié)核菌(羅氏培養(yǎng)法)、基因芯片技術(shù)檢測。所有患兒入院24 h內(nèi)均行PPD試驗(yàn),72 h判讀結(jié)果。其余與診斷相關(guān)的檢查如生化、胸片、肺部CT等按照診斷標(biāo)準(zhǔn)所需進(jìn)行檢查。

      1.4 基因芯片技術(shù)檢測

      該院檢驗(yàn)科對收集的痰標(biāo)本24 h內(nèi)進(jìn)行基因芯片技術(shù)檢測,過程包括:樣品制備、芯片反應(yīng)與洗干、結(jié)果判讀,整個(gè)過程不超過24 h,所有操作流程均嚴(yán)格按照儀器使用說明書進(jìn)行。所有儀器均由博奧生物有限公司生產(chǎn)。

      1.4.1 樣品制備 3 h內(nèi)可以鑒定結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌,6 h鑒定非結(jié)核分枝桿菌類型,及判斷異煙肼及利福平的耐藥情況。將消化液(10 mL 4%碳酸氫鈉、10 mL 2.94%檸檬酸三鈉、0.1 g N-乙酰-L-半胱氨酸)預(yù)處理好的痰標(biāo)本放入晶芯ExtractorTM核酸快速提取儀中提取核酸,再將提取的核酸加入基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增,并在4℃保存。

      1.4.2 芯片反應(yīng)與洗干 基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后加入到結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒的芯片點(diǎn)陣中,然后放入晶芯Biomixer芯片雜交儀進(jìn)行芯片反應(yīng)。再將完成雜交的芯片放入晶芯Slide WasherTM芯片洗干儀中進(jìn)行洗干。

      1.4.3 結(jié)果判讀 將洗干的芯片載入晶芯LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀中,自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果判讀。

      1.5 統(tǒng)計(jì)方法

      用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,利用傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)菌和藥敏試驗(yàn)的檢測結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)對基因芯片技術(shù)的檢測結(jié)果進(jìn)行比對,計(jì)算基因芯片法的靈敏度、特異度和符合率,用χ2 檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)分析藥敏實(shí)驗(yàn)與基因芯片結(jié)果的一致性;另外計(jì)算痰涂片找結(jié)核菌、PPD試驗(yàn)、血結(jié)核抗體、痰結(jié)核DNA的陽性率,與基因芯片法的陽性率應(yīng)用χ2 檢驗(yàn)相比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 患兒臨床資料

      該研究共收集77例最終診斷肺結(jié)核患兒,其中1例為非結(jié)核分枝桿菌感染,其余76例均考慮為結(jié)核分枝桿菌感染。77例患兒平均年齡7.86歲,最小的和最大的分別為2月和14歲,其中男童平均年齡(7.09±5.01)歲,女童(8.73±5.05)歲,均為初治患兒。

      2.2 基因芯片法與羅氏培養(yǎng)法分別檢測異煙肼和利福平耐藥基因及藥敏結(jié)果比較

      兩種方法檢測KatG、inhA以及rpoB突變的耐藥和藥敏情況,見表1、表2。

      2.3 基因芯片法與痰涂片找結(jié)核菌、PPD試驗(yàn)、血結(jié)核抗體、痰結(jié)核DNA檢測結(jié)果比較

      3 結(jié)語

      該研究中,重癥結(jié)核感染17例,其中有9例(11.69%)為血行播散型肺結(jié)核,7例(9.09%)合并有結(jié)核性腦膜炎,1例(1.3%)合并骨結(jié)核,早期診斷兒童結(jié)核感染,以避免發(fā)展為重癥結(jié)核甚至危及生命顯得至關(guān)重要。傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法一直是臨床診斷結(jié)核感染的金標(biāo)準(zhǔn),但其耗時(shí)長,對標(biāo)本及操作人員技術(shù)要求嚴(yán)格,在臨床應(yīng)用上具有一定的局限性。目前臨床醫(yī)師多數(shù)綜合患兒臨床特征、PPD結(jié)果、結(jié)核病接觸史、結(jié)核DNA、結(jié)核抗體、影像學(xué)表現(xiàn)及痰涂片結(jié)核菌等來診斷兒童結(jié)核病,多數(shù)為臨床診斷,因標(biāo)本取材困難,難以做到實(shí)驗(yàn)室確診,若疑似結(jié)核感染患兒要等待痰培養(yǎng)結(jié)核菌結(jié)果再確診后治療,可能會(huì)引起結(jié)核播散、發(fā)展為重癥結(jié)核乃至危及生命。而檢測基因芯片法用于結(jié)核病的輔助診斷,利用靈敏度高、特異性高、簡便、快速的優(yōu)勢,可在臨床基礎(chǔ)醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣[2]。因基因芯片檢測對實(shí)驗(yàn)室要求較高,縣級結(jié)防機(jī)構(gòu)也可運(yùn)送標(biāo)本至地市級醫(yī)院檢測,標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)更適合于人口稠密的中東部地區(qū)[3]。

      該研究中,基因芯片法靈敏度為48.05%,漏診率51.95%,靈敏度高于羅氏培養(yǎng)法45.45%,漏診率低于羅氏培養(yǎng)法54.55%,而痰涂片找結(jié)核菌的漏診率最高79.22%,PPD的靈敏度較高59.74%,漏診率較低51.95%,分析基因芯片法檢測結(jié)核菌的靈敏度較成人報(bào)道[4]低,可能與兒童取標(biāo)本困難有關(guān)。將基因芯片法與羅氏培養(yǎng)法、PPD試驗(yàn)、結(jié)核DNA、結(jié)核抗體、痰涂片多重比較,χ2=64.91,P<0.05,說明6種檢測方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在臨床工作中應(yīng)采用多種方法聯(lián)合檢驗(yàn),以綜合各自不足互補(bǔ)。對于異煙肼的耐藥性基因芯片檢測技術(shù)與羅氏培養(yǎng)結(jié)核菌的符合率為0.604,而利福平耐藥性兩種方法的Kappa=0.587,均為中等一致性,與國內(nèi)部分學(xué)者研究結(jié)果相似。近些年,隨著基因芯片技術(shù)的推廣,其用于檢測結(jié)核菌及判斷異煙肼和利福平耐藥性的相關(guān)文獻(xiàn)也越來越多。李衛(wèi)彬等[5]用基因芯片技術(shù)對初治涂陽患者異煙肼耐藥的檢測效果與金標(biāo)準(zhǔn)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,靈敏度為92.59%,Kappa值為0.51,陽性預(yù)測值為46.51%;檢測復(fù)治涂陽患者異煙肼耐藥的靈敏度為92.59%,Kappa值為0.76,陽性預(yù)測值為78.13%;檢測初治涂陽患者利福平耐藥的敏感度為90.48%,Kappa值為0.82,陽性預(yù)測值為76%;檢測復(fù)治涂陽患者利福平耐藥的靈敏度為91.18%,Kappa值為0.82,陽性預(yù)測值為88,57%。歐維正等[6]對比基因芯片法和比例法藥物敏感試驗(yàn)檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼和利福平耐藥性,基因芯片法和比例法藥物敏感試驗(yàn)檢測MTB對RFP耐藥性的符合率93.27%,對INR耐藥性的符合率95.11%,且基因芯片法較比例法藥物敏感試驗(yàn)具有更高的敏感性和特異性。值得注意的是,對于檢測標(biāo)本是否存在異煙肼耐藥,基因芯片法和羅氏培養(yǎng)法P>0.05,說明兩種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而對于檢測利福平耐藥方面,基因芯片法和羅氏培養(yǎng)法卡方檢驗(yàn)P<0.05,說明兩種方法在檢測利福平耐藥方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      國外關(guān)于應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測異煙肼和利福平耐藥性的研究也較多,臺灣Shu-Ting Tseng等[7]分析70例異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌,有15例katG基因突變,2例inhA基因突變。墨西哥E. Yu. Nosova等[8]對比分析基因芯片、Xpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus 3種方法快速檢測痰標(biāo)本結(jié)核菌DNA及耐藥情況,3者的檢出率分別是78%、92%、49%,得出結(jié)論XpertMTB/RIF方法檢測結(jié)核DNA是最有效的,但是基因芯片法是唯一一種既能快速檢測出結(jié)核菌DNA,也可判斷多重耐藥結(jié)核菌感染的方法。

      總之,基因芯片法擁有快速檢出結(jié)核分枝桿菌感染,并判斷異煙肼和利福平耐藥性,并可檢出非結(jié)核分枝桿菌,但它也有局限性,如檢測兒童結(jié)核分枝桿菌感染的靈敏度并不高。在兒童標(biāo)本采集及檢測方面都有待進(jìn)一步提高。相信隨著結(jié)核病診斷技術(shù)的不斷提高,進(jìn)一步加強(qiáng)地方結(jié)核病防治所的結(jié)核病規(guī)范化治療,兒童結(jié)核病能得到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療,勢必能減少未來重癥結(jié)核病和耐多藥結(jié)核的發(fā)生。

      [參考文獻(xiàn)]

      [1] 中國結(jié)核病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心,國家防癆與肺部疾病聯(lián)合會(huì),兒童結(jié)核防治研討會(huì)會(huì)議材料[Z].北京:中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心,2014.

      [2] 李艷英.基層常用結(jié)核病診斷方法及展望[J].臨床肺科雜志,2012,17(11):2103-2104.

      [3] 劉保華,逢宇,張治英,等.縣級運(yùn)送痰標(biāo)本至地市開展基因芯片耐藥檢測的成本分析[J].中國防癆雜志,2015,37(6):611-615.

      [4] 梁桂亮,李曉非,歐陽兵,等.基因芯片檢測技術(shù)在結(jié)核病診斷中的運(yùn)用[J].臨床肺科雜志,2015,20(7):1234-1237.

      [5] 李衛(wèi)彬,李新旭,張彤群,等.基因芯片檢測技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼和利福平耐藥的實(shí)際應(yīng)用效果評價(jià)[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2012,6(16):4666-4670.

      [6] 歐維正,駱科文,王燕,等.基因芯片和比例法藥物敏感試驗(yàn)檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼和利福平耐藥性的比較研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,28(5):404-407.

      [7] Shu -Ting Tsenga,Chun-Hsi Taia,et al.The mutations of katG and inhA genes of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Taiwan[J].Journal of Microbiology, Immunology and Infection,2015,48(3):249-255.

      [8] E. Yu. Nosova,M.A.Krasnova,et al. Comparative analysis of TB-Biochip, Xpert MTB/RIF, and GenoType MTBDRplus test systems for rapid determination of mutations responsible for drug resistance of M. tuberculosis complex (in sputum from patients in Moscow region)[J].Molekulyarnaya Biologiya, 2013, 47(2): 267-274.

      (收稿日期:2016-07-16)

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