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南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科1 (210002) 南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床學(xué)院2

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糖分子探針與炎癥因子、Claudin-8在結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性改變中的相關(guān)性*

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南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科1(210002) 南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床學(xué)院2

背景：腸黏膜通透性改變是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。糖分子探針是檢測(cè)通透性的一種安全無(wú)創(chuàng)的方法，其與炎癥因子、claudin-8在黏膜通透性改變中的相關(guān)性尚不明確。目的：探討糖分子探針與TNF-α、CRP和claudin-8在結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性改變中的相關(guān)性。方法： 24只大鼠隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組，以DSS溶液制備結(jié)腸炎模型。ELISA法檢測(cè)TNF-α、CRP表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)claudin-8表達(dá)，高效液相色譜儀檢測(cè)糖分子探針含量，分析炎癥因子、claudin-8與糖分子探針的相關(guān)性。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，模型組結(jié)腸組織TNF-α、CRP表達(dá)顯著升高(P<0.01)；claudin-8表達(dá)顯著降低(P<0.01)；乳果糖和三氯蔗糖排出量以及乳果糖/甘露醇比值明顯升高(P<0.01)，甘露醇排出量明顯降低(P<0.01)。乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)，與claudin-8表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；而乳果糖/甘露醇比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與claudin-8表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論：糖分子探針與TNF-α、CRP以及claudin-8表達(dá)在提示大鼠腸黏膜通透性改變上的結(jié)果一致。糖分子探針可作為一種反映腸黏膜通透性改變的潛在檢測(cè)方法。

通透性； 分子探針； 腫瘤壞死因子α； C反應(yīng)蛋白質(zhì)； claudin-8； 結(jié)腸炎, 潰瘍性

Colitis, Ulcerative

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種腸道慢性炎癥性疾病，腸黏膜屏障功能損傷是UC發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。TNF-α在UC患者結(jié)腸組織和巨噬細(xì)胞表面均有表達(dá)，血清TNF-α水平與反映疾病活動(dòng)度的臨床和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)密切相關(guān)。CRP在炎癥性腸病與腸道功能性疾病的鑒別診斷中起重要作用，UC患者血清CRP含量明顯升高，與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為檢測(cè)UC病情進(jìn)展的重要參數(shù)。Claudin是一種四次跨膜的結(jié)構(gòu)蛋白，是細(xì)胞間隙通透性的重要調(diào)節(jié)因子。UC活動(dòng)期結(jié)腸上皮細(xì)胞claudin-8亞型與上皮細(xì)胞間隙通透性有密切的關(guān)系。糖分子探針通過(guò)口服一定劑量的糖，檢測(cè)糖在代謝過(guò)程中的消耗量來(lái)評(píng)估胃腸道吸收情況，從而間接反映胃腸黏膜受損情況，特定糖的吸收部位有所不同，故可根據(jù)糖的種類確定受損部位。目前糖分子探針與炎癥因子、claudin-8在黏膜通透性改變中的相關(guān)性尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)大鼠尿液中糖分子探針含量，旨在對(duì)其與炎癥因子、claudin-8在UC腸黏膜通透性中的相關(guān)性作一分析。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，3月齡，體質(zhì)量(200±20) g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)鼠籠中，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

二、研究方法

1. 模型制備：SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組和模型組，每組各12只，正常對(duì)照組大鼠自由飲水進(jìn)食，模型組大鼠自由飲用DSS溶液7 d，建立結(jié)腸炎模型。每日測(cè)定大鼠體質(zhì)量，糞便隱血試驗(yàn)陽(yáng)性甚至出現(xiàn)肉眼血便，表示造模成功。

2. 取材和標(biāo)本處理：造模成功后，采取灌胃法分別口服2 mL 0.06 g/mL乳果糖、0.04 g/mL甘露醇、0.03 g/mL三氯蔗糖。10%的麝香草酚加入異丙醇配制成100 mL溶液，以阻止細(xì)菌降解尿糖。大鼠禁水3 h。收集24 h尿液。麻醉后處死大鼠，取結(jié)腸遠(yuǎn)端長(zhǎng)約0.5 cm的組織，置于4%甲醛溶液中固定，用于HE染色和免疫組化染色。其余結(jié)腸組織-20 ℃保存，用于檢測(cè)TNF-α和CRP水平。

3. ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織TNF-α、CRP水平：將結(jié)腸組織配制成勻漿液后離心，經(jīng)稀釋、加樣、洗滌、孵育后測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm處的A值。BCA法定量，用上清液蛋白含量對(duì)樣品中炎癥因子含量進(jìn)行再校正。

4. 免疫組化法檢測(cè)claudin-8表達(dá)：取各組大鼠結(jié)腸組織切片，按試劑盒說(shuō)明書(shū)行免疫組化二步法(一抗和二抗的工作濃度分別為 1∶100 和 1∶10)。

結(jié)果判斷：細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙呈棕黃色為claudin-8陽(yáng)性表達(dá)。用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野，高倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，參照王娟等[1]的研究方法，半定量計(jì)算claudin-8陽(yáng)性表達(dá)。

5. HPLC法：尿樣、標(biāo)準(zhǔn)樣置于氮?dú)猸h(huán)境中，75 ℃溫箱干燥。冷卻后每管加100 μL肟化液，75 ℃溫箱放置30 min。冷卻后每管加100 μL N-3甲基硅烷咪唑，75 ℃溫箱放置15 min，冷卻。采用HPLC檢測(cè)尿液中乳果糖、甘露醇、三氯蔗糖含量，計(jì)算乳果糖/甘露醇(L/M)比值，具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

其中，HU（Hounsfield Unit）為三維空間中每個(gè)單元對(duì)于二維圖像的CT值，ρa(bǔ)sh為灰度密度值，E為相應(yīng)位置單元材料的彈性模量，單位為MPa。通過(guò)Mimics材料賦值模塊，完成骨骼網(wǎng)格模型的非均勻單元賦值。

結(jié) 果

一、HE染色

正常對(duì)照組黏膜上皮完整，細(xì)胞形態(tài)正常，杯狀細(xì)胞可見(jiàn)，腺體排列整齊，黏膜下層、肌層、漿膜層結(jié)構(gòu)清晰。模型組黏膜上皮壞死脫落，上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞減少，隱窩破壞；炎癥滲出，典型潰瘍形成，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞為主，可見(jiàn)出血性壞死(圖1)。表明成功制備結(jié)腸炎模型。

A：正常對(duì)照組；B：模型組

二、炎癥因子水平

與正常對(duì)照組相比，模型組結(jié)腸組織TNF-α[(8.51±1.55) pg/mg對(duì)(2.21±0.38) pg/mg,P<0.01]、CRP[(161.80±35.60) ng/mg對(duì)(50.50±5.90) ng/mg,P<0.01]表達(dá)均顯著升高。

三、免疫組化染色

模型組claudin-8陽(yáng)性表達(dá)主要定位于上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙，正常對(duì)照組claudin-8表達(dá)較低，可見(jiàn)上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞少量表達(dá)(圖2)；模型組claudin-8表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低(0.100±0.007對(duì)0.200±0.011，P<0.01)。

A：正常對(duì)照組；B：模型組

四、分子探針含量

與正常對(duì)照組相比，模型組乳果糖排出量、三氯蔗糖排出量明顯升高(P<0.01)，L/M比值明顯升高(17.55±5.02對(duì)0.80±0.69，P<0.01)，甘露醇排出量顯著降低(P<0.01)(圖3)。

五、相關(guān)性分析

乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)，與claudin-8表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；L/M 比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與claudin-8表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。

圖3 兩組大鼠糖分子探針排出量比較(HPLC法)

討 論

目前研究認(rèn)為UC的發(fā)病機(jī)制可能與環(huán)境、遺傳、免疫等因素共同作用所致的腸黏膜屏障功能損傷有關(guān)[2]。腸黏膜通透性改變可能是發(fā)病的基礎(chǔ)。

腸黏膜局部炎癥反應(yīng)是UC發(fā)生、發(fā)展的主要病理機(jī)制，與一系列細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)有關(guān)。TNF-α是一種前炎癥因子，主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和分化的T細(xì)胞分泌，可刺激免疫細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6，上調(diào)黏附分子和促凝血因子的表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞毒性急性反應(yīng)[3]。Olsen等[4]發(fā)現(xiàn)，組織TNF-α水平與局部炎癥反應(yīng)的分級(jí)呈正相關(guān)。有研究[5]發(fā)現(xiàn)claudin-8在結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)降低，導(dǎo)致緊密連接中斷，提示claudin-8可能與UC的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)。有研究認(rèn)為，UC患者的CRP與臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡下表現(xiàn)以及組織學(xué)表現(xiàn)有較好的相關(guān)性[6-7]；CRP亦可提示UC患者內(nèi)鏡下腸道表現(xiàn)[8]。

糖分子探針可對(duì)尿液中的糖進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需取血，是目前公認(rèn)的檢測(cè)胃腸黏膜損傷的無(wú)創(chuàng)性方法[9]。目前有三類糖分子探針：第一類糖探針在離開(kāi)胃時(shí)就已完全被破壞，如蔗糖，用于檢測(cè)上胃腸道黏膜通透性；第二類糖探針在離開(kāi)小腸時(shí)就已完全被破壞，如乳果糖、甘露醇，用于檢測(cè)小腸黏膜通透性；第三類糖探針全程均不降解，如三氯蔗糖，用于檢測(cè)全消化道黏膜通透性[10]。乳果糖和甘露醇在腸道內(nèi)的吸收途徑不同[11]，乳果糖分子質(zhì)量為342 kDa (1 Da=0.992 1 u)，通過(guò)小腸黏膜上皮細(xì)胞間的靜脈連接吸收；甘露醇分子質(zhì)量為182 kDa，通過(guò)小腸上皮細(xì)胞膜的水溶性微孔吸收。進(jìn)入血液循環(huán)后兩者均不易代謝，最終從尿液中排出，因此可通過(guò)定量尿液中兩者的含量，反應(yīng)其吸收量。尿液中L/M比值升高，表明上皮細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如腸黏膜緊密連接破壞，區(qū)域性腸上皮細(xì)胞缺失或絨毛末梢損傷，并因此造成黏膜通透性增加，組織間隙水腫。故測(cè)定尿液中L/M比值可較為準(zhǔn)確地反映腸黏膜通透性的改變[12]。

結(jié)合多種檢測(cè)方法可較為準(zhǔn)確地反映腸黏膜的改變。目前臨床上主要通過(guò)結(jié)腸鏡觀察黏膜的潰瘍性改變，并通過(guò)取活檢觀察黏膜超微結(jié)構(gòu)的改變來(lái)了解腸道損傷情況，有時(shí)還需進(jìn)一步采取免疫組化檢測(cè)炎癥因子來(lái)了解腸黏膜損傷情況，但這些檢測(cè)耗時(shí)且費(fèi)用不低。而糖分子探針是一種更為簡(jiǎn)單易行、創(chuàng)傷小、費(fèi)用低、安全可靠的檢測(cè)方法。本研究首先成功構(gòu)建了結(jié)腸炎大鼠模型，再分別利用結(jié)腸組織TNF-α、CRP、claudin-8表達(dá)以及糖分子探針檢測(cè)大鼠腸道通透性的改變。結(jié)果顯示模型組大鼠表現(xiàn)為典型的結(jié)腸炎改變，黏膜上皮壞死脫落，炎癥滲出，典型潰瘍形成，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)出血性壞死。L/M比值和三氯蔗糖排出量明顯改變，提示結(jié)腸炎時(shí)腸黏膜通透性發(fā)生改變。且模型組TNF-α、CRP表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組，說(shuō)明結(jié)腸炎時(shí)腸道發(fā)生炎癥性改變，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4-5,13]；緊密連接蛋白claudin-8表達(dá)明顯降低，提示腸黏膜通透性發(fā)生改變。上述結(jié)果與糖分子探針一致，共同反映了腸黏膜的炎癥損害。相關(guān)性分析顯示乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈正相關(guān)，與claudin-8表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；而L/M比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與claudin-8表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上所述，糖分子探針與TNF-α、CRP、claudin-8表達(dá)在提示大鼠腸黏膜通透性改變上具有一致性。有望作為臨床上檢測(cè)腸黏膜通透性的無(wú)創(chuàng)方法，具有較好的臨床使用前景。

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(2016-03-08收稿；2016-04-03修回)

Correlation of Sugar Molecular Probes with Inflammatory Factors and Claudin-8 in Intestinal Permeability in Colitis Rats

SHIHui1,2,WANGZhenkai1,WANGShaodong1,LUYouke1,WANGFangyu1.

1DepartmentofGastroenterologyandHepatology,JinlingHospitalofNanjingMilitaryCommandofPLA,Nanjing(210002);2SouthernMedicalUniversity,SchoolofMedicine,Guangzhou

WANG Fangyu, Email: wangfy65@nju.edu.cn

Permeability; Molecular Probes; Tumor Necrosis Factor-alpha; C-Reactive Protein; Claudin-8;

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.10.006

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院青年課題基金(批準(zhǔn)號(hào)：2008021)、中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助(201150M1575)、中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助(2012T50895)

#Email: 32767572@qq.com

▲本文通信作者， Email: wangfy65@nju.edu.cn

Background: Intestinal permeability plays an important role in the development of ulcerative colitis. Sugar molecular probes is a safe and non-invasive method to measure intestinal permeability, and its correlation with inflammatory factors and claudin-8 is not clear. Aims: To explore the correlation of sugar molecular probes with TNF-α, CRP and claudin-8 in intestinal permeability in colitis rats. Methods: Twenty-four rats were assigned randomly to model group and normal control group. Colitis model was induced by DSS solution. Expressions of TNF-α, CRP were determined by ELISA, and expression of claudin-8 was determined by immunohistochemistry. Sugar molecular probes were determined by high performance liquid chromatography. Correlations of inflammatory factors and claudin-8 with sugar molecular probes were analyzed. Results: Compared with normal control group, expressions of colonic tissue TNF-α and CRP were significantly increased while expression of claudin-8 was significantly decreased in model group (P<0.01); secretion of lactulose and sucrolose, ratio of lactulose/mannitol (L/M) were significantly increased (P<0.01) while mannitol secretion was significantly decreased (P<0.01). Secretion of lactulose and sucrolose were positively correlated with expressions of TNF-α and CRP (P<0.01), but negatively with expression of claudin-8 (P<0.01). L/M ratio and mannitol secretion were negatively correlated with expressions of TNF-α and CRP (P<0.01), but positively with expression of claudin-8 (P<0.01). Conclusions: Sugar molecular probes and expressions of TNF-α, CRP, claudin-8 have similar results in predicting intestinal permeability in rats. Sugar molecular probes can be used as a potential method to measure intestinal permeability.