高效氯氰菊酯急性暴露中斑馬魚相關(guān)酶活性和基因表達(dá)變化

王麗，張?jiān)艥?，耿歌，秦婷婷，劉德立，熊?/p>

華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖北省遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079

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高效氯氰菊酯急性暴露中斑馬魚相關(guān)酶活性和基因表達(dá)變化

王麗，張?jiān)艥?，耿歌，秦婷婷，劉德立，熊?

華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖北省遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079

高效氯氰菊酯廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活中的害蟲防治，但對水生生物卻毒性極高。為探究高效氯氰菊酯對斑馬魚的急性毒性，以總超氧化物歧化酶(總SOD)、過氧化氫酶(CAT)和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性以及相關(guān)的基因表達(dá)量變化為檢測指標(biāo)，研究其對斑馬魚成魚的影響。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，高效氯氰菊酯對斑馬魚屬劇毒物質(zhì)，斑馬魚的急性中毒癥狀為身體蜷曲、抽搐，鰓蓋扇動(dòng)加快，游動(dòng)能力減弱，間歇性出現(xiàn)無規(guī)律急速游動(dòng)和撞壁行為。酶活測定結(jié)果顯示，斑馬魚組織中總SOD、CAT和AChE活性與高效氯氰菊酯呈現(xiàn)低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制的劑量效應(yīng)關(guān)系；相關(guān)基因表達(dá)量的檢測結(jié)果顯示，高效氯氰菊酯會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚肝臟、腸和腦中Sod1、Cat以及Ache的mRNA表達(dá)上調(diào)。研究表明，高效氯氰菊酯的神經(jīng)毒性和氧化損傷共同造成了斑馬魚的中毒甚至死亡。

高效氯氰菊酯；斑馬魚；急性毒性；氧化損傷

Received 14 October 2015 accepted 16 February 2016

高效氯氰菊酯(beta cypermethrin)是一種擬除蟲菊酯類殺蟲劑。其生物活性較高，具有觸殺和胃毒作用，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活中的害蟲防治。它對哺乳動(dòng)物和鳥類毒性較低，但是對水生生物卻有著極高毒性。農(nóng)田施用的高效氯氰菊酯或其制劑可經(jīng)灌溉或雨水淋洗進(jìn)入水體，從而對水生環(huán)境產(chǎn)生長期不良影響[1-2]。

高效氯氰菊酯為兩對外消旋體混合物，其順反比約為2:3，是氯氰菊酯的高效異構(gòu)體，其藥效比氯氰菊酯高近一倍[3]。其疏水性使其很容易被魚鰓吸收。另外，魚體內(nèi)缺乏水解菊酯的酶，因此擬除蟲菊酯在魚體內(nèi)的代謝主要靠氧化作用[4]。擬除蟲菊酯對魚類的毒性作用包括：破壞組織器官、損害神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)、影響繁殖和發(fā)育等[5-6]。徐永學(xué)[7]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎暴露于高效氯氰菊酯中96 h后，斑馬魚胚胎出現(xiàn)色素沉積減少、心包囊腫等畸形，說明高效氯氰菊酯農(nóng)藥對斑馬魚胚胎具有嚴(yán)重的毒害作用；麻冬梅等[8]用高效氯氰菊酯亞致死濃度處理鯉魚21 d后，鯉魚腦、鰓、肝和骨骼肌肉中代謝酶活性、RNA和蛋白質(zhì)質(zhì)量比都逐漸下降；Wei和Yang[9-10]將克氏原螯蝦暴露于高效氯氰菊酯中96 h后，鰓和肝胰臟中活性氧(ROS)含量上升，SOD和CAT活性降低，丙二醛(MDA)含量和蛋白羰基含量增加，出現(xiàn)鰓絲腫脹，層狀上皮細(xì)胞壞死，肝胰臟出現(xiàn)腎小管管腔擴(kuò)大甚至退化。

已有的研究大多集中在污染物對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性，很少有研究毒物對斑馬魚成魚的毒性作用。關(guān)于高效氯氰菊酯對斑馬魚成魚的急性毒性研究也比較少。本研究以成年斑馬魚為研究對象，以不同組織器官中抗氧化酶活性及相關(guān)基因的表達(dá)量變化為指標(biāo)，研究高效氯氰菊酯對斑馬魚的急性毒性作用，為系統(tǒng)的評估高效氯氰菊酯對斑馬魚的毒性作用提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚購于武漢市某水族館。成魚，雌雄均有，健康且規(guī)格大體一致，體長(3.9±0.5) cm，體重(0.42±0.12) g，暴露前在實(shí)驗(yàn)條件下馴化1周以上。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣自來水。飼養(yǎng)密度為1 g·L-1(即每升水容納1 g斑馬魚)，水溫(25±1) ℃，光暗比14 h:10 h。每天投喂飼料并清除排泄物，實(shí)驗(yàn)前一天開始禁食。

高效氯氰菊酯原藥購于武漢健源化工有限公司，純度95%以上。染毒時(shí)先用丙酮配成1 g·L-1的母液，再將母液稀釋成所需濃度。實(shí)驗(yàn)中保證各個(gè)處理中助溶劑濃度均不超過0.1 mL·L-1[11]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

半致死濃度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參照《水生生物毒性試驗(yàn)方法》[11]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)按等對數(shù)間距設(shè)置8個(gè)暴露濃度，分別為3.00、4.05、5.40、7.20、9.60、12.60、16.80和22.50 μg·L-1，另設(shè)1個(gè)空白對照組和1個(gè)溶劑對照組(22.50 μL·L-1，最大濃度處理中助溶劑濃度)。每個(gè)處理組10尾魚，設(shè)3個(gè)重復(fù)。每天定時(shí)換液。記錄24 h、48 h、72 h、96 h的累積死亡數(shù)，運(yùn)用概率單位法計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)。

抗氧化酶活性測定：根據(jù)計(jì)算出的LC50選取高效氯氰菊酯濃度(2、4、6、8 μg·L-1)作為實(shí)驗(yàn)濃度，另設(shè)置1個(gè)空白對照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。開始暴露處理后，每隔24 h取1次樣，到96 h時(shí)終止試驗(yàn)，每個(gè)處理取2條魚，取樣后立刻冷凍麻醉，解剖分別取斑馬魚整個(gè)頭部、內(nèi)臟團(tuán)和軀干，用預(yù)冷的pH 7.5磷酸緩沖液(PBS)充分勻漿，4 ℃冷凍離心(12 000 r·min-1)25 min后取上清液，用于酶活的測定。酶活測定用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)量的測定：暴露處理同上。暴露開始后，每隔24 h取1次樣，到96 h時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每個(gè)處理取5條魚，解剖取斑馬魚的肝臟、腸和腦后，液氮速凍。用無RNase的研磨棒快速研磨，trizol法提取總RNA。純化后用NanoDrop100微量紫外分光光度計(jì)檢測RNA質(zhì)量和濃度。檢測結(jié)果顯示，A260/A280介于1.8～2.0之間，A260/A230大于2.0，RNA純度和濃度均達(dá)到要求。利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將定量的RNA反轉(zhuǎn)獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。熒光定量所用儀器為Bio-RAD CFX96。試劑為SYBR Green PCR master mix。程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，然后3步反應(yīng)，依次為95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，進(jìn)行42個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的第3步即72 ℃、20 s后收集熒光信號，熔解曲線65 ℃到95 ℃，間隔0.5 ℃，每5 s讀取1次熒光信號。所有基因序列來自GenBank，引物信息見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Excel和SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，隨后采用Tukey’s HSD進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P < 0.05表示差異顯著；P < 0.01表示差異極顯著)。

2 研究結(jié)果(Results)

2.1 高效氯氰菊酯對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)

染毒后觀察斑馬魚的中毒癥狀后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中助溶劑對照組未出現(xiàn)斑馬魚死亡，而高濃度的高效氯氰菊酯即刻引起斑馬魚身體蜷曲，抽搐，鰓蓋扇動(dòng)加快，游動(dòng)能力減弱并沉至缸底，偶爾出現(xiàn)急速游動(dòng)和撞壁行為。1 h內(nèi)出現(xiàn)死亡。暴露于低濃度高效氯氰菊酯經(jīng)相對較長時(shí)間后，部分斑馬魚也會(huì)出現(xiàn)上述癥狀，但是程度較輕。

由表2可知，高效氯氰菊酯對斑馬魚的24 h、48 h、72 h、96 h半致死濃度(LC50)分別為10.30 μg·L-1、9.33 μg·L-1、8.26 μg·L-1、7.82 μg·L-1。根據(jù)表3的魚類毒性分類標(biāo)準(zhǔn)[12]，高效氯氰菊酯對斑馬魚屬于極高毒物質(zhì)。

2.2 高效氯氰菊酯對斑馬魚不同組織中抗氧化酶及乙酰膽堿酯酶活性的影響

圖1結(jié)果顯示，斑馬魚暴露于2 μg·L-1高效氯氰菊酯后，其軀干、頭部、內(nèi)臟團(tuán)的總SOD活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均極顯著增加；4 μg·L-1暴露組斑馬魚軀干總SOD活性在24 h、48 h、72 h時(shí)與對照相比極顯著降低；24 h時(shí)，4 μg·L-1和6 μg·L-1暴露組斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)總SOD活性均顯著增加。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量所用引物序列

注：β-Actin, Sod1, Cat的引物序列引自Liu等[25]。

Note: The primer sequences ofβ-Actin,Sod1,Catwere referred to Liu et al[25].

表2 高效氯氰菊酯對斑馬魚的急性毒性

注：回歸方程中x為濃度對數(shù)，y為概率單位。

Note:x stands for logarithm of concentrations and y stands for probit in the regression equation.

表3 魚類急性毒性分類標(biāo)準(zhǔn)

圖1 高效氯氰菊酯暴露后斑馬魚軀干(A)、頭部(B)和內(nèi)臟團(tuán)(C)的總SOD活性注：* P<0.05；** P<0.01。Fig. 1 Total SOD activity of zebrafish trunk (A), head (B) and visceral mass (C) after beta cypermethrin exposureNote:* P<0.05; ** P<0.01.

圖2 高效氯氰菊酯暴露后斑馬魚軀干(A)、頭部(B)和內(nèi)臟團(tuán)(C)的CAT活性注：* P<0.05；** P<0.01。Fig. 2 CAT activity of zebrafish trunk (A), head (B) and visceral mass (C) after beta cypermethrin exposureNote:* P<0.05; ** P<0.01.

圖3 高效氯氰菊酯暴露后斑馬魚軀干(A)、頭部(B)和內(nèi)臟團(tuán)(C)的AChE活性注：* P<0.05；** P<0.01。Fig. 3 AChE activity of zebrafish trunk (A), head (B) and visceral mass (C) after beta cypermethrin exposureNote: * P<0.05; ** P<0.01.

圖2結(jié)果顯示，2 μg·L-1高效氯氰菊酯暴露后，斑馬魚軀干(圖2A)的CAT活性有顯著增加，4 μg·L-1和6 μg·L-1暴露組幾乎無顯著變化。24 h和48 h時(shí)，8 μg·L-1暴露組的CAT活性和對照組相比顯著降低。斑馬魚頭部(圖2B)在2 μg·L-1和4 μg·L-1暴露組48 h、72 h、96 h時(shí)的CAT活性與對照組相比有顯著增加。斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)(圖2C)在2 μg·L-1暴露后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CAT活性都極顯著增加，8 μg·L-1暴露組在72 h和96 h時(shí)的CAT活性相對于對照組顯著降低。

圖3結(jié)果顯示，2 μg·L-1高效氯氰菊酯暴露后，斑馬魚軀干AChE活性極顯著增加，斑馬魚頭部AChE活性沒有明顯變化，斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)48 h、72 h、96 h時(shí)AChE活性極顯著增加；4 μg·L-1、6 μg·L-1暴露組斑馬魚軀干中除了72 h AChE活性有顯著降低外，其余時(shí)間點(diǎn)無顯著變化，斑馬魚頭部72 h、96 h時(shí)AChE活性相對于對照組顯著降低；8 μg·L-1暴露組軀干中AChE活性各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著變化；4μg·L-1、6 μg·L-1、8 μg·L-1暴露24 h時(shí)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)AChE活性均顯著降低。

圖4 高效氯氰菊酯暴露后斑馬魚肝臟(A)、腸(B)、腦(C)中Sod1的mRNA表達(dá)量注：* P<0.05；** P<0.01。Fig. 4 Relative Sod1 mRNA expression of zebrafish liver (A), gut (B) and brain (C) after beta cypermethrin exposureNote: * P<0.05; ** P<0.01.

圖5 高效氯氰菊酯暴露后斑馬魚肝臟(A)、腸(B)、腦(C)中Cat的mRNA表達(dá)量注：* P<0.05；** P<0.01。Fig. 5 Relative Cat mRNA expression of zebrafish liver (A), gut (B) and brain (C) after beta cypermethrin exposureNote: * P<0.05; ** P<0.01.

圖6 高效氯氰菊酯暴露后斑馬魚肝臟(A)、腸(B)、腦(C)中Ache的mRNA相對表達(dá)量注：* P<0.05；** P<0.01。Fig. 6 Relative Ache mRNA expression of zebrafish liver (A), gut (B) and brain (C) after beta cypermethrin exposureNote: * P<0.05; ** P<0.01.

2.3 高效氯氰菊酯對斑馬魚抗氧化酶及乙酰膽堿酯酶相關(guān)基因表達(dá)量的影響

圖4結(jié)果顯示，高效氯氰菊酯暴露后，斑馬魚肝臟組織中(圖4A)，2 μg·L-1暴露組96 h時(shí)，Sod1的基因表達(dá)與對照相比極顯著上調(diào)，4 μg·L-1暴露組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對照相比均沒有顯著變化，6 μg·L-1暴露組從48 h開始有極顯著上調(diào)，而8 μg·L-1暴露組，肝臟Sod1表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有極顯著上調(diào)。斑馬魚腸組織中(圖4B)，2 μg·L-1暴露組在72 h時(shí)Sod1基因有極顯著上調(diào)，4 μg·L-1暴露組在48 h和72 h時(shí)有顯著上調(diào)，6 μg·L-1暴露組在24 h時(shí)Sod1表達(dá)下調(diào)，72 h開始表達(dá)上調(diào)，8 μg·L-1暴露組48 h時(shí)Sod1表達(dá)上調(diào)；斑馬魚腦組織中(圖4C)，2 μg·L-1、4 μg·L-1、8 μg·L-1暴露組96 h Sod1表達(dá)量與對照相比明顯上調(diào)；6 μg·L-1暴露組從48 h開始表達(dá)明顯上調(diào)。

圖5結(jié)果顯示，高效氯氰菊酯暴露后，斑馬魚肝臟組織(圖5A)，2 μg·L-1、4 μg·L-1、6 μg·L-1暴露組，除了4 μg·L-1的96 h和6 μg·L-1的48 h、96 h Cat表達(dá)量明顯上調(diào)外，其余的Cat的表達(dá)量均無明顯變化；8 μg·L-1暴露組，各時(shí)間點(diǎn)肝臟中Cat表達(dá)量與對照組相比均明顯上調(diào)；腸組織中(圖5B)，暴露24 h時(shí)，各個(gè)暴露濃度組Cat表達(dá)量均無明顯變化；2 μg·L-1暴露組Cat表達(dá)量沒有明顯變化；4 μg·L-1暴露組在48 h之后Cat表達(dá)量明顯上調(diào)；6 μg·L-1和8 μg·L-1暴露組均在72 h時(shí)Cat表達(dá)量明顯上調(diào)；腦組織中(圖5C)，2 μg·L-1和4 μg·L-1暴露組，Cat表達(dá)量與對照相比均無明顯變化；6 μg·L-1暴露組Cat表達(dá)量48 h開始出現(xiàn)明顯上調(diào)；8 μg·L-1暴露組72 h開始出現(xiàn)明顯上調(diào)。

圖6結(jié)果顯示，高效氯氰菊酯暴露后，斑馬魚肝臟(圖6A)在暴露24 h時(shí)，8 μg·L-1暴露組Ache表達(dá)量顯著上調(diào)，其他暴露濃度組無明顯變化；48 h時(shí)，6 μg·L-1和8 μg·L-1暴露組有顯著上調(diào)；72 h時(shí)，4 μg·L-1、6 μg·L-1和8 μg·L-1暴露組均有顯著上調(diào)；而暴露96 h時(shí)，2 μg·L-1和8 μg·L-1暴露組Ache表達(dá)上調(diào)，其余無明顯變化。腸組織中(圖6B)，2 μg·L-1、4 μg·L-1高效氯氰菊酯暴露24 h時(shí)，Ache表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)；暴露48 h時(shí)，4 μg·L-1、6 μg·L-1和8 μg·L-1暴露組Ache表達(dá)量和對照相比明顯上調(diào)；72 h和96 h時(shí)，僅6 μg·L-1暴露組Ache表達(dá)量明顯上調(diào)。腦組織中(圖6C)，暴露24 h和48 h時(shí)，僅6 μg·L-1暴露組Ache表達(dá)量有明顯上調(diào)；暴露72 h時(shí)，4 μg·L-1、6 μg·L-1、8 μg·L-1暴露組Ache表達(dá)量均有顯著上調(diào)；96 h時(shí)，4 μg·L-1和6 μg·L-1暴露組Ache表達(dá)量明顯上調(diào)。

3 討論(Discussion)

高效氯氰菊酯屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯農(nóng)藥，結(jié)構(gòu)中含有α-氰基。這使得它的神經(jīng)毒性遠(yuǎn)高于不含α-氰基的Ⅰ型擬除蟲菊酯農(nóng)藥[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，成年斑馬魚暴露于高效氯氰菊酯后，出現(xiàn)身體蜷曲，抽搐，鰓蓋扇動(dòng)加快，游動(dòng)能力減弱等癥狀。間歇性出現(xiàn)無規(guī)律急速游動(dòng)和撞壁行為。這是典型的神經(jīng)中毒癥狀[14]。這些中毒的斑馬魚在轉(zhuǎn)移到清水中后，癥狀會(huì)逐漸減輕直至恢復(fù)正常。半致死濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高效氯氰菊酯原藥對斑馬魚的96 h半致死濃度為7.816 μg·L-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1 mg·L-1。根據(jù)魚類急性毒性標(biāo)準(zhǔn)，高效氯氰菊酯原藥對斑馬魚屬于劇毒類物質(zhì)。

在研究污染物的致毒機(jī)理中，人們發(fā)現(xiàn)許多外源性化學(xué)物質(zhì)是通過產(chǎn)生大量活性氧，從而誘發(fā)機(jī)體多種損傷的。而這些產(chǎn)生活性氧的污染物的暴露，對體內(nèi)抗氧化作用的酶有誘導(dǎo)作用[15]。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是一類敏感的分子生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)。它可以催化超氧陰離子與氫離子反應(yīng)生成過氧化氫，從而解除活性氧對機(jī)體的損傷。許多研究表明，當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時(shí)，SOD活性往往升高；而在重度逆境脅迫下，SOD活性通常降低，使生物體內(nèi)積累過量的活性氧，從而導(dǎo)致生物體的損傷[16]。在本文的研究結(jié)果中，低濃度(2 μg·L-1)高效氯氰菊酯暴露后，斑馬魚軀干、頭部、內(nèi)臟團(tuán)各個(gè)組織中總SOD活性均有顯著性升高。這一結(jié)果與Beaumont和Newman[17]以及唐學(xué)璽和張培玉[16]的研究結(jié)果相似。Stebbing[18]認(rèn)為毒物在低濃度下出現(xiàn)的這種補(bǔ)償現(xiàn)象是其在低毒情況下的刺激反應(yīng)。他把這一現(xiàn)象稱為“毒物興奮效應(yīng)”；除了4 μg·L-1高效氯氰菊酯暴露24、48、72 h時(shí)軀干中總SOD活性出現(xiàn)了顯著降低，相對高濃度的高效氯氰菊酯暴露之后對斑馬魚組織中總SOD活性的抑制作用不是很明顯。

過氧化氫酶(CAT)催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的·OH，在減輕活性氧自由基對機(jī)體細(xì)胞的氧化損傷方面起著重要作用。在本研究結(jié)果中，低濃度的高效氯氰菊酯(2 μg·L-1)暴露后，斑馬魚軀干、頭部、內(nèi)臟團(tuán)均出現(xiàn)CAT活性顯著升高的現(xiàn)象，這一結(jié)果符合“毒物興奮效應(yīng)”；在高濃度高效氯氰菊酯(6 μg·L-1、8 μg·L-1)暴露初期(24 h、48 h)，斑馬魚軀干CAT活性顯著下降，可能是由于軀干的細(xì)胞在接觸到高濃度高效氯氰菊酯后造成了部分損傷，而暴露后期(72 h、96 h)CAT活性又恢復(fù)到正常水平。這可能是由于未損傷的細(xì)胞提高CAT活性補(bǔ)償了受損細(xì)胞的部分；斑馬魚頭部在4 μg·L-1高效氯氰菊酯暴露后CAT活性有顯著上升的趨勢(毒物興奮效應(yīng))而軀干和內(nèi)臟團(tuán)沒有，且高濃度(6 μg·L-1、8 μg·L-1)暴露后頭部CAT活性無明顯變化而軀干和內(nèi)臟團(tuán)有顯著下降的趨勢。出現(xiàn)這種不同可能與頭部眼、腦、鰓等重要器官對高效氯氰菊酯的毒性響應(yīng)有關(guān)。具體的原因還有待進(jìn)一步研究。斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)在8 μg·L-1高效氯氰菊酯暴露72 h和96 h時(shí)CAT活性顯著下降，而在24 h和48 h時(shí)無明顯變化。這一現(xiàn)象與軀干正好相反?？赡艿脑蚴牵喊唏R魚內(nèi)臟團(tuán)不是直接接觸高效氯氰菊酯，因而高效氯氰菊酯對細(xì)胞的損傷作用也相對延遲。

乙酰膽堿酯酶(AChE)具有羧肽酶和氨肽酶的活性，能使乙酰膽堿(ACh)水解成膽堿和乙酸，在神經(jīng)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。AChE活性的測定是評價(jià)水生動(dòng)物對于神經(jīng)毒劑化合物暴露/效應(yīng)的有效手段[19]。AChE上有有機(jī)磷與氨基甲酸酯類化合物的作用位點(diǎn)，在監(jiān)測工作中被認(rèn)為是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類污染的重要檢測指標(biāo)[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚中AChE活性對高效氯氰菊酯也有一定響應(yīng)，在軀干和內(nèi)臟團(tuán)中表現(xiàn)了低濃度(2 μg·L-1)刺激效應(yīng)，高濃度的高效氯氰菊酯暴露后也表現(xiàn)出了對AChE活性的抑制作用。但不同的組織出現(xiàn)這種抑制作用的時(shí)間點(diǎn)不一樣。如對軀干和頭部AChE活性的抑制主要出現(xiàn)在暴露的初期(24 h、48 h)，而對內(nèi)臟團(tuán)AChE活性的抑制主要在暴露后期(72 h、96 h)出現(xiàn)。這種差異可能與接觸到污染物的時(shí)間先后有關(guān)。已有研究證明擬除蟲菊酯類農(nóng)藥一般不抑制膽堿酯酶。它是通過延緩Na+通道關(guān)閉而使去極化時(shí)間延長導(dǎo)致重復(fù)放電[22]。而在本研究中，高濃度的高效氯氰菊酯亦對AChE活性有抑制作用。這種作用干擾了斑馬魚體內(nèi)乙酰膽堿的降解，使乙酰膽堿與神經(jīng)后膜的乙酰膽堿受體的作用無法正常終止，也可能造成斑馬魚長期處于神經(jīng)興奮狀態(tài)[23]，從而表現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)中所觀測到的抽搐、蜷曲等神經(jīng)中毒癥狀。因此，高效氯氰菊酯對斑馬魚的神經(jīng)毒性可能存在多種作用機(jī)制。

生物機(jī)體在受到外界刺激后，機(jī)體在基因水平、蛋白水平、細(xì)胞水平、組織水平等方面均會(huì)有響應(yīng)[24]，用以減輕或適應(yīng)該刺激。但是，酶活性的變化受多種因素(如生物種類、污染物類別、劑量、時(shí)效等)的影響，有時(shí)對外界刺激表現(xiàn)出的效應(yīng)關(guān)系比較復(fù)雜多變。因此，近些年有許多研究通過檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平來監(jiān)控化學(xué)污染物的潛在毒性機(jī)制。Liu等[25]研究PCB126對斑馬魚的發(fā)育毒性、氧化損傷及相關(guān)基因表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的PCB126會(huì)引起斑馬魚胚胎中Sod1和Cat mRNA表達(dá)上調(diào)；Jin等[26]研究毒死蜱對斑馬魚早期生命階段的毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的毒死蜱會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚Cu/Zn-Sod、Mn-Sod、Cat的基因表達(dá)上調(diào)；而Wu等[27]的研究卻發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎暴露于一定濃度的四溴雙酚A(TBBPA)時(shí)，Cu/Zn-Sod、Cat的mRNA表達(dá)下調(diào)。在本文的研究結(jié)果中，相對高濃度(8 μg·L-1)的高效氯氰菊酯暴露24 h后即可誘導(dǎo)斑馬魚肝臟、腸和腦中Sod1和Cat的mRNA表達(dá)，相對較低濃度(2 μg·L-1、4 μg·L-1、6 μg·L-1)的高效氯氰菊酯暴露72 h、96 h后也會(huì)誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)上調(diào)。這一結(jié)果與Liu等[25]和Jin等[26]的結(jié)果類似。這說明高效氯氰菊酯能引起斑馬魚的氧化損傷，高濃度的高效氯氰菊酯暴露后，斑馬魚機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)會(huì)做出反應(yīng)，即上調(diào)表達(dá)Sod1和Cat等抗氧化酶相關(guān)基因來減弱這種氧化損傷；而低濃度的高效氯氰菊酯暴露在短時(shí)間內(nèi)對斑馬魚機(jī)體的損傷還未能引起基因水平的變化。經(jīng)過一段時(shí)間后，斑馬魚體內(nèi)的毒物積累，也能誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)上調(diào)。斑馬魚肝臟、腸、腦中Ache的mRNA表達(dá)量與高效氯氰菊酯也存在與Sod1、Cat類似的劑量效應(yīng)關(guān)系。這說明高效氯氰菊酯的確會(huì)影響斑馬魚的乙酰膽堿酯酶，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。

從時(shí)間序列上看，斑馬魚在低濃度高效氯氰菊酯急性暴露后，總SOD、CAT、AChE活性均升高，且隨暴露時(shí)間的延長活性升高的幅度呈增大的趨勢。而高濃度的高效氯氰菊酯暴露后，酶活性隨時(shí)間的變化趨勢就變得復(fù)雜。在基因表達(dá)方面，斑馬魚在低濃度高效氯氰菊酯急性暴露時(shí)，Sod1、Cat、Ache的mRNA表達(dá)先是無明顯變化，然后隨著暴露時(shí)間的延長逐漸出現(xiàn)上調(diào)，而高濃度的高效氯氰菊酯暴露后，Sod1、Cat、Ache的mRNA表達(dá)均上調(diào)，且隨著暴露時(shí)間的延長上調(diào)倍率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。暴露后期基因上調(diào)倍率的減少可能是損傷細(xì)胞逐漸增加造成的。基因水平的這種變化趨勢或許正是使高濃度高效氯氰菊酯暴露后酶活性隨時(shí)間變化變得復(fù)雜的原因。從酶活性和相關(guān)基因表達(dá)與高效氯氰菊酯暴露的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系來看，在96 h的急性暴露期內(nèi)，高效氯氰菊酯對斑馬魚的毒害作用并沒有隨著暴露時(shí)間的延長而減弱。

高效氯氰菊酯暴露后斑馬魚體內(nèi)抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的變化說明高效氯氰菊酯對斑馬魚造成了氧化損傷。這表明斑馬魚的中毒甚至死亡是由神經(jīng)毒性和氧化損傷共同造成的。斑馬魚抗氧化酶活性和相關(guān)基因的表達(dá)均可以作為生物標(biāo)記物來監(jiān)測水生生態(tài)系統(tǒng)中的高效氯氰菊酯污染。但是，它們分別表現(xiàn)出了不同的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。這兩對效應(yīng)關(guān)系不盡相同的原因可能是基因表達(dá)成蛋白并表現(xiàn)出酶活性還受許多復(fù)雜因素(如蛋白修飾、輔酶因子等)的影響以及基因表達(dá)對外界刺激的響應(yīng)相對延遲。

致謝：感謝中科院武漢水生生物研究所張永安研究員和盧小兵博士對實(shí)驗(yàn)的幫助。

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Variations of Relevant Enzyme Activities and Genes Expressions in Zebrafish under Acute Exposure to Beta Cypermethrin

Wang Li, Zhang Yunze, Geng Ge, Qin Tingting, Liu Deli, Xiong Li*

Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, China

Beta cypermethrin is widely used in agricultural production and pest control in daily life. However, it is highly toxic to aquatic organisms. To explore the acute toxic effects of beta cypermethrin to zebrafish, the activity of total superoxide dismutase (total SOD), catalase (CAT), acetylcholin esterase (AChE), and related gene expression were measured after the exposure of beta cypermethrin. The results of acute tocixity test showed that beta cypermethrin is highly toxic to zebrafish, the symptoms of poisoning include curling, tic, faster flapping of operculum, weaker swimming ability, intermittent appearance of irregular fast moving and striking behaviour. The enzymatic activity of total SOD, CAT, and AChE in zebrafish increased in low dose of beta cypermethrin and decreased in high dose. The results of related gene expression showed that beta cypermethrin up-regulated the mRNA expression of Sod1, Cat, Ache in zebrafish liver, gut, and brain. All the results indicate that the combination effect of neurotoxicity and oxidative damage lead to the toxication even death of zebrafish.

beta cypermethrin; zebrafish; acute tocixity; oxidative damage

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31071653，31371893)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)項(xiàng)目(No.CCNU12A02001)

王麗(1992-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿佣纠韺W(xué)，E-mail: waw934356@sina.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xionglily@mail.ccnu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20151014004

2015-10-14 錄用日期：2016-02-16

1673-5897(2016)4-146-09

X171.5

A

簡介：熊麗(1968—)，女，環(huán)境科學(xué)博士，副教授，主要研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)毒理學(xué)和污染生物化學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文40余篇。

王麗, 張?jiān)艥? 耿歌, 等. 高效氯氰菊酯急性暴露中斑馬魚相關(guān)酶活性和基因表達(dá)變化[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(4): 146-154

Wang L, Zhang Y Z, Geng G, et al.Variations of relevant enzyme activities and genes expressions in zebrafish under acute exposure to beta cypermethrin [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 146-154 (in Chinese)