， ， ， ， ， (.成都大學 生物產(chǎn)業(yè)學院， 四川 成都 6006； .四川金土地中藥材種植集團有限公司， 四川 成都 630)

狹葉紅景天再生植株的快速繁育研究

王躍華1，劉洪明1，彭世明2，何新友1，陳燕1，何詩虹1
(1.成都大學 生物產(chǎn)業(yè)學院， 四川 成都 610106； 2.四川金土地中藥材種植集團有限公司， 四川 成都 611130)

目的：以狹葉紅景天的葉柄作為外植體，建立一套狹葉紅景天植株的快速繁殖技術。方法：通過選取NAA、6-BA和KT組成的3 種植物生長調(diào)節(jié)劑，設計了L16(43)正交試驗，研究了狹葉紅景天葉柄產(chǎn)生不定芽的快速誘導方法，并進一步選用6-BA，NAA和IBA的3 種植物生長調(diào)節(jié)劑組成的培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)研究，最終獲得了狹葉紅景天再生植株。實驗結(jié)果表明，狹葉紅景天不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，經(jīng)過45 d培養(yǎng)后，其不定芽的誘導率為95%；誘導生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L，經(jīng)過50 d培養(yǎng)后，生根率可達87%。

狹葉紅景天； 正交試驗； 再生植株

狹葉紅景天(Rhodiolakirilowii(Regel) Maxim)系薔薇目景天科紅景天屬(RhodiolaL.)的多年生草本植物[1]；生長在海拔2 000～5 600 m的高寒地區(qū)，主要分布于我國西藏、青海、四川和云南等地，為我國著名的高寒中藏藥材[2]。狹葉紅景天具有清熱退燒、解毒和防瘟作用，可治療肺炎、發(fā)燒、腹瀉和四肢腫脹等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，紅景天具有消熱解毒、抗疲勞、抗缺氧、抗衰老等功效[3-4]。

狹葉紅景天植物產(chǎn)種量大，但種子在自然狀態(tài)下發(fā)芽率極低，僅為10%左右[5]。由于其特殊的功效和目前需求量急劇加大，使得狹葉紅景天植物野生資源也日益減少。并且，依據(jù)狹葉紅景天植物具有能在貧瘠的沙漠上很好生長，兼有保持水土和保護生態(tài)環(huán)境的特性，狹葉紅景天植物又可作為治理土壤沙化的優(yōu)質(zhì)樹種；因此，積極開展對狹葉紅景天植物種苗的大量培育具有十分重要的意義。

1 材 料

狹葉紅景天種子采自阿壩州紅原縣。經(jīng)四川師范大學馬丹煒教授鑒定為景天科紅景天屬(RhodiolaL.)植物狹葉紅景天(Rhodiolakirilowii(Regel) Maxim)。本實驗選取狹葉紅景天種子在MS培養(yǎng)基中萌發(fā)生長60 d后幼苗的葉柄為外植體。

2 方 法

2.1 不定芽快速誘導

選取在培養(yǎng)基上生長健壯的狹葉紅景天無菌苗的幼葉，在超凈工作臺上切取長度為1 cm的葉柄接入以MS為基本培養(yǎng)基，并附加不同濃度6-BA、KT和NAA 3種生長調(diào)節(jié)劑組成的三因素四水平L16(43)正交試驗中，在培養(yǎng)條件為25 ℃，光照為14 h/d和光照強度為2 000 lx的條件下進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計其不定芽誘導率。

2.2 不定根的誘導

當不定芽長至1.5 cm以上時，將不定芽按1～2個為1組連同其基部的組織一同切下并轉(zhuǎn)接到以1/2 MS為基本培養(yǎng)基并附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑IBA、6-BA和NAA組成的4種生根培養(yǎng)基，在溫度為22 ℃、每天光照為10 h、光照強度為1 000 lx的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計其生根率。

2.3 煉苗和移栽

當狹葉紅景天組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗2 d后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，先洗去不定根上的培養(yǎng)基，再將其移栽至松軟的沙土中生長。

上述所有培養(yǎng)基的pH值為6.0、瓊脂6.0 g/L；MS培養(yǎng)基中蔗糖30 g/L，1/2 MS培養(yǎng)基中蔗糖15 g/L。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用正交助手Ⅱ進行正交試驗設計和數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié) 果

3.1 不定芽快速誘導

將準備好的外植體接入表1正交試驗設計的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計其不定芽的誘導率，并對實驗結(jié)果進行極差分析和方差分析，結(jié)果見表2和表3。

表1 不定芽誘導L16(43)因子水平表(mg/L)

水平A(NAA)B(6?BA)C(KT)100020．11．00．130．32．00．240．53．00．3

表2 不定芽誘導正交試驗結(jié)果及極差分析

編號ABC誘導率(%)11110212295313387414484521286221357234668243819313241032479113312712342731341418144237115432541644143X10．6650．1250．263X20．4750．7000．575X30．5080．5850．657X40．4650．7030．618R0．2000．5780．394

表3 紅景天不定芽誘導的方差分析

因素偏差平方和自由度F值F0．05F0．01顯著性A0．10435．4749．28029．500B0．903347．5269．28029．500??C0．390320．5269．28029．500?誤差0．023

注：“*”表示該因素的顯著性為顯著(0.01lt;plt;0.05)；“**”表示該因素的顯著性為極顯著(plt;0.01)。

由表2可以看出，未添加生長調(diào)節(jié)劑的1號培養(yǎng)基中，材料在經(jīng)45 d誘導培養(yǎng)后，其不定芽的誘導率為0%；而在添加了不同濃度的6-BA、NAA和KT生長調(diào)節(jié)劑的2號～16號培養(yǎng)基中，均不同程度地誘導出不定芽，由此說明適宜的生長調(diào)節(jié)劑組合對狹葉紅景天不定芽的誘導有重要的促進作用；其中不定芽的誘導率最高的是2號培養(yǎng)基組合A1B2C2，即狹葉紅景天不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L，經(jīng)培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計不定芽誘導率最高為95%。

極差R值大小分析結(jié)果(表2)表明，影響狹葉紅景天不定芽誘導高低因素依次為Bgt;Cgt;A，即培養(yǎng)基中6-BA對不定芽的誘導影響最大，其次是KT，影響最小的因素是NAA。

本試驗設置的3個因素中B和C 2個因素對試驗結(jié)果分別有極顯著影響和顯著影響。其中因素B檢驗值F=47.526，F(xiàn)0.01= 29.500，檢驗值Fgt;F0.01，因而因素B有極顯著影響(plt;0.01)；而因素C檢驗值F=20.526，F(xiàn)0.05=9.280，F(xiàn)0.01= 29.500，檢驗值F0.05lt;Flt;F0.01，說明因素C有顯著影響(0.01lt;plt;0.05)；因素B檢驗值F=47.526大于因素C檢驗值F=20.526，所以影響不定芽誘導率的最主要因素為培養(yǎng)基中6-BA的濃度，其次為培養(yǎng)基中KT的濃度，此實驗結(jié)果與極差分析的結(jié)果相吻合。

3.2 不定根的誘導

當不定芽長至1.5 cm以上時，將不定芽連同其基部的組織一同切下并轉(zhuǎn)接到添加了IBA、6-BA和NAA的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)55 d后統(tǒng)計其生根率結(jié)果見表4。

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對不定根生長的影響

編號IBA(mg/L)6?BA(mg/L)NAA(mg/L)生根率(%)A10．50087．13A200．5025．71A3000．532．98A400012．31

由表4實驗結(jié)果可以看出，A 1培養(yǎng)基1/2 MS+IBA 0.5 mg/L為狹葉紅景天的最佳生根培養(yǎng)基，在經(jīng)過55 d培養(yǎng)后，其生根率最高可達87.13%；而A 4培養(yǎng)基1/2 MS在未添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的情況下，在經(jīng)過55 d培養(yǎng)后，其生根率最低僅為12.31%，由此也可以說明在培養(yǎng)基中添加一定濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑是有利于狹葉紅景天無根苗生根培養(yǎng)的。

3.3 煉苗和移栽

當狹葉紅景天組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗2 d后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，先洗去不定根上的培養(yǎng)基，再將其移栽至松軟的沙土中生長；適當遮光，溫度保持在20 ℃左右，相對濕度在72%左右的條件下生長，在培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計其成活率為100%。

4 結(jié) 論

2015版藥典收載的紅景天藥材為景天科大花紅景天(Rhodiolacrenulata(Hook. f. et Thoms.)H.Ohba)的干燥根和根莖[6]，藥典規(guī)定其有效成分紅景天苷含量不得少于0.50 %。陳海涓等[7]采用RP-HPLC法比較了青海不同產(chǎn)地紅景天屬藥材中成分組成的差異性，研究發(fā)現(xiàn)，由于產(chǎn)地和品種的不同，紅景天屬各植物藥材中的成分組成存在一定的差異性，在其測定的6種不同來源的狹葉紅景天中，以來源于青海倒淌河的狹葉紅景天中的紅景天苷含量最低，為0.62 mg/g；而來源于大通的狹葉紅景天其測得的紅景天苷含量最高，為4.53 mg/g；陳玉婷等[8]測定了紅景天商品藥材的4個主流品種和其他5個野生同屬植物中的紅景天苷含量，其中測得的狹葉紅景天中紅景天苷含量為0.503%，在紅景天商品藥材中的排第3位；因此可以認為，選擇培育優(yōu)良的狹葉紅景天品種具有巨大的市場開展前景。

紅景天屬植物藥材的采集常以全草、根或根莖為主要入藥部位；目前巨大市場需求量已導致該屬許多具有較高藥用價值的種群數(shù)量迅速減少或幾近滅絕[9]。

紅景天屬植物組織培養(yǎng)經(jīng)過了幾十年的研究已取得了一些成果[10-12]， 但目前對狹葉紅景天種苗快速培育的研究文章報道很少，李建民等[13]采用狹葉紅景天的頂芽為外植體，經(jīng)不定芽增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)獲得了狹葉紅景天再生植株；而本實驗以狹葉紅景天的葉柄為外植體，設計了L16(43)正交試驗快速誘導出狹葉紅景天不定芽，并進一步開展狹葉紅景天無根苗的生根培養(yǎng)研究，最終獲得了狹葉紅景天的再生植株；為狹葉紅景天優(yōu)良品種的培育和組培苗的大量快速繁殖提供了一條新途徑，也探索出狹葉紅景天植物在短時間和低成本條件下大批量生產(chǎn)的新方法。

[1]中國植物志編輯委員會.中國植物志(34卷)第1分冊[M].北京:科學出版社,1984.

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[6]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:260.

[7]陳海娟,王慧春,張國燕,等.RP-HPLC法比較青海不同產(chǎn)地紅景天屬藥材中成分組成的差異性[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2012,8(8):31-33.

[8]陳玉婷,谷燕莉,李佳.HPLC測定紅景天藥材主流品種及同屬5種植物的紅景天苷含量[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2003,26(6):48-51.

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[13]李建民,李福安,雷梅麗,等.狹葉紅景天的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學通訊,2004,40(4):472.

(本欄目責任編輯：周忠燕)

Study on Regeneration Plantlet Induction ofRhodiolakirilowii

WANGYuehua1,LIUHongming1,PENGShiming2,HEXinyou1,CHENYan1,HEShihong1

2016-06-27

王躍華(1963—)，女，教授，碩士生導師，主要從事藥用植物生物技術研究；E-mail:1961689636@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.128

S 567

A

1001-4705(2016)11-0128-03