二甲苯、蒽、苯并[α]芘對蝦夷扇貝幼貝血清SOD、CAT活性的影響

關(guān)曉燕，王擺,#，董穎，李姝熳，高杉，劉衛(wèi)東，周遵春，*

1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連116023

2.山東省南四湖水質(zhì)監(jiān)測中心站，濟(jì)寧272100

二甲苯、蒽、苯并[α]芘對蝦夷扇貝幼貝血清SOD、CAT活性的影響

關(guān)曉燕1，王擺1,#，董穎1，李姝熳2，高杉1，劉衛(wèi)東1，周遵春1，*

1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連116023

2.山東省南四湖水質(zhì)監(jiān)測中心站，濟(jì)寧272100

以蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)為受試生物,設(shè)置3種不同濃度的二甲苯、蒽、苯并[α]芘處理健康的蝦夷扇貝,檢測血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):0.01～1.0mg·L-1的二甲苯、0.002～0.2mg·L-1的蒽、0.001～0.1mg·L-1的苯并[α]芘處理6、12 h后,蝦夷扇貝血清SOD活性升高,處理12 h后對血清SOD活性誘導(dǎo)率均高于處理6 h的；處理6 h后,血清CAT活性降低,而處理12 h后,血清CAT活性升高；具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)效關(guān)系,表明二甲苯、蒽、苯并[α]芘對蝦夷扇貝具有氧化脅迫作用,可能導(dǎo)致其氧化損傷。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),3種污染物處理6 h后,血清SOD活性與CAT活性變化呈顯著負(fù)相關(guān)；而處理12 h后,血清SOD活性與CAT活性變化呈顯著正相關(guān)。上述結(jié)果為開展二甲苯、蒽、苯并[α]芘對海洋貝類毒性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

二甲苯；蒽；苯并[α]芘；蝦夷扇貝；氧化脅迫；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶

由于突發(fā)海洋溢油事故和沿海石油化工業(yè)的發(fā)展,石油類污染物入海量逐年增加,成為潛在的危害我國海洋生態(tài)環(huán)境安全的重要因素之一。單環(huán)芳烴和多環(huán)芳烴(PAHs)是石油類重要組分,在我國近岸海洋環(huán)境中均有檢出。2009年,朱四喜等[1]報(bào)道舟山潮間帶沉積物二甲苯質(zhì)量濃度在40.24～124.45mg·kg-1。渤海西北部海域表層海水和表層沉積物中PAHs含量范圍分別為14.1～254 ng·L-1、1.26～483.38 ng·g-1,其中,包括蒽和苯并[α]芘[2-3]。海洋貝類作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要底棲生物類群,主要濾食浮游動(dòng)植物,對有機(jī)污染物及其代謝產(chǎn)物具有生物蓄積作用,常被用作海洋環(huán)境及河口區(qū)有機(jī)污染指示生物和受試生物。研究表明,海洋生物在代謝芳香烴類化合物時(shí)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),如超氧自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)等[4-6],這些活性氧與蛋白質(zhì)、膜脂、DNA堿基等反應(yīng),造成細(xì)胞的氧化損傷甚至死亡[7-10]。SOD和CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,在污染物脅迫下,生物體通過調(diào)節(jié)抗氧化酶水平,清除體內(nèi)過量的活性氧,降低污染物對生物體的氧化損傷,也常被用作污染物生物監(jiān)測和評(píng)價(jià)指標(biāo)[7-9,11]。

前期研究發(fā)現(xiàn)二甲苯可導(dǎo)致仿刺參(Apostichopus japonicus)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化[12],呼吸樹和腸組織的氧化脅迫[13-14],造成蝦夷扇貝(M.yessoensis)精子超微結(jié)構(gòu)損傷,抑制精卵結(jié)合,導(dǎo)致胚胎和幼體畸形,具有生殖毒性作用[15]。而有關(guān)二甲苯、蒽和苯并[α]芘對蝦夷扇貝的氧化脅迫作用研究尚未見報(bào)道。本文選擇蝦夷扇貝為受試生物,設(shè)置3種不同濃度的二甲苯、蒽和苯并[α]芘處理健康蝦夷扇貝,檢測血清中SOD和CAT活性與3種污染物的處理濃度和處理時(shí)間的變化情況,分析蝦夷扇貝血清SOD、CAT活性與二甲苯、蒽和苯并[α]芘的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)效關(guān)系,為開展3種污染物對海洋生物毒性評(píng)價(jià)篩選敏感的指標(biāo)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器:Sunrise多功能酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan), CT15RE型臺(tái)式微量高速離心機(jī)(日本Hitachi),YSI proplus多參數(shù)水質(zhì)分析儀(美國YSI)。

試劑:二甲苯、二甲基亞砜試劑均為分析純,購自中國國藥有限公司；蒽、苯并[α]芘均為分析純,購自美國阿拉丁公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

蝦夷扇貝(M.yessoensis)的幼貝取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)院海水養(yǎng)殖引育種中心,殼長(4.3±0.3) cm,殼高(4.3±0.3)cm,體重(7.8±1.0)g。幼貝放于經(jīng)砂濾后的清潔海水馴養(yǎng)2周,挑選健康個(gè)體用于毒性實(shí)驗(yàn)。

1.3 蝦夷扇貝的處理及取樣

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,二甲苯(X)處理濃度設(shè)置為: 0.01、0.1、1.0mg·L-1；蒽(A)處理濃度設(shè)置為:0.002、0.02、0.2mg·L-1；苯并[α]芘(B)處理濃度設(shè)置為: 0.001、0.01、0.1mg·L-1。同時(shí)設(shè)置空白對照組(Cont.),空白對照組和各處理組均設(shè)置4個(gè)重復(fù)。用二甲基亞砜配制各處理組1 000倍母液,在25 L玻璃缸中加15 mL母液配制15 L實(shí)驗(yàn)溶液,每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)中各加10只蝦夷扇貝。試驗(yàn)條件:水溫10℃,鹽度30,pH 8.0,間斷性充氧,確保溶解氧大于4.5mg·L-1,避光。處理6 h、12 h后,取各處理組蝦夷扇貝4只放于冰上,用2 mL滅菌注射器從扇貝閉殼肌血竇中抽取血液1.5 mL,4℃,700×g離心5 min,取上清,所得樣品-80℃保存。

1.4 酶活性檢測

SOD和CAT分別活性采用南京建成生物工程研究所的T-SOD和CAT試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件,在P=0.05,P=0.01的置信水平對SOD和CAT活性變化進(jìn)行ANOVA分析,并用Origin 7.5軟件作圖；在P=0.05的置信水平對3種污染物處理后SOD活性與CAT活性變化趨勢進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 二甲苯、蒽、苯并[α]芘對蝦夷扇貝血清SOD活性的影響

二甲苯、蒽、苯并[α]芘對蝦夷扇貝血清SOD活性的影響見圖1。與對照組相比,二甲苯、蒽、苯并[α]芘處理6 h、12 h后均導(dǎo)致蝦夷扇貝血清SOD活性上升,呈顯著的劑量-效應(yīng)正相關(guān)。處理6 h,二甲苯對血清SOD活性誘導(dǎo)率為4.9%～36.1%；處理12 h,二甲苯對血清SOD活性誘導(dǎo)率為11.9%～54.2%(見圖1a)。處理6 h,蒽對血清SOD活性誘導(dǎo)率為0.0%～18.7%；處理12 h,蒽對血清SOD活性誘導(dǎo)率為6.9%～37.5%(見圖1b)。處理6 h,苯并[α]芘對血清SOD活性誘導(dǎo)率為7.4%～15.5%；處理12 h,苯并[α]芘對血清SOD活性誘導(dǎo)率為37.7%～51.2%(見圖1c)。3種污染物處理12 h對蝦夷扇貝血清SOD活性誘導(dǎo)率高于6 h的。

圖1 二甲苯(a)、蒽(b)、苯并[α]芘(c)對蝦夷扇貝血清SOD活性的影響注:*P＜0.05,表示差異顯著；**P＜0.01,表示差異極顯著。Fig.1 The effects of Xylene(a),Anthracene(b),Benzo[α]pyrene(c)on the SOD activities ofM.yessoensisserumsNote:* P＜0.05,means significant difference;** P＜0.01,means extremely significant difference.

圖2 二甲苯(a)、蒽(b)、苯并[α]芘(c)對蝦夷扇貝血清CAT活性的影響注:*P＜0.05,表示差異顯著；**P＜0.01,表示差異極顯著。Fig.2 The effects of Xylene(a),Anthracene(b),Benzo[α]pyrene(c)on the CAT activities ofM.yessoensisserumsNote:* P＜0.05,means significant difference;** P＜0.01,means extremely significant difference.

2.2 二甲苯、蒽、苯并[α]芘對蝦夷扇貝血清CAT活性的影響

二甲苯、蒽、苯并[α]芘對蝦夷扇貝血清CAT活性的影響見圖2。與對照組相比,二甲苯、蒽、苯并[α]芘處理6 h,蝦夷扇貝血清CAT活性降低；而處理12 h,蝦夷扇貝血清CAT活性升高。高、中濃度二甲苯處理6 h,對血清CAT活性抑制率為25.6%～48.1%；二甲苯處理12 h,對血清CAT活性誘導(dǎo)率為38.0%～173.1%(見圖2a)。高、中濃度蒽處理6 h,對血清CAT活性抑制率為1.2%～6.2%；蒽處理12 h,對血清CAT活性誘導(dǎo)率為5.2%～56.0%(見圖2b)。中、高濃度苯并[α]芘處理6 h,對血清CAT活性抑制率為5.0%～13.8%；苯并[α]芘處理12 h,對血清CAT活性誘導(dǎo)率為31.3%～196.3%(見圖2c)。

2.3 蝦夷扇貝血清SOD活性與CAT活性變化的相關(guān)性分析

二甲苯、蒽、苯并[α]芘處理6 h后,蝦夷扇貝血清SOD活性與CAT活性變化呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)R=-0.707；處理12 h后,血清SOD活性與CAT活性變化存在顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)R=0.562。二甲苯、蒽、苯并[α]芘處理6 h后,血清SOD活性與12 h后的呈相同變化趨勢,相關(guān)系數(shù)R=0.623；而二甲苯、蒽、苯并[α]芘處理6 h后,血清CAT活性與12 h后的呈相反變化趨勢,相關(guān)系數(shù)R=-0.663。

表1 二甲苯、蒽、苯并[α]芘暴露蝦夷扇貝血清SOD活性與CAT活性的相關(guān)性Table 1 The correlation between SOD and CAT activities of in xylene-,anthracene-,and benzo[α]pyrene-exposedM.yessoensisserums

3 討論(Discussion)

海洋無脊椎動(dòng)物在有機(jī)污染物的I相代謝過程中產(chǎn)生大量副產(chǎn)物—活性氧[16],過量的活性氧會(huì)導(dǎo)致生物體的氧化損傷[7-9,17]。SOD和CAT是活性氧酶清除系統(tǒng)中重要抗氧化酶,首先SOD將細(xì)胞內(nèi)O-2歧化成H2O2和O2；再經(jīng)CAT將H2O2進(jìn)一步催化成H2O和O2[18-19]。污染物脅迫下生物體通過調(diào)節(jié)抗氧化酶(如:SOD、CAT、GPx等)水平,清除細(xì)胞和組織因有機(jī)污染物代謝產(chǎn)生過量活性氧,降低污染物的的氧化脅迫和氧化損傷；SOD和CAT活性變化也可以反映污染物暴露造成生物體的氧化脅迫水平。前期研究發(fā)現(xiàn),單環(huán)芳烴苯、甲苯、乙基苯和二甲苯暴露12 h可導(dǎo)致仿刺參體腔液脂質(zhì)過氧化,造成仿刺參呼吸樹和腸組織中CAT活性及CAT、GPx基因mRNA相對表達(dá)量變化,可能造成仿刺參體內(nèi)的氧化損傷[12-14]。本文研究發(fā)現(xiàn),0.01～1.0mg·L-1的二甲苯處理6、12 h后,蝦夷扇貝血清SOD活性顯著升高,CAT活性先降低,后升高；表明二甲苯對蝦夷扇貝具有氧化脅迫作用,可能導(dǎo)致其體內(nèi)的氧化損傷。

蒽和苯并[α]芘作為典型的多環(huán)芳烴化合物,低濃度暴露通常導(dǎo)致水生生物抗氧化酶活性的顯著變化[11,20]。2014年,Gravato等[9]報(bào)道1 024μg·L-1的蒽暴露96 h,鋸齒長臂蝦(Palaemon serratus)消化腺CAT活性極顯著升高。馮濤等[22]研究發(fā)現(xiàn)30μg·L-1的苯并[α]芘暴露3 d后大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)肝臟SOD活性顯著升高,隨后逐漸降至對照組水平；而苯并[α]芘對大彈涂魚肝臟CAT活性無顯著影響。王悠等[23]研究發(fā)現(xiàn)2、20μg·L-1的苯并[α]芘暴露6～18 d,鱸魚(Lateolabrax japonicus)肝臟組織中SOD活性顯著升高,而CAT活性無顯著變化。本文結(jié)果表明,0.002～0.2mg·L-1的蒽、0.001～0.1mg·L-1的苯并[α]芘造成蝦夷扇貝體內(nèi)的氧化脅迫；通過對比分析發(fā)現(xiàn),苯并[α]芘對蝦夷扇貝的氧化脅迫作用高于蒽。這與 Palanikumar等[21]研究結(jié)果相似,0.011～0.176mg·L-1的蒽, 0.001～0.031mg·L-1的苯并[α]芘暴露,導(dǎo)致遮目魚(Chanos chanos)的頭、鰓和背鰭肌肉組織CAT活性顯著上升,并隨著暴露濃度增加CAT活性升高,呈顯著的劑量-效應(yīng)正相關(guān)性,且苯并[α]芘對3種組織CAT活性誘導(dǎo)率高于蒽。上官旖旎等[24]報(bào)道0.16、0.80μmol·L-1的對–二甲苯暴露72 h導(dǎo)致大彈涂魚肝臟和白肌組織SOD活性顯著升高,4.0μmol·L-1的對–二甲苯對肝臟和白肌組織SOD活性沒有影響；肝臟和白肌組織中CAT活性不隨對–二甲苯濃度變化而顯著變化。苯并[α]芘和蒽對蝦夷扇貝的脅迫作用均高于二甲苯,3種污染物對蝦夷扇貝的氧化脅迫作用大小與其logKow值具有顯著的正相關(guān)性。

不同規(guī)格、種類扇貝對污染物耐受性可能存在差異,自然狀態(tài)下,扇貝體內(nèi)的抗氧化酶活性與其年齡,生長和繁殖有關(guān),1齡卡塔琳娜州扇貝(Argopecten ventricosus)體內(nèi)CAT活性高于2齡的[25],而3齡櫛孔扇貝(Chlamys farreri)體內(nèi)SOD和CAT活性均高于2齡貝的[26]。原油水溶性組分處理殼長7～11 cm北極扇貝(C.islandica),第2天其體內(nèi)谷胱甘肽(GSH)總含量顯著降低,脂質(zhì)過氧化物(MDA)含量逐漸升高,造成冰島扇貝氧化損傷[27]。本文選擇殼長(4.3±0.3)cm 1齡蝦夷扇貝作為受試生物,發(fā)現(xiàn)二甲苯、蒽、苯并[α]芘處理6 h后,蝦夷扇貝血清SOD與CAT活性變化呈顯著負(fù)相關(guān)；處理12 h后,血清SOD與CAT活性變化存在顯著正相關(guān)。這可能與1齡蝦夷扇貝對3種污染物較為敏感有關(guān),同時(shí)與2種抗氧化酶在活性氧酶清除系統(tǒng)催化的反應(yīng)先后順序有關(guān)。蝦夷扇貝體內(nèi)代謝3種污染物時(shí)產(chǎn)生O-2,先誘導(dǎo)SOD活性升高,SOD將O-2歧化為H2O2和O2；當(dāng)H2O2在體內(nèi)過量累積后,CAT活性被誘導(dǎo),進(jìn)一步將H2O2催化為H2O和O2,這與Tripathi等[19]的研究結(jié)果相似。而有關(guān)二甲苯、蒽、苯并[α]芘導(dǎo)致蝦夷扇貝血清SOD與CAT活性變化的分子作用機(jī)制尚有待于深入研究。

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*共同通訊作者(Co-),E-mail:wangbai1980@hotmail.com

Effects of Xylene,Anthracene,and Benzo[α]pyrene on Enzymatic Activities of SOD and CAT in the Japanese Scallop(Mizuhopecten yessoensis)Serums

Guan Xiaoyan1,Wang Bai1,#,Dong Ying1,Li Shuman2,Gao Shan1,Liu Weidong1,Zhou Zunchun1,*
1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute,Dalian 116023,China
2.Shandong Province Monitoring Center of Water Quality in the Nansi Lake,Jining 272100,China

11 June 2015 accepted 17 August 2015

The present study is aimed to evaluate the effects of xylene,anthracene and benzo[α]pyrene on the activities of superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)in the Japanese scallop(Mizuhopecten yessoensis)serums.Three different concentrations of xylene,anthracene and benzo[α]pyrene were selected to treat the healthy Japanese scallop individuals.The results showed that the SOD activities of Japanese scallop serums were remarkably induced at 6 and 12 hours after the treatments of 0.01-1.0mg·L-1xylene,0.002-0.2mg·L-1anthracene and0.001-0.1mg·L-1benzo[α]pyrene.Compared to controls;the CAT activities were remarkably inhibited at 6 h,but induced at 12 h,showing remarkable dose-effect and time-effect relationship.This suggested that the xylene,anthracene and benzo[α]pyrene had oxidative stress on Japanese scallop,and might cause oxidative damages.Correlation analysis showed that the SOD activity was remarkably negative correlated with the CAT activity of Japanese scallop serums treated with three pollutants at 6 h,but SOD activity was remarkably positive correlated with the CAT activity at 12 h.These results will provide the basic data for toxic assessment of the xylene,anthracene and benzo[α]pyrene on the Japanese scallop.

xylene;anthracene;benzo[α]pyrene;Japanese scallop(Mizuhopecten yessoensis);oxidative stress; SOD;CAT

2015-06-11 錄用日期:2015-08-17

1673-5897(2016)1-289-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150611002

關(guān)曉燕,王擺,董穎,等.二甲苯、蒽、苯并[α]芘對蝦夷扇貝幼貝血清SOD、CAT活性的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2016,11(1):289-294

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海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201205012-7)；大連市科學(xué)技術(shù)基金(2012J21DW029)

關(guān)曉燕(1983-),女,碩士,助理研究員,研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)學(xué),E-mail:guanxiaoyan201@163.com

),E-mail:zunchunz@hotmail.com

簡介:周遵春(1967—)，男，海洋生物學(xué)博士，研究員，主要研究方向海洋生物學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文80余篇。

王擺(1981—)，男，海洋生物學(xué)博士，副研究員，主要研究方向海洋生態(tài)毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇。