李丹丹，蔣立，王愛(ài)紅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210000)

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肌肽對(duì)局灶性腦缺血損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制

李丹丹，蔣立，王愛(ài)紅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210000)

目的 觀察肌肽對(duì)局灶性腦缺血損傷大鼠的腦保護(hù)作用，探討其作用機(jī)制。方法 將72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和肌肽組，每組24只。模型組和肌肽組采用線栓法制作右側(cè)永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(pMCAO)模型，假手術(shù)組僅分離血管、不插入線栓。大鼠麻醉清醒2 h，肌肽組灌胃給予600 mg/(kg·d)肌肽水溶液，假手術(shù)組和模型組灌胃給予等量無(wú)菌生理鹽水，均2次/d、連續(xù)灌胃7天。三組分別于造模第1、3、7 天各取8只大鼠，檢測(cè)腦梗死體積分?jǐn)?shù)，檢測(cè)血清IL-10、TNF-α水平及TNF-α/IL-10，測(cè)定脾臟指數(shù)。結(jié)果 造模第3、7天，肌肽組腦梗死體積分?jǐn)?shù)均較模型組降低(P<0.05或<0.01)。造模第1、3、7天，模型組及肌肽組血清TNF-α、IL-10水平均較假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)升高(P<0.05或<0.01)；造模第7天，肌肽組血清IL-10水平低于模型組(P<0.01)。造模第1、3天，模型組TNF-α/IL-10較假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)增加(P均<0.05)；造模第7天，模型組TNF-α/IL-10均較假手術(shù)組及肌肽組同時(shí)間點(diǎn)降低(P均<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組造模第3天脾臟指數(shù)升高，造模第7天脾臟指數(shù)降低(P均<0.01)；與模型組比較，肌肽組造模第3天脾臟指數(shù)降低，造模第7天脾臟指數(shù)升高(P均<0.01)。模型組、肌肽組腦梗死體積與血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.852、-0.884，P均<0.05)。結(jié)論 肌肽可減輕局灶性腦缺血大鼠腦損傷，抑制炎癥反應(yīng)、改善免疫失衡狀態(tài)可能是其作用機(jī)制。

局灶性腦缺血；肌肽；腫瘤壞死因子α；白介素10；大鼠

腦卒中是臨床主要致死性和致殘性疾病之一，其中缺血性腦卒中是最常見(jiàn)的類(lèi)型，約占85%[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫相關(guān)性炎癥反應(yīng)在腦缺血病理?yè)p傷過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中Th1類(lèi)細(xì)胞分泌的促炎因子TNF-α與Th2類(lèi)細(xì)胞分泌的抗炎因子IL-10比值失衡是促進(jìn)腦缺血病情發(fā)展的重要因素[3,4]。肌肽為一種天然存在于脊椎動(dòng)物骨骼肌中的生物活性肽，可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、清除氧自由基等，發(fā)揮腦保護(hù)作用[5]。2014年12月～2015年6月本研究探討肌肽對(duì)局麻性腦缺血損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠94只，體質(zhì)量(300±20)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2013-0003。肌肽(美國(guó)Sigma公司)，大鼠血清IL-10及TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，SQP電子天平(德國(guó)Sartorious)，UXF -80 ℃冰箱(美國(guó)Thermo Scientific)，VICTORTMX3多標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)PerkinElmer公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美國(guó)Sigma公司)。

1.2 模型制作及處理 94只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，自由進(jìn)食和飲水，造模前禁食12 h、不禁水。采用線栓法[6]復(fù)制右側(cè)永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(pMCAO)模型：10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎CCA和ECA的近端，用動(dòng)脈夾夾閉ICA，在CCA游離段剪一小口并系一松結(jié)，將制備好的尼龍線栓經(jīng)CCA分支處順I(yè)CA走向緩慢推進(jìn)入顱內(nèi)，自線栓標(biāo)記處(18 mm)進(jìn)入CCA與ICA分叉部位，系緊小口下松結(jié)。以大鼠蘇醒后提尾懸拉出現(xiàn)左上肢屈曲，爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或跌倒為模型成功標(biāo)志。若符合上述癥狀但有蛛網(wǎng)膜下腔出血，予以剔除并用同一批次造模成功的大鼠隨機(jī)補(bǔ)足，保證每組大鼠只數(shù)相等。最終72只大鼠進(jìn)入本研究，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和肌肽組，每組24只。假手術(shù)組不插入線栓，僅分離右側(cè)CCA、ECA和ICA后縫合。大鼠麻醉清醒2 h，肌肽組灌胃給予600 mg/(kg·d)肌肽水溶液，假手術(shù)組和模型組給予等量無(wú)菌生理鹽水，均2次/d、連續(xù)灌胃7天。三組分別于造模第1、3、7 天各取8只大鼠，采用精密電子天平測(cè)量體質(zhì)量，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后迅速斷頭取腦，留取血液標(biāo)本，取出完整脾臟。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 腦梗死體積分?jǐn)?shù)測(cè)定 取模型組和肌肽組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織，置于-20 ℃冰箱速凍20 min，自動(dòng)切片機(jī)切片，自額極后間隔2 mm連續(xù)取冠狀切片5片，并將切片置于TTC溶液中，置于37 ℃恒溫避光孵育30 min。待孵育結(jié)束后，將腦片放入4%多聚甲醛溶液固定24 h，拍照，紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，蒼白區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)。采用Image Pro-Plus6.0圖像處理軟件，測(cè)量梗死灶體積和對(duì)側(cè)正常腦半球的體積，計(jì)算腦梗死體積分?jǐn)?shù)。腦梗死體積分?jǐn)?shù)(%)=梗死灶體積/對(duì)側(cè)半球體積×100%。

1.3.2 血清IL-10和TNF-α水平檢測(cè) 取三組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血液標(biāo)本，離心取血清，采用ELISA法檢測(cè)IL-10、TNF-α。采用VICTORTMX3多標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量OD值，計(jì)算各標(biāo)本IL-10、TNF-α濃度，及TNF-α/IL-10比值。

1.3.3 脾臟指數(shù)測(cè)定 取三組各時(shí)間點(diǎn)大鼠完整脾臟，剔除周邊結(jié)締組織及脂肪組織，生理鹽水洗凈，濾紙擦干，用精密電子天平測(cè)定脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。1.4 相關(guān)性分析 采用Pearson相關(guān)分析法分析腦梗死體積與血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 三組腦梗死體積分?jǐn)?shù)比較 造模第1、3 和7 天，假手術(shù)組腦組織未見(jiàn)灰白色梗死灶，模型組和肌肽組右側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)及紋狀體均有體梗死灶。造模第3、7天，肌肽組腦梗死體積分?jǐn)?shù)低于模型組(P<0.05或<0.01)。

2.2 三組血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10比較 造模后第1、3、7天，模型組及肌肽組血清TNF-α、IL-10水平高于假手術(shù)組(P<0.05或<0.01)；造模第7天，肌肽組血清IL-10水平低于模型組(P<0.01)。造模第1、3天，模型組TNF-α/IL-10高于假手術(shù)組(P均<0.05)；造模第7天，模型組TNF-α/IL-10低于假手術(shù)組及肌肽組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 三組脾臟指數(shù)比較 造模第3天，模型組高于假手術(shù)組，造模第7天低于假手術(shù)組(P均<0.01)；造模第3天，肌肽組低于模型組，造模第7天高于模型組(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 三組各時(shí)間點(diǎn)相關(guān)指標(biāo)比較±s)

注：與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05，▲P<0.01。

2.4 腦梗死體積與血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10的關(guān)系 模型組、肌肽組腦梗死體積與血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.852、-0.884，P均<0.05)，與血清IL-10水平無(wú)相關(guān)性(r=0.194，P>0.05)。

3 討論

缺血性腦卒中患者影像學(xué)檢查均顯示腦缺血側(cè)存在梗死灶，腦梗死體積是判斷缺血性腦卒中的金標(biāo)準(zhǔn)。但腦缺血后缺血側(cè)腦組織水腫對(duì)腦梗死體積計(jì)算有一定影響。本研究選用腦梗死體積分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)腦梗死體積，可減少誤差。肌肽是由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的內(nèi)源性二肽，是目前發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的生物活性肽之一，具有調(diào)節(jié)pH值、清除氧自由基、抗糖基化等生物學(xué)作用[7,8]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見(jiàn)梗死灶，模型組和肌肽組右側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)及紋狀體均有不同程度大小的梗死灶；造模第3、7天，肌肽組腦梗死體積分?jǐn)?shù)均較模型組降低，提示肌肽可抑制腦梗死的發(fā)生、發(fā)展，且具有一定的時(shí)間依賴(lài)性。

促炎和抗炎機(jī)制的失衡即致炎細(xì)胞因子(如TNF-α等)與抗炎細(xì)胞因子(如IL-10等)比例失調(diào)在腦缺血等心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TNF-α是炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，其合成、分泌增加是腦缺血早期損傷加重的主要原因。IL-10是免疫調(diào)節(jié)及抗炎細(xì)胞因子之一，通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞發(fā)育成熟的早期階段，阻斷其向T細(xì)胞遞呈抗原，使T細(xì)胞活化能力受損，導(dǎo)致TNF-α、IFN-γ、IL-2等炎性因子分泌顯著減少，抑制腦缺血后炎性反應(yīng)介導(dǎo)的腦組織損傷[9]。在腦缺血病理生理過(guò)程中，促炎/抗炎機(jī)制動(dòng)態(tài)失衡，炎性反應(yīng)失控，釋放大量促炎細(xì)胞因子，加重神經(jīng)元缺血性損傷[10,11]；亦可出現(xiàn)繼發(fā)抗炎反應(yīng)過(guò)度亢進(jìn)，抑制促炎因子分泌，影響免疫細(xì)胞的成熟、增殖和分化，發(fā)揮強(qiáng)大的免疫抑制作用。因此，保持TNF-α/IL-10平衡可抑制卒中后炎癥反應(yīng)，避免繼發(fā)性損傷腦組織。本研究結(jié)果顯示，腦缺血后第1、3天，模型組血清TNF-α水平顯著升高，IL-10小幅升高，TNF-α/IL-10顯著升高，提示此時(shí)促炎反應(yīng)占主導(dǎo)地位；隨著病程延長(zhǎng)至腦缺血后第7天，血清IL-10水平上升幅度明顯高于TNF-α上升幅度，TNF-α/IL-10明顯低于假手術(shù)組，提示抗炎反應(yīng)占主導(dǎo)地位；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死體積與血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10存在顯著負(fù)相關(guān)；上述結(jié)果與Su等[12]研究結(jié)果一致，提示檢測(cè)血清TNF-α和TNF-α/IL-10可早期診斷和預(yù)測(cè)腦梗死的發(fā)生、發(fā)展。造模第7天，肌肽組血清IL-10水平低于模型組；TNF-α/IL-10高于模型組，且與對(duì)照組接近，推測(cè)肌肽腦保護(hù)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)促炎/抗炎細(xì)胞因子分泌，制約炎癥反應(yīng)和抗炎免疫應(yīng)答實(shí)現(xiàn)的。

脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，亦是免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所，機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)時(shí)，脾臟質(zhì)量會(huì)增加，因此脾臟指數(shù)常作為評(píng)估藥物對(duì)免疫器官抑制作用的基礎(chǔ)指標(biāo)[13～15]。本研究模型組與假手術(shù)組比較，脾臟指數(shù)造模第3天升高，造模第7降低，提示腦缺血刺激丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)，激活免疫抑制反應(yīng)，造成代償性抗炎反應(yīng)綜合癥；與模型組比較，肌肽組造模后第3天脾臟指數(shù)降低，造模后第7天升高，提示肌肽可通過(guò)調(diào)節(jié)脾臟指數(shù)，改善免疫功能紊亂，發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，肌肽可減輕局灶性腦缺血大鼠腦損傷；抑制炎癥反應(yīng)、改善免疫失衡狀態(tài)可能是其作用機(jī)制。

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江蘇省高效優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(YSHL0201-26)；江蘇省教育廳高效“青藍(lán)工程”項(xiàng)目。

王愛(ài)紅(E-mail： wah710630@163.com)

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2015-12-16)