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      影響酪蛋白糖基化的因素分析

      2016-12-02 02:20:53劉貴梅夏秋琴呂麗爽
      食品科學(xué) 2016年21期
      關(guān)鍵詞:糖基化乳糖染料

      劉貴梅,夏秋琴,李 普,呂麗爽

      (南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院,江蘇 南京 210097)

      影響酪蛋白糖基化的因素分析

      劉貴梅,夏秋琴,李 普,呂麗爽*

      (南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院,江蘇 南京 210097)

      目的:通過(guò)建立酪蛋白-乳糖、酪蛋白-丙酮醛、酪蛋白-乙二醛3 種模擬體系,考察影響該體系晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)形成的因素。方法:熒光光譜法(λex/λem=370 nm/440 nm)檢測(cè)還原糖種類、溫度、pH值、金屬離子、時(shí)間和染料木黃酮對(duì)AGEs形成的影響;并分析各個(gè)影響因素的作用效果。結(jié)果:還原糖為核糖、pH 7.4、加工溫度121 ℃和貯藏溫度37 ℃條件下熒光性AGEs的產(chǎn)生量最多,金屬離子Fe2+和Ca2+、9 mmol/L抑制劑染料木黃酮對(duì)熒光性AGEs的形成有抑制作用。結(jié)論:還原糖種類、pH值、溫度、金屬離子和抑制劑染料木黃酮均對(duì)3 種模擬體系中熒光性AGEs的形成有影響,其中,還原糖是影響酪蛋白糖基化生成熒光性AGEs最重要的影響因素,其次為時(shí)間、溫度。

      酪蛋白;熒光光譜;熒光性晚期糖基化終末產(chǎn)物;染料木黃酮

      非酶糖基化反應(yīng),也被稱為非酶褐變和美拉德應(yīng),是發(fā)生于還原糖和蛋白質(zhì)的氨基酸基團(tuán)之間的一類復(fù)雜的反應(yīng),它對(duì)于食品中風(fēng)味物質(zhì)、色澤的形成具有重要作用[1]。還原糖和蛋白質(zhì)發(fā)生的連續(xù)性非酶糖基化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生中間產(chǎn)物——活性二羰基化合物,包括丙酮醛(methylglyoxal,MGO)和乙二醛(glyoxal,GO)等,它們是形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)的前體物質(zhì),具有高反應(yīng)活性,比葡萄糖的活性高200~50 000 倍[2]。蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)會(huì)形成分子內(nèi)或者分子間交聯(lián),最終產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的AGEs[3]。

      AGEs是一類復(fù)雜的化合物,有其獨(dú)特的理化、生化特性,如部分AGEs呈棕色,部分AGEs具有熒光性等;且AGEs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,對(duì)酶穩(wěn)定不易被降解。目前發(fā)現(xiàn)的AGEs的結(jié)構(gòu)類型有:吡咯醛、苯妥西定、羧甲基絲氨酸、咪唑酮以及一些交聯(lián)產(chǎn)物,包括褐色的熒光性交聯(lián)成分(如戊糖素)、無(wú)熒光性的交聯(lián)產(chǎn)物(如丙酮醛-賴氨酸二聚物、乙二醛-賴氨酸二聚物和無(wú)熒光性非交聯(lián)產(chǎn)物(如羧甲基賴氨酸和吡咯素[4-5]。組織病理學(xué)研究表明,AGEs不僅在糖尿病及其并發(fā)癥,如腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、阿爾茨海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用,還會(huì)在一定程度上加快衰老的進(jìn)程[6-8]。酪蛋白(casein,CN)作為牛乳中一種主要蛋白,占牛乳蛋白的80%左右;賴氨酸和精氨酸是CN中含量比較豐富的氨基酸,其總量分別占αS1-CN氨基酸總數(shù)的10.05%;占αS2-CN 13.53%;占β-CN 7.18%;占κ-CN 7.70%[9]。同時(shí)牛乳中主要的糖類為乳糖,大約占固體成分的37%[10]。CN和乳糖的存在和相互作用是牛乳制品發(fā)生糖基化現(xiàn)象的主要原因[11]。目前牛乳殺菌的處理手段主要有巴氏殺菌、超高溫瞬時(shí)殺菌和“延長(zhǎng)保存期奶”等。以上因素加快了牛乳發(fā)生糖基化反應(yīng)的進(jìn)程,從而使其成為潛在的危害人體健康的因素[12]。在熱加工過(guò)程中,牛乳中的乳糖會(huì)與賴氨酸殘基結(jié)合,從而導(dǎo)致賴氨酸利用率減少;而賴氨酸作為一種必需氨基酸,其利用率的減少必將導(dǎo)致食品品質(zhì)的下降[13]。很多研究表明[14-16]乳制品中的蛋白糖基化反應(yīng)導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如賴氨酸)的缺失歸因于蛋白質(zhì)分子中氨基酸的破壞和生物失活、蛋白質(zhì)水解酶、糖酵解的抑制、以及與金屬離子的交互作用等。其中,乳糖降解產(chǎn)生的半乳糖和葡萄糖也會(huì)與賴氨酸反應(yīng)生成一系列AGEs產(chǎn)物;此外,牛乳中糖基化中間產(chǎn)物MGO和GO的產(chǎn)生大大加速了其糖基化反應(yīng)的強(qiáng)度進(jìn)而生成AGEs。有文獻(xiàn)報(bào)道,酸奶中被檢測(cè)出0.02~1.3 mg/kg的MGO和GO[17],奶酪中被檢測(cè)出0~0.007 mg/mL的MGO和0.002~0.227 mg/mL的GO[18]。Fenaille等[19]研究了嬰兒奶粉的產(chǎn)品加工過(guò)程,從中檢測(cè)到MGO和GO以及交聯(lián)蛋白二酪氨酸和賴丙氨酸。有文獻(xiàn)分析德國(guó)41 種嬰兒奶粉在相似的加工條件下,賴氨酸損失了約6 倍,乳果糖基賴氨酸含量增加了2~3 倍,而AGEs的含量也提高了3~5 倍[20]。Hull等[21]調(diào)查了247 種食品,發(fā)現(xiàn)牛乳中每1 000 g蛋白質(zhì)中就含有6.04~16.00 mg AGEs。方便食品行業(yè)的高速發(fā)展、食品精加工程度的大大提高以及食品貯藏期的延長(zhǎng)都在一定程度上導(dǎo)致了消費(fèi)者對(duì)外源性AGEs攝入量的增加。因此,牛乳及其乳制品中的蛋白糖基化已成為食品安全中的隱患。

      本研究以異黃酮染料木黃酮為抑制劑,分別建立了CN-乳糖、CN-MGO、CN-GO 3 個(gè)CN糖基化模型,運(yùn)用熒光分光光度法考察還原糖種類、溫度、pH值、金屬離子、時(shí)間和染料木黃酮等對(duì)CN糖基化的影響。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      干酪素、葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖、乳糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純) 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二甲基亞砜 廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心;染料木黃酮(98%,色譜級(jí)) 南京廣潤(rùn)生物試劑有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      XW-80A微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、HH-S數(shù)顯恒溫油浴鍋金壇市富華儀器有限公司;FA2104N電子分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C數(shù)字式pH計(jì) 上海三信儀表廠;KQ-300B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Infinite 200Pro TECAN多孔酶標(biāo)儀 瑞士帝肯貿(mào)易有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 還原糖或二羰基化合物(MGO/GO)對(duì)CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的影響

      依據(jù)文獻(xiàn)[22]的測(cè)定方法加以改進(jìn)。用濃度為0.2 mmol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液分別溶解CN、還原糖、MGO和GO,配制一定質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液。在10 mL樣品管中加入CN溶液2 mL,分別加入葡萄糖、果糖、核糖、乳糖、半乳糖、MGO、GO溶液各2 mL,再加入磷酸鹽緩沖液至6 mL,使CN、還原糖、MGO和GO的最終質(zhì)量濃度分別為1.000、3.000、0.108 mg/mL和0.087 mg/mL,其中CN溶液為空白組。將反應(yīng)物于100 ℃水浴加熱,在0、5、15、25、40、60、90 min分別取樣800 μL于2 mL樣品管,-80 ℃冷凍保存。解凍后以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取0.3 mL上清液測(cè)λex/λem=370 nm/440 nm波長(zhǎng)處熒光值(AGEs熒光值的大小在一定程度上可以反映糖基化產(chǎn)物AGEs含量的多少)。所有實(shí)驗(yàn)均做3 組平行,結(jié)果取平均值。

      1.3.2 pH值對(duì)CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的影響

      依據(jù)文獻(xiàn)[22]的測(cè)定方法加以改進(jìn)。用濃度為0.2 mmol/L、pH 6.0 (或pH 6.8、7.0、7.4)的磷酸鹽緩沖液分別溶解CN、乳糖、MGO和GO,配制一定質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液。在10 mL樣品管中加入CN 2 mL,分別加入乳糖、MGO和GO溶液各2 mL,再加入磷酸鹽緩沖液至6 mL,使CN、乳糖、MGO和GO的最終質(zhì)量濃度分別為1.000、3.000、0.108 mg/mL和0.087mg/mL。將反應(yīng)物于100 ℃水浴加熱,在0、5、15、25、40、60、90 min分別取樣800 μL于2 mL樣品管,-80 ℃冷凍保存。其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.1節(jié)。

      1.3.3 溫度對(duì)CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的影響

      1.3.3.1 加工溫度對(duì)CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的影響

      依據(jù)文獻(xiàn)[22]的測(cè)定方法加以改進(jìn)。用濃度為0.2 mmol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液分別溶解CN、乳糖、MGO和GO,配制一定質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液。在10 mL樣品管中加入CN 2 mL,分別加入乳糖、MGO和GO溶液各2 mL,再加入磷酸鹽緩沖液至6 mL,使CN、乳糖、MGO和GO的最終質(zhì)量濃度分別為1.000、3.000、0.108 mg/mL和0.087 mg/mL。將反應(yīng)物于65、75、85、95、100、121 ℃分別加熱,在0、5、15、25、40、60、90 min分別取樣800 μL于2 mL樣品管,-80 ℃冷凍保存。其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.1節(jié)。

      1.3.3.2 貯藏溫度對(duì)CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的影響

      依據(jù)文獻(xiàn)[22]的測(cè)定方法加以改進(jìn)。用濃度為0.2 mmol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液分別溶解CN、乳糖、MGO和GO,配制一定質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液。在20 mL樣品管中加入CN 4 mL,分別加入乳糖、MGO和GO溶液各4 mL,再加入磷酸鹽緩沖液至12 mL,使CN、乳糖、MGO和GO的最終質(zhì)量濃度分別為1.000、3.000、0.108 mg/mL和0.087 mg/mL。將反應(yīng)物于37 ℃或25 ℃培養(yǎng)箱反應(yīng),在0、1、2、4、8、12、24、48、72、120、168、336、504、720 h(30 d)分別取樣800 μL于2 mL樣品管,-80 ℃冷凍保存。其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.1節(jié)。

      1.3.4 不同金屬離子對(duì)CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的影響

      依據(jù)文獻(xiàn)[22]的測(cè)定方法加以改進(jìn)。用濃度為0.05 mmol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液分別溶解金屬氯化物FeCl2、MgCl2、ZnCl2和CaCl2,使其最終濃度為0.2 mmol/L,并以此溶解CN、乳糖、MGO和GO,配制一定質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液。在10 mL樣品管中加入CN 2 mL,分別加入乳糖、MGO和GO溶液各2 mL,再加入磷酸鹽緩沖液至6 mL,使CN、乳糖、MGO和GO的最終質(zhì)量濃度分別為1.000、3.000、0.108 mg/mL和0.087 mg/mL。將反應(yīng)物于100 ℃加熱90 min分別取樣800 μL于2 mL樣品管,-80 ℃冷凍保存。其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.1節(jié)。

      1.3.5 高溫加工條件下染料木黃酮抑制CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的作用

      依據(jù)文獻(xiàn)[22]的測(cè)定方法加以改進(jìn)。用濃度為0.2 mmol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液溶解CN、乳糖、MGO和GO。在10 mL樣品管中加入最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的CN溶液2 mL,最終質(zhì)量濃度分別為3 mg/mL的乳糖、0.108 mg/mL的MGO和0.087 mg/mL的GO溶液各2 mL,再加入用DMSO溶解的染料木黃酮2 mL,使染料木黃酮的最終濃度分別為1.5、3.0、6.0、9.0 mmol/L。100 ℃水浴加熱,在0、5、15、25、40、60、90 min分別取樣800 μL于2 mL樣品管,-80 ℃冷凍保存。其他實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.1節(jié)。

      1.3.6 低溫貯藏條件下染料木黃酮抑制CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的作用

      依據(jù)文獻(xiàn)[22]的測(cè)定方法。用濃度為0.2 mmol/L, pH 6.8的磷酸鹽緩沖液溶解CN、乳糖、MGO和GO。在20 mL樣品管中加入最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的CN溶液4 mL,分別加入最終質(zhì)量濃度為3 mg/mL的乳糖、0.108 mg/mL的MGO和0.087 mg/mL的GO溶液各4 mL,再加入用DMSO溶解的染料木黃酮4 mL,使其濃度分別為1.5、3.0、6.0、9.0 mmol/L。25 ℃或37 ℃培養(yǎng)箱加熱,在0、1、2、4、8、12、24、48、72、120、168、336、504、720 h(30 d)分別取樣800 μL 于2 mL樣品管,-80 ℃冷凍保存。其他實(shí)驗(yàn)步驟與同1.3.1節(jié)。熒光性AGEs抑制率按下式進(jìn)行計(jì)算。

      式中:F0為初始熒光值;F為實(shí)驗(yàn)熒光值。

      1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

      Excel 2013軟件用于分析實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的熒光性AGEs;采用Minitab16軟件分析可得在各個(gè)條件下影響CN糖基化的因素(還原糖、時(shí)間、金屬離子、溫度、染料木黃酮、pH值)所占比例,其中每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均做3 組平行,測(cè)定結(jié)果以表示。采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 還原糖或二羰基化合物(MGO和GO)對(duì)CN糖基化的影響

      圖1 還原糖或MGO/GO對(duì)CN糖基化的影響Fig. 1 Effect of different reducing sugars and MGO/GO on casein glycation

      由圖1可知,不同的底物對(duì)CN糖基化的影響結(jié)果差距非常大(P<0.05)??瞻捉M產(chǎn)生的熒光性AGEs最低,MGO與CN反應(yīng)產(chǎn)生的熒光性AGEs遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出其他反應(yīng)底物,反應(yīng)最為強(qiáng)烈;其次為GO,與核糖接近。其他還原糖的反應(yīng)活性依次為乳糖、果糖、半乳糖、葡萄糖。有文獻(xiàn)報(bào)道,核糖與CN的反應(yīng)速率大于其他葡萄糖和果糖,即五碳糖比六碳糖更能引起CN的糖基化[23],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。其中乳糖為二糖,其活性高于單糖,其作用機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

      2.2 pH值對(duì)CN糖基化的影響

      pH 7.4為生理?xiàng)l件的pH值,產(chǎn)生熒光性AGEs量較高;pH 6.0為酸奶的pH值,產(chǎn)生的熒光性AGEs量較低。pH 6.8為一般牛乳的pH值,產(chǎn)生熒光性AGEs的pH值介于6.0~7.4之間。文獻(xiàn)報(bào)道在偏酸性環(huán)境中,N-葡萄糖胺容易被水解,因此不利于反應(yīng)的進(jìn)行;而堿性條件pH 9.2的熒光性AGEs則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增強(qiáng)[24]。由圖2可知,比較3 個(gè)反應(yīng)體系CN-乳糖、CN-MGO和CN-GO,CN-乳糖和CN-GO模型的反應(yīng)活性接近;乳糖誘導(dǎo)CN產(chǎn)生熒光性AGEs隨時(shí)間變化較為緩慢;而GO則快速誘導(dǎo)CN產(chǎn)生熒光性AGEs,而后穩(wěn)定在一定的值;MGO反應(yīng)活性最高,更為強(qiáng)烈迅速地誘導(dǎo)CN反應(yīng),由此產(chǎn)生的熒光性AGEs量幾乎為前兩者的3 倍。

      圖2 pH值對(duì)CN糖基化的影響Fig. 2 Effect of pH on casein glycation

      2.3 溫度對(duì)CN糖基化的影響結(jié)果

      2.3.1 加工溫度對(duì)CN糖基化的影響

      圖3 加工溫度對(duì)CN糖基化的影響Fig. 3 Effect of processing temperature on casein glycation

      如圖3所示,3 個(gè)模型中,空白組的熒光性AGEs隨著時(shí)間的延長(zhǎng)沒(méi)有明顯的變化,而隨著溫度(65~121 ℃)的升高,體系中產(chǎn)生的熒光性AGEs均逐步提高。其中溫度對(duì)MGO引發(fā)的CN糖基化的影響最大,產(chǎn)生的熒光性AGEs最多,約為其他2 個(gè)模型產(chǎn)生最高量的3 倍;其次為CN-GO模型;3 個(gè)模型中,CN-乳糖模型產(chǎn)生的熒光性AGEs的含量相對(duì)較低。其中乳糖糖基化體系溫度對(duì)AGEs產(chǎn)生量的影響可以分割為3 個(gè)區(qū),65~75、85~100、121 ℃。

      2.3.2 貯藏溫度對(duì)CN糖基化的影響

      低溫貯藏(25、37 ℃)30 d對(duì)CN糖基化的影響結(jié)果如圖4所示,在貯藏溫度范圍內(nèi),空白組的AGEs含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì),但是增加的趨勢(shì)不明顯;隨著溫度的升高,CN糖基化趨勢(shì)依次加強(qiáng)。而在3 個(gè)CN模型中,盡管MGO/GO的作用強(qiáng)度顯著高于乳糖模型,但低溫范圍內(nèi)MGO和GO引發(fā)CN低溫糖基化的活性較高溫條件下大幅減弱。這與Bosch等[25]分析了牛乳-谷物中嬰兒食品,在貯藏溫度分別為25、37 ℃條件下貯藏9 個(gè)月,發(fā)現(xiàn)AGEs的含量隨著溫度的升高而上升的結(jié)果一致。

      圖4 貯藏溫度對(duì)CN糖基化的影響Fig. 4 Effect of storage temperature on casein glycation

      2.4 金屬離子對(duì)CN糖基化的影響

      圖5 金屬離子對(duì)CN糖基化的影響Fig. 5 Effect of metal ions on casein glycation

      如圖5所示,不同金屬離子對(duì)CN糖基化影響有顯著差異(P<0.05),但金屬離子對(duì)3 個(gè)CN糖基化模型均顯示抑制性作用,這與氨基酸模型存在差異。在空白對(duì)照組中,CN-MGO組產(chǎn)生的熒光性AGEs的含量最高,其次是CN-GO組,產(chǎn)生最少的是CN-乳糖;在CN-MGO模型,特別是Fe2+,抑制效果最為明顯;在CN-乳糖模型中,Ca2+抑制作用最強(qiáng);在CN-GO模型中,也是Fe2+的抑制作用最明顯。Ramonaityt?等[26]研究Maillard反應(yīng)中Cu2+、Zn2+和Fe2+對(duì)乳糖-甘氨酸模擬的影響,發(fā)現(xiàn)Fe2+(20~100 mg/L)可以促進(jìn)Maillard反應(yīng)中顏色物質(zhì)的生成,而Cu2+(1 mg/L)和Zn2+(5 mg/L)只有在質(zhì)量濃度較低的情況下有作用,在較高質(zhì)量濃度下則會(huì)抑制顏色物質(zhì)的生成。

      2.5 高溫加工條件下染料木黃酮對(duì)產(chǎn)生熒光性AGEs的影響

      由圖6可知,在3 個(gè)CN模擬體系中,在100 ℃,染料木黃酮濃度與其抑制效果呈現(xiàn)量效關(guān)系。3 個(gè)模型中的空白組熒光性AGEs含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì),在90 min達(dá)到最大值。隨著染料木黃酮添濃度的增加,對(duì)熒光性AGEs產(chǎn)生的抑制作用也隨之增強(qiáng)。以反應(yīng)最強(qiáng)烈的CN-MGO體系為例,在反應(yīng)達(dá)到90 min時(shí),染料木黃酮濃度為1.5、3.0、6.0、9.0 mmol/L時(shí),熒光性AGEs抑制率分別為64.5%、72.6%、81.6%和89.4%。由此可見(jiàn),染料木黃酮可以有效抑制CN糖基化。Jung等[27]通過(guò)熒光檢測(cè)的方法尋找AGEs受體的阻斷劑,在檢測(cè)了50 個(gè)樣品之后,發(fā)現(xiàn)染料木黃酮可以阻止晚期糖基化終產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體的交聯(lián),并且隨著染料木黃酮?jiǎng)┝康脑黾?,其阻斷程度也呈線性增加。

      圖6 高溫加工條件下染料木黃酮對(duì)CN糖基化的抑制作用Fig. 6 Inhibitory effect of genistein on the production of fluorescent AGEs from casein glycation

      2.6 低溫貯藏條件下,染料木黃酮抑制CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的結(jié)果

      染料木黃酮抑制CN在貯藏溫度25 ℃條件下出現(xiàn)的糖基化的結(jié)果如圖7所示,圖中發(fā)現(xiàn)3個(gè)模型中的空白組在貯藏過(guò)程中熒光性AGEs的含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì),其中CN-MGO和CN-GO模型中,熒光性AGEs的含量在貯藏時(shí)間為432 h時(shí)達(dá)到最大值,在432~720 h時(shí)間內(nèi)略有輕微下降的趨勢(shì),染料木黃酮在貯藏條件下亦能有效抑制CN糖基化。以CN-乳糖體系為例,在反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為720 h時(shí),染料木黃酮的濃度分別為1.5、3.0、6.0、9.0 mmol/L時(shí),木黃酮抑制CN-乳糖模型體系產(chǎn)生熒光性AGEs的抑制率分別為(36.8±0.23)%、(42.6±0.45)%、(54.5±0.15)%和(63.8±0.2)%。由此可見(jiàn),染料木黃酮可以在食品貯藏過(guò)程中有效抑制CN糖基化。

      圖7 低溫貯藏條件下染料木黃酮抑制CN糖基化的結(jié)果Fig. 7 Inhibitory effect of genistein on the production of fluorescent AGEs from casein glycation

      2.7 影響CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的因素及其交互作用分析

      如表1所示,還原糖種類(包括MGO和GO)是影響CN糖基化生成熒光性AGEs最重要的影響因素,其次為時(shí)間、溫度等,此外交互作用中葡萄糖×?xí)r間和溫度×?xí)r間、溫度、pH值、抑制劑染料木黃酮和金屬離子對(duì)CN體系糖基化的作用不顯著。

      表1 影響CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的因素及其交互作用分析Table 1 Contributions of individual factors and interactions on the production of AGEs

      還原糖種類對(duì)CN糖基化的作用效果最明顯,原因是不同的還原糖對(duì)CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的效果不盡相同,特別是活性二羰基化合物MGO和GO,它們誘導(dǎo)CN糖基化的作用效果很強(qiáng)。反應(yīng)時(shí)間是影響CN糖基化產(chǎn)生熒光性AGEs的第二主要因素,糖基化反應(yīng)尤其是CN-乳糖模型體系,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈持續(xù)增強(qiáng)的效應(yīng)。其次,溫度對(duì)CN的糖基化作用效果亦不可忽視,溫度越高,產(chǎn)生的熒光性AGEs也越多。此外,抑制劑染料木黃酮對(duì)CN糖基化具有顯著的抑制功效,盡管在整個(gè)糖基化反應(yīng)過(guò)程中,它并不是決定性因素,但依舊可以通過(guò)調(diào)整加工條件、外加抑制劑共同降低AGEs的含量。

      3 結(jié) 論

      在CN-乳糖、CN-MGO和CN-GO 3個(gè)模擬體系中,還原糖種類、溫度、pH值、金屬離子對(duì)熒光性AGEs的產(chǎn)生有重要的作用,其中,當(dāng)反應(yīng)溫度(121 ℃)一定時(shí),反應(yīng)時(shí)間(0、15、30、45、60、75、90 min)越長(zhǎng),產(chǎn)生的熒光性AGEs的強(qiáng)度就越高,pH值接近7.4時(shí)產(chǎn)生的熒光性AGEs較多;在3 種不同的體系條件下,熒光性AGEs的產(chǎn)量不同。在加工和貯藏兩種不同的條件下,3 種體系中產(chǎn)生的熒光性AGEs的量也不盡相同,此外,抑制劑染料木黃酮對(duì)熒光性AGEs的形成有抑制作用。

      在還原糖種類、溫度、pH值、金屬離子以及抑制劑染料木黃酮等影響因素和交互作用中,還原糖是影響CN糖基化生成熒光性AGEs最重要的影響因素,其次為反應(yīng)時(shí)間、溫度等。其他作用因素,如還原糖×?xí)r間、溫度×?xí)r間、溫度、pH值、抑制劑染料木黃酮和金屬離子對(duì)CN體系糖基化的作用不顯著。

      本課題以CN糖基化為導(dǎo)向?yàn)槭称饭I(yè)加工過(guò)程中染料木黃酮抑制CN糖基化提供一定的理論依據(jù),并為改善食品安全降低食品中AGEs的產(chǎn)生提供新的思路。但是對(duì)CN糖基化過(guò)程中MGO、GO生成動(dòng)力學(xué)以及染料木黃酮介入后的動(dòng)力學(xué)變化過(guò)程需要進(jìn)行更加深入研究。因此,在食品的加工、貯藏和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中可通過(guò)選擇性縮短加工食品的時(shí)間、降低加工溫度、降低食品pH值,適當(dāng)調(diào)控還原糖的濃度和添加天然黃酮類化合物來(lái)控制糖基化過(guò)程中有害中間產(chǎn)物MGO/GO和終末產(chǎn)物熒光性AGEs的產(chǎn)生。

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      Analysis of the Factors Affecting Casein Glycosylation

      LIU Guimei, XIA Qiuqin, LI Pu, Lü Lishuang*
      (Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

      Objective: To investigate the factors influencing the formation of fluorescent advanced glycation end products (AGEs) in casein-lactose, casein-MGO and casein-GO model systems. Methods: The influencing factors including reducing sugar type, temperature, pH, metal ion, time and genistein concentration were detected by fluorescence spectrometry, (λex/λem= 370 nm/440 nm). Results: The strongest fluorescent intensity of AGEs was obtained under the conditions: ribose as reducing sugar, pH 7.4, storage temperature of 121 ℃ and processing temperature of 37 ℃, whereas the presence of Fe2+and Ca2+and 9 mmol/L genistein could effectively inhibit the formation of fluorescent AGEs. Conclusion: Reducing sugar type, pH, and temperature have a significant effect on the formation of fluorescent AGEs, and metal ion and genistein could inhibit the fluorescent AGEs. Among these, reducing sugar has the greatest influence on the formation of fluorescent AGEs, followed by time and temperature.

      casein; fluorescence spectrometry; advanced glycation end products (AGEs); genistein

      10.7506/spkx1002-6630-201621003

      TS201.2

      A

      1002-6630(2016)21-0014-07

      劉貴梅, 夏秋琴, 李普, 等. 影響酪蛋白糖基化的因素分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 14-20. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621003. http://www.spkx.net.cn

      LIU Guimei, XIA Qiuqin, LI Pu, et al. Analysis of the factors affecting casein glycosylation[J]. Food Science, 2016, 37(21): 14-20. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621003. http://www.spkx.net.cn

      2015-10-25

      國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31571783);江蘇省2015年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYLX15_0761)

      劉貴梅(1989—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail:sunshine6324@126.com

      *通信作者:呂麗爽(1969—),女,教授,博士,研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)、功能性食品的分離及活性。E-mail:lishuanglv@126.com

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