， ， (天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院， 天津 300384)

·種子生產(chǎn)·

桔梗試管苗再生體系優(yōu)化研究

陳小強(qiáng)，張亞鶴，孫寧
(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院， 天津 300384)

桔梗有極高的藥用作用和觀賞價(jià)值。本試驗(yàn)以桔梗試管苗為外植體，通過篩選最適桔梗試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根激素種類和濃度，對(duì)其再生體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+4 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂；最適分化培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂；最適生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

桔梗； 試管苗； 愈傷組織； 激素； 再生體系

桔梗是桔?？平酃俣嗄晟荼局参颷1]。桔梗具有極高的藥用價(jià)值、觀賞價(jià)值及使用價(jià)值[2]。隨著桔梗的各種功用和價(jià)值被人們開發(fā)利用，市場需求量日益增大，使得野生桔梗遭受過度的采挖甚至破壞，極大地影響了生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、多樣性和物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)[3]。

在生產(chǎn)上，因桔梗是異花授粉植物，主要進(jìn)行有性繁殖，自然界和生產(chǎn)中推廣的桔梗都是混雜的群體，到目前為止還沒有純系[4]。而且，有性繁殖不利于保持個(gè)體的優(yōu)良性狀。通過植物組織培養(yǎng)的方法，不僅可以保持植株的優(yōu)良性狀，而且可以加快其繁育速度，實(shí)現(xiàn)工廠化育苗，對(duì)保持種質(zhì)資源，新品種的培育具有重要意義。

本試驗(yàn)通過篩選最適桔梗試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根的激素的種類和濃度，對(duì)其再生體系進(jìn)行優(yōu)化，希望得到桔梗再生體系所需要的各階段最適培養(yǎng)基配方，為桔梗種質(zhì)資源保存、培育新品種以及工廠化育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桔梗(Platycodongrandiflorus)，來源于天津農(nóng)學(xué)院植物細(xì)胞工程研究中心。以無病害、健康生長、品質(zhì)優(yōu)良的桔梗試管苗為研究材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桔梗試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織

取健壯生長、品質(zhì)優(yōu)良的桔梗試管苗，在超凈工作臺(tái)上操作。將健康的試管苗葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的正方形，接種到不同的培養(yǎng)基中(A 1～A 4)。每個(gè)處理30重復(fù)瓶，每瓶接2個(gè)葉片。接種后培養(yǎng)30 d，觀察愈傷組織形態(tài)并統(tǒng)計(jì)出愈率。將MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，碳源選擇30 g/L蔗糖,瓊脂6.5 g/L。添加植物激素如表1。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基植物激素配比

序號(hào)植物激素(mg/L)2，4?D6?BANAAA13A24A30．10．1A40．50．5

1.2.2 桔梗試管苗分化培養(yǎng)

取健康生長的桔梗試管苗愈傷組織，在超凈工作臺(tái)上切剝成0.5 cm3的小塊。接種到培養(yǎng)基(B 1～B 9)中。接種后培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)桔梗不定芽分化率并觀察不定芽狀態(tài)。每個(gè)處理重復(fù)接15瓶，每瓶接2個(gè)愈傷組織。以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，碳源選擇30 g/L的蔗糖,瓊脂6.5 g/L。將6-BA和NAA都分為3個(gè)濃度梯度(6-BA：0.5、1、2 mg/L；NAA：0.05、0.1、0.2 mg/L)，利用正交設(shè)計(jì)法選出最適宜桔梗不定芽分化的培養(yǎng)基。添加的植物激素種類、濃度如表2。

表2 分化培養(yǎng)基植物激素配比

因素水平(mg/L)6?BA0．51．02．0NAA0．050．10．2

1.2.3 桔梗試管苗生根培養(yǎng)

取健壯生長、品質(zhì)優(yōu)良的桔梗試管苗，在超凈工作臺(tái)上操作，將桔梗試管苗轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基(C 1～C 3)中。接種后培養(yǎng)40 d，統(tǒng)計(jì)出根率、平均根長以及根的狀態(tài)。每個(gè)處理接30瓶，每瓶接2個(gè)。設(shè)定1/2 MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L。NAA分成3個(gè)濃度梯度(0.1、0.25、0.5 mg/L) ，篩選出最適合桔梗生根培養(yǎng)基。C 1：1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂；C 2：1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂；C 3：1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室的溫度保持在(25±2)℃，相對(duì)濕度70%～80%，光照時(shí)間14～16 h/d，光照強(qiáng)度1 000～5 000 lx。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

出愈率(%)=生長出的愈傷組織個(gè)數(shù)/接種葉片個(gè)數(shù)×100%；

不定芽誘導(dǎo)率(%)=分化出芽/接種的愈傷組織個(gè)數(shù)×100%；

生根率(%)=生根的個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)×100%；

平均根長(cm)=根總長度/根數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度配比對(duì)桔梗試管苗葉片出愈率的影響

按照試驗(yàn)方法操作，將桔梗試管苗剪切后的葉片作為外植體，接種到添加不同濃度植物激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(A 1～A 4)，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)桔梗葉片誘導(dǎo)愈傷組織情況，包括出愈率和愈傷組織狀態(tài)，具體見表3，圖1。

表3 桔梗葉片誘導(dǎo)愈傷組織情況

處理接種數(shù)(個(gè))愈傷數(shù)(個(gè))出愈率(%)愈傷組織狀態(tài)A1603050．00黃綠色、少量愈傷A2604168．33綠色、濃密愈傷A3601728．33淺黃色、少量愈傷A4601830．00淺黃色、少量愈傷

從圖1可以得出，處理組A 1、A 2都高于A 3、A 4，這說明，在本試驗(yàn)中，2,4-D對(duì)桔梗試管苗葉片的愈傷組織誘導(dǎo)，明顯高于6-BA和NAA的配比。當(dāng)2,4-D濃度為3 mg/L時(shí)，出愈率達(dá)50%；當(dāng)濃度上升為4 mg/L，出愈率為68.33%，此時(shí)愈傷組織呈綠色，比A 1組顏色稍深，數(shù)量較多。當(dāng)使用6-BA和NAA配比的植物激素時(shí)，出愈率為30%左右，愈傷組織呈黃白色，雖然A 4組比A 3組好些，但遠(yuǎn)不如添加2,4-D的A 1，A 2處理組。綜合比較，A 2處理的出愈率最高(68.33%)，而且愈傷組織形態(tài)最好，呈現(xiàn)為綠色且較為濃密，見圖2。此時(shí)最適的培養(yǎng)基配方為MS+4 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

圖1 不同激素處理對(duì)桔梗試管苗出愈率影響

圖2 桔梗愈傷組織(30 d)

2.2 不同激素濃度配比對(duì)桔梗試管苗分化的影響

將桔梗愈傷組織接種到B 1～B 9分化培養(yǎng)基中，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)分化率、不定芽狀態(tài)如表4。

從圖3可以看出，當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，NAA濃度越高，愈傷組織分化率越高。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，桔梗試管苗不定芽分化率隨6-BA增加而減少。不定芽狀態(tài)也隨6-BA濃度增加而變差。

由表4可知，分化率最高的是B 3培養(yǎng)基，分化率為80%。B 7培養(yǎng)基分化率最低，為20%。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析得出：各因素的極差由大到小依次為R NAA(26.670)gt;R 6-BA(25.553)，由此得出，各因素對(duì)分化率影響大小為NAAgt;6-BA。對(duì)于因素6-BA，K1(64.443)gt;K2(56.667)gt;K3(38.890)，說明不同濃度的6-BA對(duì)桔梗分化率能力由強(qiáng)到弱依次為0.5gt;1.0gt;2.0。對(duì)于因素NAA，K3(67.780)gt;K2(51.110)gt;K1(41.110),說明不同濃度的NAA對(duì)桔梗分化率能力由強(qiáng)到弱依次為0.2gt;0.1gt;0.05。比較各個(gè)因素K值，最大的K值是因素NAA的K3(67.780)，因素6-BA的K1(64.443)。因此理論上9種培養(yǎng)基中最適合的處理組為B 3。

圖4 C 1～C 3組桔梗試管苗生根情況

當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L，不定芽分化率最高，不定芽狀態(tài)最好。確定最適的分化培養(yǎng)基配方為：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

表4 桔梗不定芽分化情況

處理植物激素6?BANAA不定芽(個(gè))分化率(%)不定芽狀態(tài)B10．50．051653．33+B20．50．11860．00++B30．50．22480．00+++B41．00．051550．00++B51．00．11653．33+B61．00．22066．67++B72．00．05620．00-B82．00．11240．00+B92．00．21756．67+K164．44341．110K256．66751．110K338．89067．780R25．55326．670

注：“+++”表示分化狀態(tài)情況良好，“++”表示分化狀態(tài)情況較好，“+”表示分化狀態(tài)情況一般，“-”表示分化狀態(tài)情況差。

2.3 不同激素濃度配比對(duì)桔梗試管苗生根的影響

按照試驗(yàn)方法操作，桔梗試管苗接種到C 1～C 9培養(yǎng)基，在經(jīng)過40 d的培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)出根率、平均根長、根部狀態(tài)(表5)。

表5 桔梗生根情況

處理接種數(shù)(個(gè))污染數(shù)(個(gè))生根數(shù)(個(gè))出根率(%)平均根長(cm)根狀態(tài)C16034981．671．75極細(xì)，數(shù)目少C26015490．002．81粗壯，密集叢生數(shù)目多C36025795．002．12較細(xì)，數(shù)量較多

由表5和圖4可知，當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，根極細(xì)，且數(shù)目少(圖4 C 1)；當(dāng)濃度為0.25 mg/L，根非常粗壯，密集，數(shù)量很多(圖4 C 2)。當(dāng)濃度為0.5 mg/L，根較粗，數(shù)量較多(圖4 C 3)；可以得出，生根率最高的雖然是NAA為0.5 mg/L的C 3組處理(達(dá)94.44%)，但觀察試管苗生根情況卻發(fā)現(xiàn)，C 2組長勢明顯好于C 3處理組。C 2組根密集叢生，根的數(shù)目非常多，且非常粗壯；C 3組根的數(shù)目雖然長，但普遍較細(xì)。所以，本試驗(yàn)中，最適宜桔梗試管苗莖段生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

圖3 不同激素處理對(duì)桔梗不定芽分化的影響

3 討 論

3.1 不同濃度植物激素配比對(duì)桔梗試管苗愈傷組織形成的影響

愈傷組織是指植物在局部受到創(chuàng)傷或刺激后，在傷口附近形成新生的組織。在離體培養(yǎng)中，細(xì)胞經(jīng)過脫分化等過程，繼而轉(zhuǎn)變成一種可以迅速增殖的細(xì)胞團(tuán)，即為愈傷組織。由本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同激素配比對(duì)桔梗試管苗葉片快繁中愈傷組織的形成有顯著影響。從目前的研究成果來看，采用2,4-D或6-BA、NAA配比來誘導(dǎo)愈傷的方案比較多。2種方案在當(dāng)前研究中都有試驗(yàn)的數(shù)據(jù)支撐。張鳳生等的試驗(yàn)結(jié)果表明，在植物激素種類為6-BA和NAA時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)效果好，呈現(xiàn)良好的綠色顆粒狀，且愈傷組織數(shù)目較多[5]。王桂梅等的試驗(yàn)結(jié)果也指出，6-BA和NAA有利于誘導(dǎo)愈傷組織[6]。曾思思等利用桔梗為外植體，研究愈傷組織的誘導(dǎo)，明確指出，2,4-D是誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵激素[7]。舒孌認(rèn)為，2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織的效果非常強(qiáng)，誘導(dǎo)率可達(dá)100%[8]。本試驗(yàn)也驗(yàn)證了這點(diǎn)，認(rèn)為4 mg/L的2，4-D對(duì)桔梗愈傷組織誘導(dǎo)是最有利的。從出愈時(shí)間來看，本試驗(yàn)中，平均出愈時(shí)間為16～25 d，而吳京姬等的試驗(yàn)指出，在添加6-BA和NAA的培養(yǎng)基接種7 d后，葉片周圍的傷口的細(xì)胞團(tuán)即可長出愈傷組織[9]。出愈時(shí)間可能與桔梗品種有關(guān)。

3.2 不同濃度激素配比對(duì)桔梗試管苗愈傷組織分化的影響

不同激素配比對(duì)桔梗試管苗愈傷組織分化的影響也不同。張燕等指出，桔梗愈傷組織分化的培養(yǎng)基添加的最適激素為6-BA和NAA[10]，這與陳慶亮等[11]的試驗(yàn)研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)利用正交設(shè)計(jì)法探究不同激素配比對(duì)愈傷組織分化影響，選出最適宜桔梗不定芽分化的培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA濃度一定時(shí)，NAA濃度越高，愈傷組織分化率越高。B 3組處理中，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，愈傷組織分化率最高，可達(dá)80%。

3.3 不同濃度激素配比對(duì)桔梗試管苗生根的影響

在桔梗試管苗生根階段，NAA是大家普遍認(rèn)同的能促進(jìn)根分化的植物激素。但使用質(zhì)量濃度有分歧，基本在0.1～0.5 mg/L。例如唐偉斌等在試驗(yàn)中明確指出，添加NAA能有效促使根系生長，最適的生根配方是添加濃度為0.5 mg/L NAA 的培養(yǎng)基[12]。同樣認(rèn)為，NAA有利于生根的有曾宣姣等[13]的試驗(yàn)，但最終確定的NAA濃度梯度與前者不同，后者認(rèn)為，NAA選用0.1 mg/L效果最佳。基于上述都是將桔梗試管苗作為外植體，添加不同濃度的NAA，但試驗(yàn)結(jié)果不同，顯示的濃度范圍較大，綜合多個(gè)試驗(yàn)項(xiàng)目，本試驗(yàn)控制單一變量，將NAA濃度設(shè)置為0.1 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L 3個(gè)梯度。經(jīng)過40 d培養(yǎng)可得出，生根率最高的是第C 3組處理(NAA為0.5 mg/L)，生根率達(dá)94.44%，但試管苗形態(tài)根據(jù)圖4可發(fā)現(xiàn)C 2組長勢明顯好于C 3處理組。C 2組根密集叢生，根的數(shù)目多且非常粗壯；C 3組根的數(shù)目雖然也多，但普遍較細(xì)。

4 結(jié) 論

本研究以桔梗試管苗為外植體，通過篩選最適桔梗試管苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根的激素的種類和濃度，對(duì)其再生體系進(jìn)行優(yōu)化研究，確定各個(gè)階段的培養(yǎng)基配方。得到桔梗再生體系所需要的各階段最適培養(yǎng)基配方為：

1) 愈傷組織誘導(dǎo)：MS+4 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

2) 愈傷組織分化：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

3) 試管苗生根：1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

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Research on the Optimization of Regeneration System ofPlatycodongrandiflorusTube Seedlings

CHENXiaoqiang,ZHANGYahe,SUNNing

2016-06-23

天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃“作物品質(zhì)及抗逆性的遺傳改良”(編號(hào)：TD 12-5017)。

陳小強(qiáng)(1976—)，女，天津人；副教授，博士，主要從事植物細(xì)胞工程及遺傳育種相關(guān)工作；E-mail:chenxia9663@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.124

S 567

A

1001-4705(2016)11-0124-04