周 慧 羅聲政 錢月琴 陸倫根

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(201620)

?

高脂飲食誘導(dǎo)高膽汁酸通過下調(diào)干細(xì)胞功能損傷腸黏膜

周 慧*羅聲政 錢月琴 陸倫根#

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(201620)

背景：高脂飲食可破壞腸道黏膜屏障功能，但機(jī)制未明。高脂飲食可誘導(dǎo)膽汁酸產(chǎn)生增加。目的：探討高脂飲食誘導(dǎo)的高膽汁酸通過下調(diào)小腸干細(xì)胞功能損傷腸黏膜。方法：將24只大鼠分為3組，分別給予常規(guī)飲食、高脂飲食、高脂飲食+考來烯胺，連續(xù)2周。采用ELISA法測定血清膽汁酸濃度，測量小腸直徑，行HE染色觀察小腸黏膜組織學(xué)表現(xiàn)，以RT-qPCR檢測Lgr5基因表達(dá)。體外研究將常規(guī)飲食大鼠的回腸組織與脫氧膽酸(DCA)或DCA+考來烯胺共培養(yǎng)24 h，以RT-qPCR檢測Lgr5基因表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，高脂飲食組血清膽汁酸濃度明顯升高(P<0.05)，腸管直徑明顯降低(P<0.05)，腸道絨毛+隱窩長度明顯降低(P<0.05)，Lgr5基因表達(dá)明顯降低(P<0.01)；給予考來烯胺后，上述指標(biāo)均明顯改善(P<0.05)。DCA組Lgr5基因表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而考來烯胺可明顯上調(diào)Lgr5表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：高脂飲食引起的循環(huán)高膽汁酸通過下調(diào)小腸干細(xì)胞功能破壞腸道黏膜，而考來烯胺可改善此病理過程。

膳食，高脂； 膽汁酸； 脫氧膽酸； 干細(xì)胞； 考來烯胺

近數(shù)十年來隨著我國人民飲食結(jié)構(gòu)的西方化，高脂飲食與炎癥性腸病等疾病的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。實(shí)驗(yàn)、臨床和流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明高脂飲食可損傷腸道黏膜的屏障功能[1-3]，但具體作用機(jī)制目前尚未完全闡明。高脂飲食可導(dǎo)致膽汁酸產(chǎn)生增加，尤其是脫氧膽酸(deoxycholic acid, DCA)的增加[4]。膽汁酸具有促進(jìn)脂類和脂溶性維生素消化吸收、調(diào)節(jié)膽固醇代謝的作用[5]。但高濃度膽汁酸尤其是疏水的次級膽汁酸如DCA具有細(xì)胞毒性。在膽汁酸腸肝循環(huán)[5]中，末段回腸上皮細(xì)胞暴露于強(qiáng)疏水性的次級膽汁酸和非結(jié)合膽汁酸中，大大增加了其遭受膽汁酸攻擊的危險(xiǎn)。腸道是能快速增殖再生的器官。腸上皮層隱窩底部儲存著一些可分化為更成熟、特有的腸道細(xì)胞的成體干細(xì)胞，可不斷地補(bǔ)充腸黏膜上皮細(xì)胞。Barker等[6]于2007年發(fā)現(xiàn)了腸上皮干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物L(fēng)gr5蛋白，其表達(dá)提示干細(xì)胞快速分化以及再生為完整絨毛的功能。Luu[7]的研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食動物模型中間充質(zhì)干細(xì)胞顯著減少。由此推測飲食因素可調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞功能。而相關(guān)研究多僅限于高脂飲食本身因素對腸道干細(xì)胞的影響，目前尚無膽汁酸因素對腸道干細(xì)胞影響的報(bào)道。本研究通過給予大鼠高脂飲食導(dǎo)致末段回腸暴露于高濃度DCA，旨在探討其對腸道干細(xì)胞功能的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只購自上海市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量200～220 g。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自然光照，室溫(22±2) ℃，自由攝取食物和水，每日定時(shí)更換飼料，通風(fēng)良好，排除其他應(yīng)激因素干擾。

二、研究方法

1. 模型制備和動物分組：大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只。對照組給予常規(guī)飲食(11.3% kcal/g脂肪)，高脂飲食組給予高脂飲食(53% kcal/g脂肪)，考來烯胺組給予高脂飲食(53% kcal/g脂肪)+考來烯胺(6%)(Sigma-Aldrich公司)。2周后，大鼠禁食6 h，麻醉，心臟取血，留取末段回腸組織用于形態(tài)學(xué)和基因檢測。

2. 血清膽汁酸濃度測定：留取3組大鼠血清0.2 mL，采用大鼠膽汁酸測定試劑盒(Crystal Chem Inc.)，以ELISA法測定膽汁酸濃度。

3. 大體形態(tài)觀察：取各組大鼠回腸組織，觀察腸管直徑和腸壁形態(tài)。

4. HE染色：取各組大鼠末段回腸組織，固定、脫水透明、包埋，行HE染色，觀察回腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，通過自動成像系統(tǒng)采圖拍照。

5. 在體Lgr5基因表達(dá)的檢測：收集各組大鼠組織，采用Direct-zol抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行qPCR。以GAPDH作為內(nèi)參，使用iQ SYBR Green Supermix儀器檢測Lgr5基因表達(dá)，Lgr5和GAPDH引物均購自Qiagen公司。

6. 離體Lgr5基因表達(dá)的檢測：留取對照組大鼠末段回腸，剪成每段0.5 cm，PBS沖洗，置于含有10 mL DMEM(內(nèi)含100 U/mL青鏈霉素雙抗溶液)的6孔板培養(yǎng)基中，然后分為對照組(無水乙醇)、DCA組(10-4mol/L DCA，購自Sigma-Aldrich公司)和DCA+考來烯胺組(10-4mol/L DCA+10-4mol/L考來烯胺)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用RT-qPCR法檢測Lgr5基因表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清膽汁酸濃度

高脂飲食組血清膽汁酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)；給予考來烯胺后，血清膽汁酸濃度顯著降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠血清膽汁酸濃度

二、回腸大體形態(tài)

高脂飲食組大鼠回腸腸管直徑顯著低于對照組[(3.26±0.17)×10-3m對(4.08±0.14)×10-3m，P<0.05]，腸壁菲薄可透光；給予考來烯胺后，腸管直徑明顯增加[(4.20±0.17)×10-3m對(3.26±0.17)×10-3m，P<0.05](圖2)。

圖2 各組大鼠回腸大體形態(tài)

三、回腸組織學(xué)表現(xiàn)

對照組小腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列整齊，黏膜無水腫、潰瘍、剝脫，未見黏膜上皮細(xì)胞損傷。高脂飲食組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列尚整齊，但絨毛+隱窩長度均較對照組明顯降低[(3.87±0.21)×10-4m對(4.68±0.26)×10-4m，P<0.05]。給予考來烯胺后，大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列整齊，

絨毛+隱窩長度顯著增加[(4.59±0.22)×10-4m對(3.87±0.21)×10-4m，P<0.05]，且與對照組無明顯差異(P>0.05)(圖3、圖4)。

圖4 各組大鼠絨毛+隱窩長度比較情況

四、Lgr5基因表達(dá)

1. 在體研究：高脂飲食組回腸組織中干細(xì)胞Lgr5基因表達(dá)較對照組顯著降低(P<0.01)，給予考來烯胺后，Lgr5基因表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖5A)。

2. 離體研究：與對照組相比，DCA組干細(xì)胞Lgr5基因表達(dá)顯著下降(P<0.01)。給予考來烯胺后，回腸組織Lgr5基因表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖5B)。

圖3 各組大鼠回腸組織學(xué)結(jié)果(HE染色，×200)

A：在體研究；B：離體研究

討 論

腸道上皮屏障功能在維持腸道穩(wěn)態(tài)、阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、病毒和飲食抗原等有害物質(zhì)入侵中發(fā)揮重要作用[8-9]。既往研究提示高脂飲食可導(dǎo)致腸道通透性增加，與腸道低度慢性炎癥以及內(nèi)毒素血癥相關(guān)[3]。對此發(fā)病機(jī)制的研究多關(guān)注高脂飲食因素對腸道黏膜的損害，如破壞緊密連接蛋白、減少杯狀細(xì)胞數(shù)目從而降低黏液層厚度等[1]。有研究報(bào)道短期高脂飲食(2～3周)即可導(dǎo)致小腸增生不良，絨毛長度或黏膜表面積的減低[2]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食可使大鼠小腸管腔直徑變細(xì)，腸壁變薄，絨毛和隱窩長度減低。

目前已知高脂飲食可促進(jìn)膽汁酸分泌異常增高，本研究亦發(fā)現(xiàn)高脂飲食組血清膽汁酸濃度明顯升高。膽汁酸是雙親媒性分子，由肝細(xì)胞中的膽固醇合成。初級膽汁酸分別與?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合，分泌至腸腔，介導(dǎo)飲食脂肪和脂溶性維生素的吸收。結(jié)合膽汁酸因具有高度親水性很少被近段小腸重吸收。當(dāng)傳輸至末段回腸和結(jié)腸，小部分結(jié)合膽汁酸在腸腔內(nèi)定植細(xì)菌作用下，經(jīng)過解偶聯(lián)成為非結(jié)合膽汁酸，再進(jìn)一步脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)疏水性的次級膽汁酸[10]，如DCA和石膽酸。大多數(shù)結(jié)合膽汁酸可由回腸末段黏膜上皮膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動攝取重吸收，經(jīng)循環(huán)至門靜脈系統(tǒng)回流入肝臟，該過程稱為膽汁酸的腸肝循環(huán)[5]。

具有強(qiáng)疏水性的次級膽汁酸和非結(jié)合膽汁酸可攻擊腸黏膜細(xì)胞，因而具有細(xì)胞毒性。Low-Beer等[11]的研究發(fā)現(xiàn)豚鼠體內(nèi)和體外灌注非結(jié)合膽汁酸后小腸黏膜形態(tài)受損?？诜渭壞懼嵋嗫善茐纳掀ぞo密連接結(jié)構(gòu)，增加腸道通透性[12]，具體機(jī)制可能是通過刺激線粒體生成氧自由基造成細(xì)胞DNA損傷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。大鼠的21種循環(huán)膽汁酸組成成分中，DCA是主要的、也是影響末段回腸最重要的膽汁酸之一[14]。多項(xiàng)研究[4,13,15]表明DCA對細(xì)胞的損害可能與肝癌、結(jié)腸癌、Barrett食管相關(guān)。高脂飲食可導(dǎo)致具有細(xì)胞毒性的血清DCA濃度顯著升高[4,14]。Yoshimoto等[4]的研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠DCA濃度較對照組小鼠高2倍。Suzuki等[14]的研究亦證實(shí)，2周高脂飲食大鼠血清DCA濃度較對照組大鼠高4倍。因此高脂飲食不僅是導(dǎo)致末段回腸腸腔暴露于高濃度DCA的有害因素，還可使腸黏膜組織面臨高DCA血癥的危險(xiǎn)。

考來烯胺是膽汁酸的結(jié)合劑，可阻斷末段回腸重吸收膽汁酸，促進(jìn)膽汁酸從腸道排出，臨床用于治療血脂異常和皮膚瘙癢。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)給予大鼠考來烯胺可顯著增加小腸黏膜厚度，并有保護(hù)胃黏膜的作用[16]。考來烯胺還可緩解炎癥導(dǎo)致的腸細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的破壞，降低結(jié)腸細(xì)胞凋亡[17]。本研究證實(shí)考來烯胺可明顯降低2周高脂飲食引起的血清膽汁酸濃度升高，并改善高脂飲食模型大鼠小腸腸管變細(xì)和腸道隱窩+絨毛長度的減低。

腸道上皮每3～5 d更新一次，腸道干細(xì)胞增生分化可變成所有的腸上皮細(xì)胞類型，逐步向絨毛頂端遷移[18]。Lgr5蛋白作為腸上皮干細(xì)胞的一種特異性標(biāo)記物，其表達(dá)提示干細(xì)胞快速分化以及增殖為完整黏膜上皮的功能[6]。Luu[7]的研究結(jié)果提示高脂飲食6周后間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目顯著減少。飲食干預(yù)如熱量限制可增加干細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)腸道再生[19]。Mah等[20]的離體研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠分離出的腸道干細(xì)胞形成的腸道樣組織(enteroids)明顯減少，說明存在干細(xì)胞功能損傷。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食大鼠末段回腸Lgr5基因表達(dá)顯著降低，提示干細(xì)胞分化以及再生為腸道黏膜的功能受損，與腸道大體和腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察相一致，而考來烯胺可明顯升高腸道干細(xì)胞Lgr5基因表達(dá)。后續(xù)研究將采用免疫熒光法檢測回腸隱窩中干細(xì)胞Lgr5表達(dá)，以更直觀地觀察高脂飲食和考來烯胺對干細(xì)胞功能的影響。

為進(jìn)一步證實(shí)在此病理生理過程中膽汁酸發(fā)揮的作用。本研究采用對照組大鼠末段回腸組織，與次級膽汁酸的主要成分DCA(10-4mol/L，類似于體內(nèi)高脂飲食所致膽汁酸濃度)共培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)DCA降低了小腸干細(xì)胞Lgr5基因表達(dá)，而考來烯胺可明顯升高其表達(dá)。既往DCA對消化道細(xì)胞毒性作用機(jī)制的研究結(jié)果顯示DCA可通過誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激[13]、NF-κB途徑[15,21]，造成細(xì)胞DNA損傷，10-4mol/L以上濃度的DCA對DNA損傷顯示了一個(gè)非線性劑量反應(yīng)關(guān)系[17]。

綜上所述，高脂飲食引起的腸道高膽汁酸可下調(diào)干細(xì)胞功能，降低其向腸上皮細(xì)胞的分化能力，破壞腸黏膜及其屏障功能。膽汁酸吸附劑考來烯胺則可改善此病理過程。高脂飲食產(chǎn)生循環(huán)高濃度膽汁酸損害回腸干細(xì)胞功能的具體細(xì)胞、分子層面的機(jī)制以及可能的干預(yù)靶點(diǎn)則是我們今后進(jìn)一步的研究方向。

1 Martinez-Medina M, Denizot J, Dreux N, et al. Western diet induces dysbiosis with increasedEcoliin CEABAC10 mice, alters host barrier function favouring AIEC colonisation[J]. Gut, 2014, 63 (1): 116-124.

2 Thomson AB, Keelan M, Clandinin MT, et al. Dietary fat selectively alters transport properties of rat jejunum[J]. J Clin Invest, 1986, 77 (1): 279-288.

3 Teixeira TF, Collado MC, Ferreira CL, et al. Potential mechanisms for the emerging link between obesity and increased intestinal permeability[J]. Nutr Res, 2012, 32 (9): 637-647.

4 Yoshimoto S, Loo TM, Atarashi K, et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome[J]. Nature, 2013, 499 (7456): 97-101.

5 高春芳, 趙云鵬. 膽紅素與膽汁酸的代謝//陸倫根, 曾民徳主編. 膽汁淤積和自身免疫性肝病. 2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2014: 123-125.

6 Barker N, van Es JH, Kuipers J, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5[J]. Nature, 2007, 449 (7165): 1003-1007.

7 Luu YK. Biomechanical promotion of mesenchymal stem cell proliferation as a countermeasure to the development of obesity and osteoporosis [DB/OL]. State University of New York at Stony Brook, 2008, 162: 3338162. http://pqdtopen.proquest.com/doc/304356170.html?FMT=ABS.

8 Peterson LW, Artis D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis[J]. Nat Rev Immunol, 2014, 14 (3): 141-153.

9 Giuffrida P, Biancheri P, MacDonald TT. Proteases and small intestinal barrier function in health and disease[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2014, 30 (2): 147-153.

10 Wong MH, Oelkers P, Craddock AL, et al. Expression cloning and characterization of the hamster ileal sodium-dependent bile acid transporter[J]. J Biol Chem, 1994, 269 (2): 1340-1347.

11 Low-Beer TS, Schneider RE, Dobbins WO. Morphological changes of the small-intestinal mucosa of guinea pig and hamster following incubationinvitroand perfusioninvivowith unconjugated bile salts[J]. Gut, 1970, 11 (6): 486-492.

12 Bernstein H, Holubec H, Bernstein C, et al. Unique dietary-related mouse model of colitis[J]. Inflamm Bowel Dis, 2006, 12 (4): 278-293.

13 Ajouz H, Mukherji D, Shamseddine A. Secondary bile acids: an underrecognized cause of colon cancer[J]. World J Surg Oncol, 2014, 12: 164.

14 Suzuki Y, Kaneko R, Nomura M, et al. Simple and rapid quantitation of 21 bile acids in rat serum and liver by UPLC-MS-MS: effect of high fat diet on glycine conjugates of rat bile acids[J]. Nagoya J Med Sci, 2013, 75 (1-2): 57-71.

15 Huo X, Juergens S, Zhang X, et al. Deoxycholic acid causes DNA damage while inducing apoptotic resistance through NF-κB activation in benign Barrett’s epithelial cells[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2011, 301 (2): G278-G286.

16 Mersereau WA, Hinchey EJ. Prevention of bile reflux-induced acute gastric ulceration in the rat by cholestyramine[J]. Ann Surg, 1974, 179 (6): 883-888.

17 Lack L, Suliman HB, Rahman AA, et al. Cholestyramine feeding lowers number of colonic apoptotic cells in rat[J]. J Toxicol Environ Health A, 2005, 68 (22): 1963-1975.

18 Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T. Stem cells find their niche[J]. Nature, 2001, 414 (6859): 98-104.

20 Mah AT, Van Landeghem L, Gavin HE, et al. Impact of diet-induced obesity on intestinal stem cells: hyperproliferation but impaired intrinsic function that requires insulin/IGF1[J]. Endocrinology, 2014, 155 (9): 3302-3314.

21 Glinghammar B, Inoue H, Rafter JJ. Deoxycholic acid causes DNA damage in colonic cells with subsequent induction of caspases, COX-2 promoter activity and the transcription factors NF-kB and AP-1[J]. Carcinogenesis, 2002, 23 (5): 839-845.

(2016-03-07收稿；2016-04-18修回)

High Bile Acid-induced by High-fat Diet Impairs Intestinal Mucosa by Down-regulating Stem Cell Function

ZHOUHui,LUOShengzheng,QIANYueqin,LULungen.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(201620)

LU Lungen, Email: lungenlu1965@163.com

Diet, High-Fat; Bile Acid; Deoxycholic Acid; Stem Cells; Cholestyramine Resin

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.10.007

*Email: mdzhouhui@163.com

#本文通信作者，Email: lungenlu1965@163.com

Background: High-fat diet leads to intestinal mucosa barrier dysfunction, but the mechanism is not clear. High-fat diet can induce increase of bile acid. Aims: To investigate whether the high bile acid induced by high-fat diet could act on intestinal stem cell to disrupt stem cell differentiation and imparing the intestinal mucosa. Methods: Twenty-four rats were divided into 3 groups: fed with regular diet, high-fat diet and high-fat diet + cholestyramine, respectively, for 2 weeks. Serum bile acid was detected by ELISA. Ileal diameter was measured and HE staining was performed to observe histology of intestinal mucosa. Expression of Lgr5 gene was determined by RT-qPCR. Ileal tissue fed with regular diet was cultured with deoxycholic acid (DCA) or DCA+cholestyramine for 24 hoursinvitro, expression of Lgr5 gene was determined by RT-qPCR. Results: Compared with control group, serum bile acid was significantly increased (P<0.05), ileal diameter was significantly decreased, height of intestinal crypts and villus was significantly decreased (P<0.05), and expression of Lgr5 gene was significantly decreased in high-fat diet group (P<0.01). All the above-mentioned indices were significantly ameliorated in high-fat diet + cholestyramine group (P<0.05).Invitrostudy showed that expression of Lgr5 gene was significantly decreased in DCA group than in control group (P<0.01), and cholestyramine could significantly increase expression of Lgr5 gene (P<0.05). Conclusions: High-fat diet induced increasing of circulatory bile acid can cause injury of intestinal mucosa by inhibiting stem cell function, which can be ameliorated by cholestyramine.