任應(yīng)娜,蘇利偉,楊海龍

陜西省寶雞市中心醫(yī)院 麻醉手術(shù)科(寶雞 721008)

?

·論 著·

CD147參與大鼠神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生與發(fā)展中的作用*

任應(yīng)娜,蘇利偉,楊海龍

陜西省寶雞市中心醫(yī)院 麻醉手術(shù)科(寶雞 721008)

目的 探討CD147在大鼠神經(jīng)損傷后痛覺敏化形成中的作用。方法 分別采用免疫熒光染色法和Western blotting法檢測(cè)大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)后脊髓與背根神經(jīng)節(jié)CD147的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)CD147 mRNA的表達(dá)。大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射CD147過表達(dá)RNA或干涉RNA后，觀察機(jī)械性縮足反應(yīng)閾值(MWT)的變化。結(jié)果 正常大鼠脊髓幾乎不表達(dá)CD147，且SNL后脊髓CD147表達(dá)幾乎無變化；正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)有少量CD147表達(dá)，SNL后CD147和mRNA表達(dá)均升高；大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA或過表達(dá)RNA后，對(duì)照組大鼠MWT未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，RNA過表達(dá)組大鼠的痛域降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA或干涉RNA后，對(duì)照組MWT下降，干涉RNA組痛域亦下降，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 外周神經(jīng)損傷后，大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)CD147及其mRNA表達(dá)均上調(diào)；CD147過表達(dá)可誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛，干涉CD147 RNA表達(dá)，抑制神經(jīng)病理性疼痛。

CD147; 神經(jīng)病理性疼痛; 脊髓; 背根神經(jīng)節(jié); 機(jī)械性縮足反應(yīng)閾值

神經(jīng)病理性疼痛(NP)又稱為神經(jīng)源性疼痛，是一種由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病、結(jié)構(gòu)損害或功能障礙引起的疼痛[1]。與急性疼痛不同，NP常在原發(fā)疾病或損傷痊愈后仍持續(xù)存在數(shù)月、數(shù)年，甚至終身伴隨，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量[2]。近年來，隨著對(duì)NP機(jī)制研究的逐步深入，黏附分子在其形成中的作用備受關(guān)注。大量研究[3-5]表明，黏附分子L1、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子、整聯(lián)蛋白、選擇蛋白等黏附分子在NP的產(chǎn)生與維持中發(fā)揮重要作用。CD147為黏附分子家族中的免疫球蛋白超家族，在免疫炎癥性疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移與浸潤中的研究較多，但對(duì)其是否參與神經(jīng)損傷后痛敏形成的研究較為少見。本研究通過探討CD147在大鼠神經(jīng)損傷后痛覺敏化形成中的作用，旨在為NP的發(fā)生機(jī)制提供新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g， 由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每只動(dòng)物進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)，并實(shí)行12 h明暗交替照明來維持其生物節(jié)律。

小鼠抗CD147(美國Santa Cruz公司)，小鼠抗β-actin(美國Chemicon公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(北京中山金橋生物有限公司)，兔抗Collagen Ⅳ、兔抗Laminin、Alexa488標(biāo)記的羊抗兔IgG和Alexa594標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自美國Sigma公司。

1.2 分組

1)取雄性SD大鼠12只，隨機(jī)分為假手術(shù)組與SNL模型組，各6只，Western blotting檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)CD147變化情況，同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CD147 mRNA的變化。2)取雄性SD大鼠12只，隨機(jī)分為背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA組與背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射過表達(dá)RNA組，各6只，觀察機(jī)械性縮足反應(yīng)閾值(MWT)的變化。3)另取雄性SD大鼠12只，隨機(jī)分為背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA與背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射干涉RNA組，各6只，再制成SNL模型，監(jiān)測(cè)SNL模型后大鼠機(jī)械性縮足反應(yīng)閾值(MWT)的變化。

1.3 方法

1.3.1 脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)模型制備 大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，以雙側(cè)髂后上棘連線為中線，后正中線向左旁開0.5 cm做一縱行切口(長約1.5 cm)，分離皮下肌肉后切除腰6橫突，并使下方腰5脊神經(jīng)得以分離，采用5-0絲線緊緊結(jié)扎2次[6]。術(shù)后，將所有動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)至飼養(yǎng)室，密切觀察其恢復(fù)情況。除了從腰5脊神經(jīng)下穿過而不結(jié)扎外，假手術(shù)組其他操作同手術(shù)組。

1.3.2 行為學(xué)評(píng)估 上午8：00至12：00，對(duì)機(jī)械性縮足反應(yīng)閾值(MWT)進(jìn)行測(cè)定，首先使大鼠在測(cè)試環(huán)境中適應(yīng)3 d，1 h/次。測(cè)試當(dāng)天，將其放入有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)30 min，采用von Frey纖維絲刺激大鼠后足底中部，以纖毛絲彎成“S”為準(zhǔn)，持續(xù)時(shí)間≤5 s。若出現(xiàn)抬足或舔足行為，為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)；出現(xiàn)行走，則應(yīng)重新測(cè)試[7]。

1.3.3 Western blotting檢測(cè) 分別于術(shù)前(對(duì)照)及術(shù)后1、3、7、14、21和28 d取脊髓與背根神經(jīng)節(jié)做蛋白半定量：麻醉后使胸腔打開，經(jīng)主動(dòng)脈快速灌注預(yù)冷的0.01%磷酸鹽緩沖液(PBS)，低溫下取腰5段脊髓新鮮標(biāo)本；根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，分離電泳，封閉后采用小鼠抗CD147(1∶500)、小鼠抗β-actin(1∶5 000) 4 ℃過夜，室溫下孵育二抗HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶5 000) 2 h；最后采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，分析條帶。

1.3.4 RT-PCR 取神經(jīng)節(jié)組織，置入EP管中稱量，每100 mg組織加入1 mL trizol，采用勻漿器研磨后倒入EP管中；加入1/5體積的氯仿，靜置5 min后離心，12 000 r/min，取上清置于另一EP管中；加入等體積的異丙醇，靜置10 min后離心，12 000 r/min，直至出現(xiàn)白色沉淀，即總RNA。白色沉淀溶解后，進(jìn)行定量；取2 μL RNA，采用紫外分光光度計(jì)在260、280波長處檢測(cè)稀釋后的RNA吸光度值，并計(jì)算A260/A280比值和RNA濃度(濃度=A260×40×稀釋倍數(shù))；合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 免疫熒光染色 取脊髓與背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行免疫熒光染色：麻醉后使胸腔打開，經(jīng)主動(dòng)脈快速灌注0.01% PBS，用4%多聚甲醛灌流固定；取腰5脊髓，在多聚甲醛固定液中固定4 h后移至20%、30%蔗糖的0.1 mol/L PB中過夜，直至沉底；冠狀切片，厚30 μm，PBS漂洗后加入小鼠抗CD147(1∶500)、兔抗Collagen Ⅳ(1∶200)、兔抗Laminin(1∶400)，4 ℃孵育過夜。二抗采用Alexa488標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500)與Alexa594標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500)進(jìn)行孵育。所有切片經(jīng)激光共聚焦顯微鏡拍照成像，陰性對(duì)照缺一抗，未發(fā)現(xiàn)免疫陽性產(chǎn)物。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 正常大鼠CD147的表達(dá)情況

免疫熒光染色顯示：SNL后1、3、7 d，正常大鼠脊髓未見明顯免疫熒光染色(圖1)；Western blotting顯示：與對(duì)照組相比，術(shù)后1、3、7、14、21和28 d，正常大鼠脊髓非糖基化CD147與糖基化CD147表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖1 SNL后1、3、7 d正常大鼠脊髓CD147的表達(dá)(免疫熒光染色)

圖2 SNL后不同時(shí)間點(diǎn)正常大鼠脊髓CD147的表達(dá)(Western blotting)

2.2 大鼠外周神經(jīng)損傷后背根神經(jīng)節(jié)CD147及mRNA的表達(dá)

免疫熒光染色顯示：正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)有少量CD147表達(dá)，SNL后3 d背根神經(jīng)節(jié)CD147表達(dá)明顯增高(圖3)。Western blotting顯示：正常背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)有少量非糖基化CD147及少量糖基化CD147；SNL后背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)非糖基化CD147表達(dá)增高，7 d時(shí)增至高峰，持續(xù)至21 d后下降；而糖基化CD147未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。RT-PCR顯示，與對(duì)照組相比，SNL后術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)mRNA顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，14 d增至高峰，持續(xù)至28 d；SNL后對(duì)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)mRNA表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

2.3 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA或過表達(dá)RNA后，對(duì)照組大鼠的MWT未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，過表達(dá)RNA組大鼠痛域明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6)。大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA或干涉RNA后，注射后第14天行SNL模型，觀察行為學(xué)變化。結(jié)果提示：對(duì)照組行SNL模型后MWT下降，干涉RNA組痛域亦下降，但仍明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖7)。

圖3 SNL后3 d背根神經(jīng)節(jié)CD147的表達(dá)(免疫熒光染色)

圖4 SNL后背根神經(jīng)節(jié)CD147的表達(dá)(Western blotting)

圖5 SNL后不同時(shí)間點(diǎn)背根神經(jīng)節(jié)mRNA表達(dá)比較(RT-PCR)

圖6 大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA或過表達(dá)RNA后MWT比較

圖7 大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA或干涉RNA后MWT比較

3 討論

NP是一種常見、頑固性疾病，是感覺神經(jīng)損傷或疾病直接導(dǎo)致的疼痛，以自發(fā)性疼痛、痛覺超敏或觸誘發(fā)痛、痛覺過敏、感覺異常或缺失、伴隨異常交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性反應(yīng)為特點(diǎn)，往往在損傷修復(fù)或疾病痊愈后數(shù)月仍持續(xù)存在[8]。NP的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，對(duì)其治療效果也不盡人意，因此探索新的治療方法已成為臨床亟待解決的問題之一。

近年研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，黏附分子的激活可加重NP，而在NP動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)了一些黏附分子表達(dá)增加的現(xiàn)象。CD147是免疫球蛋白超家族成員之一，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，激活鄰近的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)[12]。Kawasaki等[13]報(bào)道，在NP的不同時(shí)期MMPs均有致痛作用，拮抗MMPs則能減輕痛覺敏感的發(fā)生。作為MMPs的誘導(dǎo)劑，CD147也可能直接參與NP的發(fā)生與發(fā)展，以其為靶位的免疫治療可能為疼痛治療提供有效途徑。

本研究通過探討CD147在大鼠神經(jīng)損傷后痛覺敏化形成中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無論是免疫熒光染色法還是Western blotting法均提示脊髓幾乎不表達(dá)CD147，且NP發(fā)生后脊髓CD147表達(dá)仍無明顯變化。既往研究[14-15]報(bào)道，糖基化的CD147可促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，而非糖基化的CD147則處于無功能狀態(tài)。本研究中，對(duì)照組背根神經(jīng)節(jié)CD147表達(dá)較少，SNL后非糖基化的CD147表達(dá)明顯增加，而糖基化CD147表達(dá)未發(fā)生明顯變化，說明非糖基化的CD147在NP的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。此外，大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射對(duì)照RNA或過表達(dá)RNA后，對(duì)照組大鼠的MWT未見明顯變化，過表達(dá)RNA組大鼠痛域明顯降低；注射對(duì)照RNA或干涉RNA后，對(duì)照組MWT下降，干涉RNA組痛域亦下降，但仍明顯高于對(duì)照組，說明正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射過表達(dá)CD147 RNA可誘發(fā)長時(shí)程的機(jī)械性痛敏，而注射CD147干涉RNA則能抑制神經(jīng)損傷后機(jī)械性痛敏的發(fā)生。

綜上所述，外周神經(jīng)損傷后，大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)CD147及其mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)；CD147過表達(dá)可誘發(fā)NP，干涉CD147 RNA表達(dá)則可抑制其發(fā)生。

[1]Quach T T, Lerch J K, Honnorat J,etal. Neuronal networks in mental diseases and neuropathic pain: Beyond brain derived neurotrophic factor and collapsin response mediator proteins[J]. World J Psychiatry, 2016, 6(1): 18-30.

[2]Popiolek-Barczyk K, Mika J. Targeting the microglial signaling pathways: new insights in the modulation of neuropathic pain[J]. Curr Med Chem, 2016, [Epub ahead of print].

[3]Yamanaka H, Kobayashi K, Okubo M,etal. Increase of close homolog of cell adhesion molecule L1 in primary afferent by nerve injury and the contribution to neuropathic pain[J]. J Comp Neurol, 2011, 519(8): 1597-1615.

[4]Sakai A, Asada M, Seno N,etal. Involvement of neural cell adhesion molecule signaling in glial cell line-derived neurotrophic factor-induced analgesia in a rat model of neuropathic pain[J]. Pain, 2008, 137(2): 378-388.

[5]Liou J T, Lee C M, Lin Y C,etal. P-selectin is required for neutrophils and macrophage infiltration into injured site and contributes to generation of behavioral hypersensitivity following peripheral nerve injury in mice[J]. Pain, 2013, 154(10): 2150-2159.

[6]Kim S H, Chung J M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat[J]. Pain, 1992, 50(3): 355-363.

[7]Chaplan S R, Bach F W, Pogrel J W,etal. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J]. J Neurosci Methods, 1994, 53(1): 55-63.

[8]Wan W, Cao L, Khanabdali R,etal. The Emerging Role of HMGB1 in Neuropathic Pain: A Potential Therapeutic Target for Neuroinflammation[J]. J Immunol Res, 2016, 2016: 6430423.

[9]Patil S B, Brock J H, Colman D R,etal. Neuropathic pain- and glial derived neurotrophic factor-associated regulation of cadherins in spinal circuits of the dorsal horn[J]. Pain, 2011, 152(4): 924-935.

[10] Hanani M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function[J]. Brain Res Rev, 2005, 48(3): 457-476.

[11] Wang C, Wang H, Pang J,etal. Glial cell-derived neurotrophic factor attenuates neuropathic pain in a mouse model of chronic constriction injury: possible involvement of E-cadherin/p120ctn signaling[J]. J Mol Neurosci, 2014, 54(2): 156-163.

[12] Grass G D, Toole B P. How, with whom and when: an overview of CD147-mediated regulatory networks influencing matrix metalloproteinase activity[J]. Biosci Rep, 2015, 36(1): e00283.

[13] Kawasaki Y, Xu Z Z, Wang X,etal. Distinct roles of matrix metalloproteases in the early- and late-phase development of neuropathic pain[J]. Nat Med, 2008, 14(3): 331-336.

[14] Ren B X, Gu X P, Zheng Y G,etal. Intrathecal injection of metabotropic glutamate receptor subtype 3 and 5 agonist/antagonist attenuates bonecancer pain by inhibition of spinal astrocyte activation in a mouse model[J]. Anesthesiology, 2012, 116(1): 122-132.

[15] Gwak Y S, Hulsebosch C E. Neuronal hyperexcitability: a substrate for central neuropathic pain after spinal cord injury[J]. Curr Pain Headache Rep, 2011, 15(3): 215-222.

The Effect of CD147 on Occurrence and Development of Neuropathic Pain in Rats

Ren Yingna, Su Liwei, Yang Hailong.

Department of Anesthesia Surgery, Baoji Central Hospital, Baoji 721008, China

Objective To explore the effect of CD147 on the formation of pain sensitization after neurological damage in rats. Methods Immunofluorescence staining and Western blotting were used to detect the expression of CD147 in spinal marrow and dorsal root ganglion after spinal nerve ligation (SNL), and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to detect the expression of CD147 mRNA in dorsal root ganglion. The changes of mechanical withdrawal threshold (MWT) were observed after injection of CD147 over-expressed or intervened RNA in dorsal root ganglion of the rats. Results Spinal marrow of normal rats did not express CD147, and there was no obvious change of CD147 expression in spinal marrow after SNL. Dorsal root ganglion in normal rats expressed small amount of CD147, and the expression of both CD147 and mRNA increased obviously after SNL. After injection of contrast RNA or over-expressed RNA in dorsal root ganglion of the rats, there were no significant changes in MWT in the control group (P>0.05), but the pain threshold decreased significantly in the over-expressed RNA group (P<0.05). After injection of contrast RNA or intervened RNA, both MWT of the control group and the pain threshold of the intervened RNA group decreased notably, but the pain threshold of the intervened RNA group was still significantly higher than that of the control group (P<0.05). Conclusion The expressions of CD147 and mRNA in dorsal root ganglion of rats would increase after the damage of peripheral nerves. The over-expression of CD147 can induce neuropathic pain, while the intervention of CD147 RNA expression can effectively inhibit the neuropathic pain.

CD147; Neuropathic pain; Spinal marrow; Dorsal root ganglion; Mechanical withdrawal threshold

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161027.1703.048.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.004

中國高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(No:11526233)

R363

A