趙 芹，林 棟，劉海梅

（1.魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025；2.濱州醫(yī)學院藥學院，山東 煙臺 264003）

海參皂苷Echinoside A通過uPA信號通路抑制高轉移95D細胞轉移

趙 芹1，林 棟2，劉海梅1

（1.魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025；2.濱州醫(yī)學院藥學院，山東 煙臺 264003）

研究海參皂苷Echinoside A對高轉移人肺巨細胞癌95D細胞增殖和轉移的影響及其分子機制。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法檢測Echinoside A對95D細胞生長的影響；采用Transwell實驗、黏附實驗評價Echinoside A抗95D細胞轉移活性；采用雞胚尿囊膜（chicken chorioallantoic membrane，CAM）實驗評價Echinoside A抗血管新生活性；采用逆轉錄-聚合酶鏈反應和蛋白質印跡法檢測95D細胞轉移相關基因和蛋白的表達。結果表明，Echinoside A能顯著降低95D細胞增殖（P＜0.01）、侵襲（P＜0.01）、遷移（P＜0.01）以及黏附能力（P＜0.01）；還能顯著抑制CAM上的血管新生。Echinoside A能顯著降低尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase plasminogen activator，uPA）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2、MMP-9 mRNA的表達，顯著上調金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP）-1、TIMP-2 mRNA的表達，同時在基因和蛋白水平顯著下調血管內皮生長因子的表達。提示Echinoside A可通過調控uPA信號通路，保護細胞外基質結構，從而抑制95D細胞轉移。

海參皂苷；95D細胞；腫瘤；轉移；血管新生；信號通路

腫瘤的侵襲和轉移是惡性腫瘤最主要的生物學特征，是導致腫瘤復發(fā)以及患者臨床死亡的主要原因。腫瘤轉移過程主要包括細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和基底膜（basement membrane，BM）的降解，局部浸潤的產生，腫瘤細胞與血管內皮細胞的黏附，通過血管和淋巴管轉移到遠端器官，然后形成新的轉移灶。當腫瘤惡性增殖超過2 mm3之后，其生長則依賴于腫瘤組織中的血管新生[1]。新生血管的形成能向腫瘤組織及時輸送營養(yǎng)及排出廢物，加速其自身的分裂與增殖，同時也為腫瘤細胞向周圍組織進一步轉移提供了通路[2]。目前，針對腫瘤轉移過程中抗癌細胞遷移、黏附、抗ECM和BM降解和抗腫瘤血管生成等仍是抑制腫瘤轉移研究的關鍵內容。

海參皂苷是海參特有的一類三萜皂苷，也是海參中重要的生物活性成分之一。大量研究發(fā)現(xiàn)，其具有抑菌[3]、調節(jié)膽固醇代謝[4]、降血壓[5]、改善高尿酸血癥[6]和促進造血[7]等生理活性，其顯著的抗腫瘤活性更是引起廣泛的關注[8-9]。革皮氏海參（Pearsonothuria graeffei）食用價值低，但是皂苷含量高達3.514%。Echinoside A是革皮氏海參皂苷的主要成分，約占總量的65%左右，已被證實具有顯著的體內體外抑制腫瘤生長的活性[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)革皮氏海參皂苷ds-Echinoside A具有顯著的抗腫瘤轉移活性，可通過抑制核轉錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路，下調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-9和血管內皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）的表達，從而抑制肝癌細胞HepG2轉移[11]，但目前對Echinoside A抗腫瘤轉移的活性及作用機理尚缺乏系統(tǒng)的研究。本實驗選用高轉移細胞株95D為研究對象，深入研究Echinoside A對95D細胞遷移、黏附、侵襲和血管新生各環(huán)節(jié)的影響和作用機理，為挖掘海參皂苷的藥理功效，提高低值海參的附加值提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參皂苷單體Echinoside A，以革皮氏海參為原料，采用高速逆流色譜法獲得，純度為95.5%，其分子式為C54H87O26SNa，相對分子質量為1 206，化學結構式見圖1。

人肺巨細胞癌95D、人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC） 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal calf serum ，F(xiàn)BS）、新生牛血清 美國Gibco公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Amresco公司；Matrigel基質膠 美國BD公司；Trizol試劑美國Invitrogen公司；DNA Marker DL2000、Taq DNA聚合酶 大連TaKaRa生物工程有限公司；M-MLV反轉錄酶 美國Promega公司；引物和隨機引物 上海生工生物技術有限公司；GAPDH多克隆抗體、VEGF抗體、二抗 美國Santa Cruz公司；其他試劑均為國產分析純。

圖1 Echinoside A的化學結構Fig. 1 Chemical structure of Echinoside A

1.2 儀器與設備

Transwell小室 美國Corning公司；CKX41型倒置顯微鏡 日本Olympus公司；BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱德國Heraeus公司；680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；TC-96 Life Pro基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；JS-780全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；DYCP-40C型轉膜電泳儀、WD-9405A型脫色搖床北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

95D細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中；HUVEC細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基中，其中均含2%青/鏈霉素。2 種細胞均置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長成單層融合狀態(tài)后，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.2 MTT法檢測Echinoside A對95D細胞增殖活性的影響

95D細胞以6×104個/mL的濃度接種于96 孔板內，每孔100 μL。24 h后吸棄培養(yǎng)基，分別加入200 μL含不同濃度Echinoside A（0.00、0.42、0.83、1.24、1.66 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，每組4 個復孔，分別培養(yǎng)6、12、24 h。采用MTT法測定OD570nm值，擬合曲線求出半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.3 Transwell小室法檢測Echinoside A對95D細胞侵襲和遷移的影響

95D細胞以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞密度至5×105個/mL。侵襲實驗加入經500 μg/mL Matrigel包被Transwell小室上室中，模擬基底膜；遷移實驗加入未經包被的Transwell小室上室中，每孔100 μL。各組分別加入150 μL含不同濃度Echinoside A無血清培養(yǎng)基，使Echinoside A終濃度分別為0.00、0.20、0.40 μmol/L。下室加入750 μL含20% FBS的完全培養(yǎng)基，于37 ℃孵育24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上層膜面上的細胞，穿過基底膜的細胞黏附于膜下層，用2.5%戊二醛固定30 min后，以0.1%結晶紫染色15 min。每孔隨機取5 個視野，計數(shù)視野的細胞數(shù)，求平均值，按公式（1）計算侵襲率或遷移率。

1.3.4 黏附實驗檢測Echinoside A對95D細胞黏附能力的影響

1.3.4.1 同基質間黏附的影響

95D細胞以1.5×104個/mL的濃度接種于24 孔板，每孔1 mL，貼壁24 h。吸棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度Echinoside A（0.00、0.20、0.40 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h和24 h后收集細胞。以無血清培養(yǎng)基調整細胞密度為2×105個/mL，加入經50 μg/mL Matrigel包被的96 孔板中，每孔100 μL，每組4 個復孔。置于培養(yǎng)箱孵育90 min后，用PBS緩沖液洗去未黏著的細胞。采用MTT法測定光密度值OD570nm，按公式（2）計算腫瘤細胞與基質間黏附率。

1.3.4.2 同HUVEC細胞間黏附的影響

HUVEC細胞以2×105個/mL接種于96 孔板中，每孔100 μL，貼壁24 h。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2 次后加入2×105個/mL的95D細胞，每孔100 μL。95D細胞預先經不同濃度Echinoside A（0.00、0.20、0.40 μmol/L）預處理12、24 h。置于培養(yǎng)箱孵育90 min后，用磷酸鹽緩沖液洗去未黏著的細胞。采用MTT法測定OD570nm值，按公式（2）計算黏附率。

1.3.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測Echinoside A對95D細胞轉移相關基因表達的影響

95D細胞轉移相關基因：編碼MMP-2、MMP-9、金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP）-1、TIMP-2、尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase plasminogen activato，uPA）和VEGF的基因的表達采用RT-PCR法檢測。95D細胞以每孔5×105個/孔接種于6 孔板中，每孔2 mL，貼壁24 h。吸棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度Echinoside A（0.00、0.20、0.40 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞，加入Trizol提取總RNA，進行PCR反應，檢測各組細胞轉移相關基因的表達。引物序列、退火溫度、循環(huán)數(shù)和產物大小見表1。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以目的基因與β-actin擴增條帶的灰度比值代表基因相對表達水平。

表1 引物序列、退火溫度、循環(huán)數(shù)和產物長度Table 1 Primer sequences, annealing temperatures, cycles and length of products

1.3.6 雞胚尿囊膜（chicken chorioallantoic membrane，CAM）法檢測Echinoside A對血管生成的影響

參照文獻[12]方法，挑選新鮮種蛋，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵化。于第9天在無菌條件下暴露出CAM。取直徑1 cm的圓濾紙片置于CAM上，然后加入20 μL不同濃度的Echinoside A（0.00、11.32、22.64 μmol/L）。繼續(xù)孵育24 h后，以2.5%戊二醛固定尿囊膜，剪下加樣區(qū)尿囊膜，于解剖鏡下觀察并拍照。

1.3.7 蛋白質印跡法檢測Echinoside A對95D細胞VEGF蛋白表達的影響

細胞處理方法同1.3.5節(jié)，收集細胞，參照文獻[10]制備蛋白、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，用脫脂奶粉封閉。分別加入兔抗人GAPDH多克隆抗體（體積比1∶1 000稀釋）和VEGF（1∶200稀釋），于4 ℃孵育過夜。以TBST洗滌3 次后加入山羊抗兔二抗（體積比1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h。采用化學發(fā)光試劑顯影曝光后采集圖像，測定條帶的灰度值，以VEGF與GADPH灰度比值代表VEGF蛋白的相對表達量。實驗重復3 次。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，同時進行最小顯著性差異分析和Student-Newman-Keuls組間比較，以P＜0.05為差異顯著。實驗結果用±s表示。

2 結果與分析

2.1 Echinoside A對95D細胞增殖活性的影響

圖2 Echinoside A對95D細胞增殖活性的影響Fig. 2 Effect of Echinoside A on the proliferation activity of 95D cells

由圖2可知，Echinoside A作用于95D細胞以后，顯著抑制了細胞的增殖，且呈現(xiàn)顯著的時間-效應和劑量-效應關系。其中在12 h和24 h，Echinoside A對95D細胞的IC50值分別為1.29 μmol/L和1.05 μmol/L。尹一恒[13]研究了棕環(huán)海參（Holothuria fuscocinerea Jaeger）皂苷fuscocineroside A對人源性膠質母細胞瘤細胞U251增殖活性的影響。結果顯示，fuscocineroside A作用U251細胞48 h的IC50值為7.80 μmol/L。張佳佳等[14]研究了黃疣海參皂苷的體外抗腫瘤活性，結果發(fā)現(xiàn)，hillaside A和hillaside B兩種皂苷單體對受試的10 株腫瘤細胞均顯示很強的細胞毒活性，IC50值為0.15～3.20 mg/L。由此可見，Echinoside A對腫瘤細胞的IC50值均遠小于其他海參皂苷，其抑制腫瘤增殖的活性效果顯著。

2.2 Echinoside A對95D細胞侵襲能力的影響

圖3 Echinoside A對95D細胞侵襲率的影響Fig. 3 Effect of Echinoside A on the invasion rate of 95D cells

圖4 Echinoside A對95D細胞侵襲率的量化圖Fig. 4 Quantitative analysis of the invasion rate of Echinoside A on 95D cells

Matrigel可在Transwell小室膜上重組，形成與天然ECM類似的結構[15]。腫瘤細胞對ECM的降解為其突破BM并進一步遷移和浸潤基質的創(chuàng)造了必要條件。本實驗以細胞穿過重組ECM的數(shù)目表示其惡性侵襲能力，結果見圖3。經20%胎牛血清誘導，95D細胞可顯著降解Matrigel，大量細胞穿過重組基底膜，24 h后Transwell小室底部幾乎被細胞鋪滿。經Echinoside A處理后，穿越重組基底膜到達Transwell小室底部的細胞數(shù)目顯著減少，經量化分析后（圖4），低、高劑量組95D細胞侵襲率分別下降了53.5%和65.8%（P＜0.01），表明Echinoside A可顯著降低95D細胞的侵襲能力。

2.3 Echinoside A對95D細胞遷移能力的影響

圖5 Echinoside A對95D細胞遷移率的影響Fig. 5 Effect of Echinoside A on the migration rate of 95D cells

圖6 Echinoside A對95D細胞遷移率的量化圖Fig. 6 Quantitative analysis of the migration rate of Echinoside A on 95D cells

遷移運動是惡性腫瘤最基本的生物學特征，且與腫瘤的轉移潛能呈正相關。由圖5可知，經Echinoside A作用后，95D細胞的穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)目顯著減少，即樣品組95D細胞遷移能力顯著降低。同對照組相比，Echinoside A低、高劑量組遷移率分別降低了30.3%和49.3%（P＜0.01），呈現(xiàn)顯著的劑量依賴效應（圖6），表明Echinoside A可顯著降低腫瘤細胞的遷移能力。

2.4 Echinoside A對95D細胞黏附能力的影響

圖7 Echinoside A對95D細胞同Matrigel（a）和HUVEC（b）黏附率的影響Fig. 7 Effect of Echinoside A on the adhesion rate of 95D cells

腫瘤細胞的黏附作用既包括與基質間黏附，也包括與血管內皮細胞之間的黏附，在腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落，與血管和淋巴管基底膜黏附，侵襲到遠處器官中都起著極為重要的作用。首先檢測了Echinoside A對95D細胞同基質的黏附能力。由圖7a可知，經Echinoside A處理后，各劑量組細胞同基質的黏附率均顯著降低，且呈現(xiàn)明顯的時間-效應和劑量-效應關系。其中，作用24 h后，Echinoside A低、高劑量組95D細胞同基質的黏附率分別下降了36.23%和44.26%（P＜0.01）。同時檢測Echinoside A對95D細胞和血管內皮細胞間的黏附能力發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Echinoside A也顯著抑制了95D細胞同HUVEC細胞間的黏附率，且呈現(xiàn)顯著的時間-效應和劑量-效應關系（圖7b）。其中，作用24 h后，Echinoside A低、高劑量組95D細胞同HUVEC的黏附率分別下降了15.18%和23.58%（P＜0.01）。綜上可見，Echinoside A可同時抑制高轉移腫瘤細胞同基質和血管內皮細胞的黏附。

2.5 Echinoside A對95D細胞轉移相關基因mRNA表達的影響

圖8 Echinoside A對95D細胞轉移相關基因表達的影響Fig. 8 Effect of Echinoside A on the mRNA expression of metastasis-related genes in 95D cells

uPA屬于絲氨酸蛋白酶類，是人體纖溶系統(tǒng)的重要組成成員。uPA可激活纖溶酶原生成纖溶酶，促進細胞外基質的降解，在癌細胞的遷移和浸潤性生長過程中起著關鍵性的作用[16-17]。大量研究表明，uPA廣泛存在于多種腫瘤組織中，且其表達水平均高于正常組織[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)高轉移肺癌細胞株95D中uPA呈高表達，且其uPA表達水平與侵襲轉移能力呈正相關[20]。由圖8a可知，同正常對照組相比，Echinoside A可顯著下調95D細胞uPA mRNA的表達，其中高劑量組表達量下降了47.1%（P＜0.01）。

經uPA激活的纖溶酶除了直接降解ECM蛋白，還可以激活MMPs的前體，活化后MMPs可進一步水解ECM，從而幫助腫瘤細胞向周圍組織浸潤[21]。MMPs是一組鋅依賴性蛋白水解酶，可特異性降解ECM形成的物理屏障，重塑細胞間黏附力，參與腫瘤的免疫等過程，與腫瘤生長和轉移密切相關[22]。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，能特異性與MMPs 1∶1結合，封閉其催化活性。因此MMPs與TIMPs間的比例關系決定了MMPs在腫瘤轉移中所起的作用。其中，TIMP-2可特異性抑制MMP-2的活性，而TIMP-1則對MMP-9有較高的選擇抑制作用[23]。Zhao Qin等[11]研究發(fā)現(xiàn)海參皂苷Ds-echinoside A可顯著下調MMP-9的表達，同時提高TIMP-1的表達。與其報道類似，Echinoside A可顯著降低MMP-2和MMP-9的mRNA的表達（圖8b、c），同時顯著上調TIMP-2和TIMP-1的mRNA的表達（圖8d、e）。其中，與對照組細胞相比，Echinoside A高劑量組細胞MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值分別下降到29.7%（P＜0.05）和28.1%（P＜0.01）。

綜上可知，Echinoside A可通過抑制uPA活性，一方面抑制腫瘤細胞對ECM的降解，另一方面在轉錄水平下調MMP-2和MMP-9的mRNA的表達，上調TIMP-1和TIMP-2的mRNA的表達，進而抑制腫瘤細胞的浸潤與轉移。

2.6 Echinoside A對雞胚絨毛尿囊膜血管生長的影響

圖9 Echinoside A對CAM血管生長情況的影響（×10）Fig. 9 Effect of Echinoside A on the angiogenesis of CAM (×10)

雞胚絨毛尿囊膜實驗因其操作簡便、易于觀察等優(yōu)點，已成為研究血管生成的理想體內模型。其中，在雞胚發(fā)育的5～10 d內，尿囊膜新生毛細血管不斷出現(xiàn)，此階段是用來觀察血管形成的最佳時期。由圖9a可知，雞胚發(fā)育的第10天，正常對照組的CAM上的血管豐富，長勢旺盛，血管網絡分支多且清晰可見。經Echinoside A處理后，毛細血管的數(shù)目較正常對照組顯著減少，顏色變淺，結構模糊，且呈現(xiàn)顯著的劑量-效應關系（圖9b、c），表明Echinoside A具有抑制血管新生的活性。

2.7 Echinoside A對95D細胞VEGF表達的影響

VEGF是公認的調節(jié)血管生成的最重要的細胞因子，它可以介導內皮細胞芽生和遷移；還可以誘導內皮細胞分泌蛋白酶類降解ECM，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移；誘導內皮細胞分化及促進血管網絡形成等[24]。分別采用RT-PCR和蛋白質印跡法檢測了Echinoside A對VEGF mRNA和蛋白表達的影響。由圖10a可知，不同劑量的Echinoside A均能顯著下調95D細胞VEGF mRNA的表達。與正常組細胞相比，低、高劑量組95D細胞VEGF mRNA的相對表達量平均下降了45.6%（P＜0.01）。同時，Echinoside A也可在蛋白水平顯著下調VEGF的表達，其中、高劑量組細胞VEGF的蛋白相對表達量比正常對照組降低了35.8%（P＜0.01），見圖10b。有研究發(fā)現(xiàn)，uPA與其受體結合后可激活纖溶酶，而纖溶酶可釋放或激活大量儲存于ECM的MMPs前體和VEGF，進而加速ECM和BM降解，促進血管內皮細胞增殖及腫瘤新生血管形成[25]。另外，Bueno等[21]發(fā)現(xiàn)uPA還可直接激活MMPs和VEGF，從而引發(fā)纖溶機制的瀑布式級聯(lián)反應、促進血管新生，從而直接參與腫瘤的轉移過程。以上結果提示，Echinoside A通過抑制uPA表達，進而在轉錄和翻譯水平下調VEGF的表達，抑制腫瘤的轉移和血管新生。

圖10 Echinoside A對95D細胞VEGF 基因（a）和VEGF蛋白（b）表達的影響Fig. 10 Effect of Echinoside A on VEGF gene and VEGF protein expression in 95D cells

3 結 論

本研究表明，Echinoside A可以顯著抑制高轉移95D細胞的增殖，且呈現(xiàn)顯著的時間-效應和劑量-效應關系。Echinoside A對95D細胞的IC50值在12 h和24 h分別為0.64 μmol/L和0.38 μmol/L，同其他研究對比發(fā)現(xiàn)，其IC50值遠小于棕環(huán)海參和黃疣海參皂苷，抑制腫瘤增殖的活性效果顯著。

本研究采用Transwell小室法、黏附實驗系統(tǒng)研究了Echinoside A對95D細胞侵襲、遷移、黏附的影響，結果顯示Echinoside A可顯著降低95D細胞侵襲、遷移以及同基質和內皮細胞的黏附能力。通過CAM實驗研究了Echinoside A對血管新生的影響，結果顯示經Echinoside A處理后，毛細血管的密度顯著降低，VEGF基因和VEGF蛋白的表達均顯著降低。與本實驗報道類似，Ds-Echinoside A也可通過下調VEGF的表達從而抑制腫瘤血管新生[11]，提示海參皂苷抗血管新生的作用機制與其在轉錄和翻譯水平下調腫瘤細胞VEGF的表達相關。

腫瘤細胞離開原發(fā)部位發(fā)生浸潤轉移，首先要誘導產生蛋白溶解酶降解ECM和BM，同時產生多種生長因子促進腫瘤微血管的生成。uPA是尿激型纖溶系統(tǒng)的重要成員，在95D細胞中高表達，并且參與細胞黏附、移動，在腫瘤侵襲轉移中起著關鍵作用?；罨膗PA與腫瘤表面的受體結合后，一方面可以直接激活纖溶酶，降解ECM和BM，同時促進儲存于ECM中的MMPs前體和VEGF釋放，加速ECM和BM的降解，促進腫瘤血管新生。另一方面uPA也可直接激活MMPs和VEGF，參與腫瘤的侵襲和轉移的過程[26]。實驗結果顯示，Echinoside A可在轉錄水平顯著下調uPA的表達，還可同時下調MMP-2、MMP-9和上調TIMP-1、TIMP-2的mRNA的表達。進一步采用RT-PCR和western-blotting法研究發(fā)現(xiàn)Echinoside A可顯著下調VEGF的基因和蛋白的表達。以上結果提示Echinoside A抑制95D細胞轉移的機制可能是通過抑制uPA信號通路，進而減少MMPs和VEGF激活和表達，最終抑制腫瘤細胞的轉移和血管新生。

綜上所述，Echinoside A具有顯著的抑制腫瘤細胞轉移和血管新生的活性，這為海參皂苷的藥理活性研究提供了科學依據，也為低值海參的開發(fā)利用提供了新的思路。

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The Triterpene Glycoside Echinoside A Inhibits 95D Cell Metastasis via uPA Signaling Pathway

ZHAO Qin1, LIN Dong2, LIU Haimei1
(1. College of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China; 2. School of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China)

The effect and mechanism of Echinoside A, a triterpene glycoside derived from sea cucumber, on tumor metastasis in lung cancer 95D cell lines were evaluated. The 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) assay was used to determine the anti-proliferation ability of Echinoside A on 95D cells which have high metastasis ability. Transwell assay and cell adhesion assay were used to determine the effect of Echinoside A on tumor metastasis capacity. Chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay was used to determine its effect on tumor angiogenesis. Reverse transcription-polymerase chain reaction and western blotting analysis were used to determine the effect of Echinoside A on tumor metastasis-related gene and protein expression. The results show that Echinoside A could inhibit 95D cell proliferation (P ＜ 0.01), invasion (P ＜ 0.01), migration (P ＜ 0.01) and adhesion (P ＜ 0.01), and decrease angiogenesis in CAM. Echinoside A could also reduce the mRNA expression of urokinase plasminogen activator (uPA) and matrix metalloproteinases (MMP)-2/-9 and significantly promote the mRNA expression of matrix metalloproteinases (TIMP)-1/-2. It could also reduce the gene and protein expression of vascular endothelial growth factor. From these data, it is suggested that Echinoside A can prevent metastasis and angiogenesis through specific inhibition of uPA signaling pathway.

triterpene glycoside from sea cucumber; 95D cell; tumor; metastasis; angiogenesis; signaling pathway

10.7506/spkx1002-6630-201621041

R284；R965

A

1002-6630（2016）21-0241-07

趙芹, 林棟, 劉海梅. 海參皂苷Echinoside A通過uPA信號通路抑制高轉移95D細胞轉移[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 241-247. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621041. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Qin, LIN Dong, LIU Haimei. The triterpene glycoside Echinoside A inhibits 95D cell metastasis via uPA signaling pathway[J]. Food Science, 2016, 37(21): 241-247. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621041. http://www.spkx.net.cn

2016-06-23

山東省自然科學基金項目（ZR2015PC002；ZR2014BP016）；魯東大學人才引進基金項目（LY2012011）

趙芹（1983—），女，講師，博士，研究方向為海洋生物活性成分。E-mail：candyffff@163.com