芹菜籽粕中提取黃酮的新技術(shù)研究

徐國良，李雄輝，胡居吾，涂招秀

（江西省科學院，江西南昌330096）

芹菜籽粕中提取黃酮的新技術(shù)研究

徐國良，李雄輝，胡居吾，涂招秀

（江西省科學院，江西南昌330096）

研究芹菜籽提取油后的芹菜籽粕中的芹菜黃酮物質(zhì)的提取，并對芹菜黃酮物質(zhì)進行改性，采用β-葡萄糖苷酶將糖苷型黃酮生物轉(zhuǎn)化為苷元型黃酮，研究酶解溫度、酶解時間、酶使用量等因素，確定最佳工藝條件，旨在提高芹菜黃酮物質(zhì)的藥效成分。結(jié)果表明，在酶的使用量為0.6，酶水解反應(yīng)時間2h，體系pH為5，反應(yīng)溫度為50℃的水解條件下，可達到理想的水解效果；通過對制備產(chǎn)品進行相關(guān)測定,表明該制備工藝的產(chǎn)品純度為90.24%，產(chǎn)品得率為10.5%。

芹菜籽;黃酮改性;β-葡萄糖苷酶;糖苷型黃酮;苷元型黃酮

芹菜籽中所含黃酮類化合物具有降低血管的脆性，改善血管的通透性，降低血脂和膽固醇，用于防治老年高血壓和腦溢血等作用[1-3]。還具有抗HIV病毒活性[4，5]，改善黃酮的構(gòu)型，提高黃酮類產(chǎn)物生物利用率的作用[6，7]。

1　糖苷型芹菜黃酮的制備

1.1糖苷型芹菜黃酮的提取

去油脂后的芹菜籽粕，取40g樣品粉末，按料液比1∶15加入75%乙醇，85℃回流提取80min，提取2次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏，將該浸膏通過AB-8大孔樹脂對黃酮進行富集純化，取經(jīng)AB-8大孔樹脂富集后的芹菜粗黃酮產(chǎn)品用鹽酸水解，水解產(chǎn)物用乙醚萃取重結(jié)晶得到單體化合物。

1.2糖苷型芹菜黃酮的鑒定

1.2.1鹽酸-鎂粉試驗

取適量分離純化得到的樣品于1mL乙醇溶液中，加少量鎂粉，然后加濃鹽酸四五滴，置沸水浴中加熱2～3min，如出現(xiàn)紅色，表明含有黃酮類化合物。

1.2.2芹菜黃酮紫外光譜測定

分別取約2mg經(jīng)分離純化得到的樣品溶解于10mL的乙醇中，用紫外可見分光光度計在200～700nm波長范圍內(nèi)掃描，得到紫外光譜圖。

1.2.3芹菜黃酮紅外光譜測定

紅外光譜測定采用KBr壓片法。取100mg左右的KBr于瑪瑙缽中研碎，加約1mg經(jīng)分離純化得到的樣品，研勻，壓片，將其在400～4000cm-1范圍內(nèi)掃描，以波長（m）或波數(shù)（cm-1)為橫坐標，百分透過率為縱坐標，得到該物質(zhì)的紅外吸收光譜。

1.2.4芹菜黃酮質(zhì)譜測定

樣品測定時，先將經(jīng)分離純化得到的樣品經(jīng)HPLC分離后進入電離室，以APCI離子源法測定并記錄質(zhì)譜圖。

1.2.5芹菜黃酮核磁共振波譜測定

將經(jīng)分離純化得到的樣品以氘代甲醇或二甲亞砜為測試溶劑，以TMS為內(nèi)標測定。儀器工作頻率1H-NMR為299.9MHz，13C-NMR為75.4MHz。

1.3結(jié)果與分析

化合物為淡黃色針晶(甲醇)，熔點340～342℃，HCl-Mg粉反應(yīng)呈陽性，確定其分子量為270，結(jié)合1H-NMR及13C-NMR譜確定化合物分子式為C15H10O5。圖1、2分別為化合物的紫外光譜圖和紅外光譜圖。

HCl-Mg粉反應(yīng)呈陽性，說明該化合物可能為黃酮類化合物。綜合理化性質(zhì)、UV、IR、1H-NMR、13C-NMR及MS分析，確認該化合物結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖1　芹菜黃酮的紫外光譜圖

圖2　芹菜黃酮的紅外光譜圖

圖3　芹菜黃酮的結(jié)構(gòu)式

2　芹菜黃酮改性試驗

2.1原料

去油后的芹菜籽粕。

2.2主要試劑

β-葡萄糖苷酶，從杏仁中提取，2.5活力單位/mg，購于Sigma公司；蘆?。藴势罚?；乙醚（分析純）、乙醇（分析純）、檸檬酸（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）等。

2.3主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-520J、離心機H2050R、冷凍干燥機DZF-6020、紫外可見分光光度計UV-2100。

2.4試驗方法

2.4.1芹菜籽總黃酮測定方法

以蘆丁為標樣，根據(jù)黃酮類化合物在250～270nm紫外區(qū)有特征吸收，以其吸收的強弱定量測定。試驗測定時最大吸收波長為260nm，工作曲線方程為A=0.0887X-0.0023。式中，A為吸光值，X為濃度，μg/mL；線性相關(guān)系數(shù)為R=0.9998[8，9]。

2.4.2工藝流程

芹菜籽脫油后原料→干燥→緩沖溶液溶解→加酶水解→加乙醚萃取苷元型芹菜黃酮→分離乙醚相→回收乙醚→苷元型芹菜籽黃酮產(chǎn)品。

準確稱取50mg脫脂原料于錐形瓶中，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液攪拌溶解，加β-葡萄糖苷酶溶液，攪拌水解2h后加入等體積的無水乙醚，攪拌并快速冷卻至室溫，將混合液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，震蕩后靜置分層，分離乙醚相，下層水相用無水乙醚再次萃取后，合并乙醚相，回收乙醚后用無水乙醇充分溶解固形物并定容于100mL容量瓶中，紫外法測定苷元型芹菜籽黃酮含量，計算水解提取率。水解提取率計算公式如下：水解提取率/%=乙醚相中苷元型芹菜籽黃酮總量/原料中黃酮總量×100。在不加酶溶液的條件下重復(fù)該試驗作為空白對照。

經(jīng)紫外法測定，脫脂處理后芹菜籽原料中總異黃酮含量為17.3%。

2.4.3酶水解工藝的產(chǎn)品組成分析及純化效果評價

在最佳酶水解條件下，按2.4.2工藝路線提取苷元型芹菜籽黃酮，回收乙醚后冷凍干燥得到產(chǎn)品，分別計算其產(chǎn)品得率和產(chǎn)品純度。其中，產(chǎn)品得率/%=產(chǎn)品質(zhì)量/原料樣品的質(zhì)量×100；產(chǎn)品純度/%=產(chǎn)品中苷元型芹菜籽黃酮總量/產(chǎn)品質(zhì)量×100。

2.5試驗結(jié)果

2.5.1酶用量對水解效果的影響

取50mg脫脂原料用一定體積pH值為5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液溶解后，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0用量的β-葡萄糖苷，在50℃條件下水解2h，剩余操作同2.4.2，測定乙醚相中苷元型芹菜籽總黃酮含量，考察酶用量對酶水解效果的影響。結(jié)果表明（見圖4），隨著酶用量的增加，水解提取率也明顯提高，但在酶用量為0.6處，水解提取率有一個突躍點。超過0.6后，水解提取率隨酶用量的增加趨勢相對緩慢。考慮到酶的價格因素，可選擇0.6的酶用量為宜。

圖4　酶用量對水解提取率的影響

2.5.2反應(yīng)時間對酶水解效果的影響

在其他試驗條件一致的前提下，改變水解反應(yīng)時間，考察反應(yīng)時間對酶水解效果的影響。結(jié)果表明（見圖5），隨著反應(yīng)時間的增加，水解提取率也明顯提高，當反應(yīng)時間小于2h時，反應(yīng)時間與水解率關(guān)系曲線的斜率有較大的變化。反應(yīng)時間超過2h后，水解率隨反應(yīng)時間的增加趨勢相對緩慢?？紤]到實際操作，選擇2h的反應(yīng)時間為宜。

圖5　反應(yīng)時間對水解提取率的影響

2.5.3反應(yīng)溫度對酶水解效果的影響

結(jié)果表明（見圖6），隨著反應(yīng)溫度的增加，水解提取率也相應(yīng)提高，但在反應(yīng)溫度為50℃處，水解提取率最大，超過50℃后，水解率隨反應(yīng)溫度的增加而急劇下降，說明溫度過高或過低都會影響酶的活性，從而引起水解提取率的下降。因此，反應(yīng)的最佳溫度為50℃。

圖6　反應(yīng)溫度對水解提取率的影響

2.5.4pH對酶水解效果的影響

在其他實驗條件一致的前提下，改變水解反應(yīng)體系pH值，考察pH值對酶水解效果的影響。結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，水解提取率在反應(yīng)體系pH值為5時達到最大，pH值過高或過低都會使水解提取率迅速下降，說明β-葡萄糖苷酶的最適pH為5。

圖7　反應(yīng)溫度對水解提取率的影響

3　結(jié)論

本工藝選擇對糖苷類結(jié)構(gòu)具有良好水解能力的β-葡萄糖苷酶作為水解酶，比較系統(tǒng)地研究了其酶水解的最佳工藝條件。結(jié)果表明，在酶的使用量為0.6，酶水解反應(yīng)時間2h，體系pH為5，反應(yīng)溫度為50℃的水解條件下，可達到理想的水解效果。通過對制備產(chǎn)品進行相關(guān)測定,表明該制備工藝的產(chǎn)品純度為90.24%，產(chǎn)品得率為10.5%。

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Study on New Technology of Extracting Flavonoids from Celery Seeds

Xu Guo-liang,Li Xiong-hui,Hu Ju-wu,Tu Zhao-xiu
(Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330096)

This paper studied the extraction of Flavonoids from celery seed oil of celery seed meal,and the celery flavonoids was modified,the β - glucosidase will glycoside flavonoids biological into aglycone type flavonoids to improve the effective components of celery seed flavonoids,and studied the factors of enzymatic hydrolysis temperature,hydrolysis time,enzyme dosage,the optimum process conditions were determined to improve the efficacy of celery flavonoids. The results showed that the enzymatic hydrolysis reaction time was 0.6,the reaction time was two hours,the reaction temperature was pH 5,the reaction temperature was 50 ℃; Through the determination of the preparation of the products,the purity of the product was 90.24% and the yield was 10.5%.

Celery seed; Flavonoids of modified; β - glucosidas; Favone glycoside; Flavone aglycone

TQ914

A

2096-0387（2016）05-0004-04

國家自然科學基金項目（31260400）。

徐國良（1964-），男，副研究員，本科，研究方向：天然產(chǎn)物。