徐　霞　張　洪　李　晨　張　敏　劉　芳*?

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響應(yīng)面法優(yōu)化青箱子總皂苷提取工藝

徐霞張洪李晨張敏劉芳*?

（湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199）

文章通過響應(yīng)面分析法，對溶劑法提取青箱子中的總皂苷工藝進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，顯著性影響因素排序?yàn)椋禾崛囟?提取時間>料液比；在提取溫度90oC、提取時間為2 h、料液比為1: 25的條件下，青箱子總皂苷提取率可高達(dá)0.86 %。

響應(yīng)面法；青箱子；總皂苷；提取工藝

1　引　言

青葙子是莧科植物，一般生長在我國大部分地區(qū)的平原、田邊、丘陵以及山坡[1]。常以煎煮法與其他藥材配伍入藥，是較為常用的藥材之一。在中醫(yī)的理論中，青葙子味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清肝瀉火，明目退翳的功效。主治視力模糊、目赤腫痛、目生翳膜和肝火眩暈[2]。在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，青箱子還具有護(hù)肝[3]、抗腫瘤[4]、抗糖尿病[5]等功效。此外，青箱子的水提液不僅可以提高晶狀體的抗氧化能力，還可以預(yù)防晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡等[6,7]。

響應(yīng)面法具有試驗(yàn)次數(shù)少、精確度高、能研究幾種因素間交互作用[8]，所得信息量大且直觀。所采用的是非線性預(yù)測模型擬合，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以提高精確度[9-13]。本實(shí)驗(yàn)通過加熱回流提取法提取其中有效成分青葙總皂苷，然后通過單因素優(yōu)化法和響應(yīng)面分析法來優(yōu)化青葙總皂苷的提取工藝，使青葙子這一傳統(tǒng)的中藥材能更好地在現(xiàn)代醫(yī)療市場中發(fā)揮作用。

2　實(shí)驗(yàn)部分

2.1實(shí)驗(yàn)儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、高效液相色譜CBM-20A型（島津企業(yè)管理（中國）有限公司）、中藥材粉碎機(jī)FW135、177型（天津市泰斯特儀器有限公司）、循環(huán)水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）型（鞏義市予華儀器有限公司）、電子天平IA3003型（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

2.2實(shí)驗(yàn)試劑

青葙子（市售藥材）、60%乙醇、蒸餾水、青葙總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（上海伊卡生物技術(shù)有限公司）、乙腈（高效液相色譜用溶劑，上海陸都化學(xué)試劑廠）、0.1%冰乙酸水溶液。

2.3方法

（1）青葙子材料的預(yù)處理。干燥青葙子藥材200 g，粉碎，在干燥且處于室溫的條件下保存。

（2）青葙總皂苷的提取。精確稱取青葙子5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，按1:20的料液比（即加入100 mL 60%乙醇），然后組裝好加熱回流提取裝置，提取的時間為1 h，提取溫度為80oC，趁熱抽濾，合并濾液，將所得濾液裝載于離心管中，在4000 r/min的速度下離心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中。

（3）青葙總皂苷的含量測定（高效液相色譜法）。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取青箱總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品適量,置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容。分別配置成濃度0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液。用0.45 μm濾膜過濾，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。

液相色譜條件：檢測器：紫外檢測器（UV）；檢測波長：203 nm；流動相：乙腈-0.1 %冰醋酸水溶液（32:68）；柱溫：30oC；色譜時間：20 min；流速：1.0 mL/min。

分別精密吸取以上各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10L，按編號依次進(jìn)樣，通過測得的數(shù)據(jù)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=13175x－3336.8（R2=0.9991），如圖1所示。

總皂苷濃度(mg·mL-1)

圖1.青葙子總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

（4）青葙總皂苷含量的測定。分別精密吸取各組供試品溶液10L，按編號依次進(jìn)樣，通過繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算青葙總皂苷的收率。收率的計算公式為：收率（%）=供試品溶液的溶度×供試品溶液的體積÷原料的質(zhì)量×100%。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1單因素實(shí)驗(yàn)

總皂苷的化學(xué)性質(zhì)不是特別穩(wěn)定，依據(jù)不穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)選定總皂苷三個影響因素及提取時間、提取溫度、料液比，探究其對總皂苷得率的影響。

（1）提取時間單因素實(shí)驗(yàn)。固定料液比為1:20，提取溫度80oC，提取2次，分別把每次提取的時間設(shè)為0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h，趁熱抽濾，合并濾液，將所得濾液裝載于離心管中，在4000 r/min的速度下離心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中。記錄時間對青葙總皂苷提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

由表1表明，隨著加熱時間的增加，總皂苷的收率在2.0 h前增加顯著，在2.0 h后收率緩慢減少。由于總皂苷的化學(xué)性質(zhì)不是特別穩(wěn)定，所以加熱時間過長，會導(dǎo)致總皂苷收率減少。

表1.時間單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)編號123456 時間（h）0.501.002.003.004.005.00 收率（%）0.250.250.820.670.600.58

（2）提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)。固定料液比為1:20，提取2次，每次提取時間0.5 h，分別在溫度為30oC、40oC、50oC、60oC、70oC、80oC、90oC、100oC條件下提取，趁熱抽濾，合并濾液，將所得濾液裝載于離心管中，在4000 r/min的速度下離心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表 2表明，隨著實(shí)驗(yàn)提取溫度的升高，在90oC前總皂苷的收率不斷增加，而在90oC后總皂苷的收率開始減少，因而選擇提取溫度為80oC ~90oC作為提取的較適溫度。

表2.溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)編號12345678 溫度（℃）30.040.050.060.070.080.090.0100 收率（%）0.270.360.510.630.680.790.860.75

（3）料液比單因素實(shí)驗(yàn)。固定提取溫度70oC，提取2次，每次提取時間0.5 h，料液比分別采取1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40的料液比進(jìn)行提取，趁熱抽濾，合并濾液，將所得濾液裝載于離心管中，在4000 r/min的速度下離心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中，結(jié)果見表3。

由表3表明，隨著料液比的增加，總皂苷的收率在1: 25前緩慢增加，在1: 25后收率反而緩慢下降，所以料液比在1:25左右收率較高。

表3.料液比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)編號1234567 料液比1:101:151:201:251:301:351:40 收率（%）0.610.660.680.840.800.760.72

表4.響應(yīng)面分析因素與水平

水平 時間A/ h 溫度B/ ℃ 料液比C/ g·mL-1 -18011:20 09021:25 110031:30

3.2 響應(yīng)面分析法實(shí)驗(yàn)設(shè)計

響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)：根據(jù)Box Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理[14],綜合上述實(shí)驗(yàn)對總皂苷提取率的影響結(jié)果選取溫度、時間和料液比這三個因素，由單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)為3因素3水平的實(shí)驗(yàn)方案。響應(yīng)面分析因素與水平見表4。響應(yīng)面分析結(jié)果見表5。

表5.響應(yīng)面分析結(jié)果

序號ABC收率 1-1-100.13 2-1100.59 31-100.53 41100.84 50-1-10.27 60-110.45 701-10.69 80110.80 9-10-10.37 1010-10.71 11-1010.64 121010.95 130001.01 140001.05 150000.96 160000.93 170000.97

對提取溫度、提取時間、料液比作如下轉(zhuǎn)換：A=（t-90）/10 ,B=（T-2）/1 , C=（2-30）/5 ，響應(yīng)值（Y）是以三次實(shí)驗(yàn)所取得的總皂苷收率的平均值，響應(yīng)面分析結(jié)果如表5所示。析因?qū)嶒?yàn)是1~12組實(shí)驗(yàn)，中心實(shí)驗(yàn)是13~15組實(shí)驗(yàn)，從而估計實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果如圖 2~圖 4所示。使用統(tǒng)計分析軟件Design-expert進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，回歸分析結(jié)果如表 6所示。因子經(jīng)回歸擬合，解得回歸方為：Y=0.98+0.13A+0.16B+0.16C-0.038AB-0.017AC-0.0075BC-0.29A2-0.17B2-0.14C2。表 6結(jié)果顯示決定系數(shù)R2=0.9146，則模型的擬合度很好。根據(jù)F的檢驗(yàn)可知，概率P（F>Fα）的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。表6結(jié)果表明，三種影響因素的一次項(xiàng)二次項(xiàng)都是高度顯著，則說明各具體實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。綜上述分析，三種影響因素的排序?yàn)樘崛囟?提取時間>料液比。

圖2-圖4是因素交互作用的響應(yīng)面和等高線。圖3表明，A的水平變化等高線數(shù)目比B的數(shù)目多，說明提取時間對總皂苷的收率影響不顯著。由圖3所示，當(dāng)提取時間和溫度不變時，隨著料液比的增加收率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。原因是隨著料液比的增加，溶液的黏度會緩慢降低，對總皂苷的溶出有利。若是料液比過大，會使總皂苷含量降低。由圖2-圖4可知，3個響應(yīng)面開口均為向下的凸型曲線，青箱子總皂苷收率存在極大值，說明提取的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計的因素水平范圍之中。

表6.青葙總皂苷提取回歸分析結(jié)果

方差來源自由度平方和均方F值P（F>Fα）顯著性 A10.210.21100.12< 0.0001高度顯著 B10.300.30140.50< 0.0001高度顯著 C10.0800.08037.910.0005高度顯著 AB15.625E-0035.625E-0032.670.1465不顯著 BC12.250E-0042.250E-0040.110.7536不顯著 AC11.225E-0031.225E-0030.580.4710不顯著 A210.130.1359.900.0001高度顯著 B210.350.35165.80< 0.0001高度顯著 C210.0860.08640.950.0004高度顯著 回 歸91.220.1464.00< 0.0001高度顯著 誤 差70.0152.110E-003 失擬項(xiàng)30.0370.0125.700.063 純誤差48.720 E-0032.180 E-003 總 和161.23 R2=0.9146

圖2.提取時間與提取溫度對總皂苷收率影響的響應(yīng)面與等值線

圖3.提取溫度與料液比對總皂苷收率影響的響應(yīng)面與等值線

圖4.提取時間與料液比對總皂苷收率影響的響應(yīng)面與等值線

3.3 工藝條件優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在回歸方程Y=0.98+0.13A+0.16B+0.16C-0.038AB-0.017AC-0.0075BC-0.29A2-0.17B2-0.14C2中所示，二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)。使用Design Expert 軟件對工藝條件優(yōu)化，在模型取值范圍內(nèi)選擇最低點(diǎn)為起點(diǎn)，根據(jù)模型使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明提取時間為2.1 h、提取溫度為90.3oC、料液比為1: 25.35且理論預(yù)測提取率為0.88 %。

為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否與真實(shí)情況相一致，考慮到實(shí)際操作的便利，將條件修正為室溫條件下，提取時間為2 h、提取溫度溫度為90oC、料液比為1:25。在該條件下進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，青箱子總皂苷的平均提取率為0.86 %，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.84 %，重復(fù)性很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

4　結(jié)　論

由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果，得到提取溫度是青箱子總皂苷的最佳控制點(diǎn)，由優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在提取溫度90oC、提取時間為2 h、料液比為1:25的條件下，青箱子總皂苷提取率可高達(dá)0.86%。本實(shí)驗(yàn)通過簡單易行的操作方法將總皂苷成分提取出來，為以后的研究提供一定的參考。

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（責(zé)任編校：宮彥軍）

2016－06－20

湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計劃項(xiàng)目（湘教通[2015]269號472）。

徐霞（1993－），女，吉林蛟河人，湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院制藥工程系學(xué)生。

劉芳(1972－)，女，湖南衡山縣人，湖南科技學(xué)院副教授，研究方向?yàn)樘烊挥袡C(jī)。

R284.2

A

1673-2219（2016）10-0063-04