耿文學(xué)，唐 波，華 濤，侯繼波，張道華，許家榮，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

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免疫增強(qiáng)劑對(duì)豬偽狂犬滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用

耿文學(xué)1，唐 波2，華 濤2，侯繼波2，張道華2，許家榮1，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

為了評(píng)價(jià)免疫增強(qiáng)劑VA5對(duì)豬偽狂犬病毒滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用，將VA5與滅活疫苗混合并制成疫苗。通過常規(guī)Bartha-K61株滅活疫苗、含免疫增強(qiáng)劑滅活疫苗和Bartha-K61活疫苗3組免疫效力對(duì)比試驗(yàn)，首次免疫后14和35d對(duì)豬進(jìn)行采血，并且進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)以及對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該免疫增強(qiáng)劑能夠顯著地提高豬偽狂犬滅活疫苗血清中抗體產(chǎn)生，同時(shí)能顯著提高豬外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)中IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)。交叉中和試驗(yàn)表明，VA5能夠顯著地提高豬偽狂犬滅活疫苗對(duì)偽狂犬流行變異株的中和作用。試驗(yàn)表明，VA5能夠顯著提升豬偽狂犬病毒滅活疫苗體液與細(xì)胞免疫，為研制免疫效果更好的滅活疫苗提供了依據(jù)。

免疫增強(qiáng)劑；偽狂犬病毒滅活疫苗；Bartha-K61株；免疫效力

偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)屬于豬皰疹病毒 I型雙股DNA病毒，其感染癥狀主要體現(xiàn)在神經(jīng)、呼吸以及生殖系統(tǒng)三個(gè)方面[1]。小豬感染偽狂犬病毒主要出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，懷孕母豬則會(huì)導(dǎo)致死胎或者流產(chǎn)。偽狂犬病毒在宿主外周神經(jīng)系統(tǒng)中建立潛在感染，當(dāng)潛在病毒被重新激活或者受到壓力刺激就會(huì)產(chǎn)生感染性病毒[2]。

一直以來，gE基因缺失疫苗Bartha-K61是非常安全有效的偽狂犬疫苗，使用gE基因缺失活疫苗可以有效地控制豬偽狂犬病。然而，近年來在我國許多免疫的豬場(chǎng)中偽狂犬病毒出現(xiàn)流行變異株。新的偽狂犬變異株對(duì)各個(gè)年齡階段的豬都表現(xiàn)出很強(qiáng)的致病性[3]。大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國偽狂犬病毒已經(jīng)發(fā)生變異，變異的偽狂犬病毒在抗原性上不同于傳統(tǒng)毒株[4]。研究表明，由于抗原性發(fā)生變化，常規(guī)活疫苗對(duì)變異偽狂犬病毒株交叉保護(hù)能力有限[5]。因此，研制能夠有效抵抗變異偽狂犬流行毒株的滅活疫苗是非常必要的。加大對(duì)滅活疫苗的開發(fā)研究，對(duì)解決減毒活疫苗在豬群中使用的潛在危害具有重大意義。

滅活疫苗安全性好，但不能誘生細(xì)胞免疫反應(yīng)，然而細(xì)胞免疫在PRV保護(hù)性免疫中起主導(dǎo)作用。研究表明，使用免疫增強(qiáng)劑能夠有效提升滅活疫苗細(xì)胞免疫指標(biāo)[6]。細(xì)胞因子是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，作為細(xì)胞間信號(hào)分子在機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用，可以用來評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果[7]。

在疫苗中加入免疫增強(qiáng)劑是一種快速并且有效地提高疫苗的免疫效果的方法[8]，在本次研究中我們對(duì)有效提升禽用滅活疫苗免疫效力的VA5復(fù)方免疫增強(qiáng)劑進(jìn)行研究，在偽狂犬滅活苗中加入免疫增強(qiáng)劑以此來評(píng)價(jià)其免疫增強(qiáng)效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液，Hyclone公司生產(chǎn)；小牛血清，杭州四季青公司生產(chǎn)；豬外周血淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞裂解液，天津市灝洋生物制品科技有限公司生產(chǎn)；Real time PCR熒光染料和PrimeScript Ⅱ RTase，TaKaRa公司生產(chǎn)。

1.2 疫苗和毒株

偽狂犬活疫苗Bartha-K61，南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn)；滅活疫苗為本室制備，疫苗毒株為Bartha-K61株。中和抗體檢測(cè)使用的流行變異毒株是PRV-NJ株，為本室分離鑒定。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

豬偽狂犬病毒血清抗體陰性健康后備母豬20頭，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物基地提供。

1.4 含免疫增強(qiáng)劑疫苗的配制

含VA5免疫增強(qiáng)劑疫苗的配制詳見專利(申請(qǐng)?zhí)枺?01210235427.0) 。在磷酸鹽緩沖液(0.03mol·L-1PBS，pH7.2) 中加入PolyI∶C、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液；在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盤-80配制成油相溶液；將含免疫增強(qiáng)劑的水相溶液與油相混合，制備成油乳劑的疫苗伴侶。將該疫苗伴侶與事先制備的常規(guī)滅活疫苗或商品滅活疫苗按體積比為1∶9混合，即為含VA5免疫增強(qiáng)劑的伴侶疫苗[8]。

1.5 中和抗體檢測(cè)

將血清無菌處理，56℃滅活30min用于中和試驗(yàn)。用維持液將血清進(jìn)行1∶2，1∶4，1∶8，……倍比稀釋，與200TCID50PRV-NJ株病毒液混合，37℃孵育1h；接種96孔板BHK-21細(xì)胞，100μL·孔-1，每個(gè)血清稀釋度設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)5d，觀察細(xì)胞病變(CPE)記錄病變孔數(shù)目。按Reed-Muench法計(jì)算中和抗體效價(jià)。

1.6 豬的免疫

選健康后備母豬20頭，分別設(shè)常規(guī)滅活疫苗免疫組、加免疫增強(qiáng)劑的滅活疫苗免疫組、活疫苗組和空白對(duì)照組，每組5頭?；钜呙缃M每頭肌肉注射1次1頭份，加免疫增強(qiáng)劑的滅活疫苗組和常規(guī)的滅活苗免疫組分別每頭肌肉注射2.0mL疫苗，14d后以同等劑量加強(qiáng)免疫一次。首次免疫后14d，35d分別采血，分別檢測(cè)血清中各項(xiàng)免疫指標(biāo)。

1.7 外周血淋巴細(xì)胞的分離

在豬首次免疫后14d和35d采血，分離豬外周血淋巴細(xì)胞，用10% RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至1×106cells·mL-1，將稀釋好的細(xì)胞分為3組加到12孔細(xì)胞板中，分別為PRV組、刀豆蛋白A(Con A)組和對(duì)照組，每孔加入1mL。PRV組的細(xì)胞中每孔接種MOI=1的PRV流行毒株，Con A組每孔加入20μL的Con A，對(duì)照組加入20μL的10% RPMI-1640，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，24h后收集細(xì)胞。

1.8 用qRT-PCR的方法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA水平

用TRIZOL按照其說明書的方法提取外周血淋巴細(xì)胞的RNA，以O(shè)ligo(dT)18按照AMV的說明書來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而獲得cDNA，之后用qRT-PCR的方法進(jìn)行IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10的mRNA含量測(cè)定(引物見表1)；β-actin作為內(nèi)參。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)qRT-PCR反應(yīng)后，根據(jù)每個(gè)樣品中的相關(guān)細(xì)胞因子以及管家基因拷貝數(shù)，應(yīng)用2-ΔΔCt法對(duì)各組的細(xì)胞因子進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和抗體的測(cè)定

免疫后14d和35d的血清樣品進(jìn)行中和抗體的檢測(cè)，各滅活疫苗免疫組在免疫后14d可以檢測(cè)到特異性中和抗體1∶23～1∶25；活疫苗免疫組部分轉(zhuǎn)陽；滅活疫苗免疫組在加強(qiáng)免疫后，中和抗體水平持續(xù)升高，免疫后35d特異性中和抗體效價(jià)均可達(dá)1∶25以上，顯著高于活疫苗免疫組特異性中和抗體1∶23～1∶24。含免疫增強(qiáng)劑疫苗組各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)抗體水平均明顯高于常規(guī)滅活疫苗與活疫苗免疫組(P<0.05)(圖1)。

2.2 豬外周血淋巴細(xì)胞中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10mRNA的變化情況

表1 用于細(xì)胞因子檢測(cè)的qRT-PCR引物
Table 1 The qRT-PCR primers for detecting cytokine

圖1 免疫后血清的中和效價(jià)Fig.1 Titer of neutralizing antibody after immunization

首次免疫后14d，活疫苗組外周血淋巴細(xì)胞中，IL-2和IFN-γ含量上升最為明顯；含免疫增強(qiáng)劑滅活疫苗組的外周血淋巴細(xì)胞中，IL-2和IFN-γ的含量也有很大幅度的提升；IL-4和IL-10含量有小幅上升但沒有IL-2和IFN-γ上升明顯；而在常規(guī)滅活疫苗組和空白組的外周血淋巴細(xì)胞中，IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的含量上升幅度均不明顯(圖2)。

首次免疫后35d，活疫苗組外周血淋巴細(xì)胞中，IL-2和IFN-γ含量有了明顯的上升；此時(shí)，含免疫增強(qiáng)劑的滅活疫苗組為二免后3周，IL-2和IFN-γ含量也有了很大幅度的提升；而常規(guī)的滅活疫苗組和空白組的IL-2和IFN-γ含量還是處于比較低的水平?；钜呙缃M和加增強(qiáng)劑的滅活疫苗組IL-4和IL-10含量均有小幅度的提升；常規(guī)的滅活疫苗組和空白組提升幅度也不明顯(圖3)。

3 討論

研究表明，PolyI∶C、胞壁酰二肽(MDP)、咪唑喹啉類、雷西莫特等均為與動(dòng)物相關(guān)模式識(shí)別受體結(jié)合的配體。在禽病上，唐應(yīng)華等[8]用含該成分免疫增強(qiáng)劑的禽流感疫苗免疫，抗體提前一周達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)水平，第3、4周的抗體效價(jià)和常規(guī)的疫苗相比要顯著提升。毛明光等[9]證實(shí)了免疫新城疫疫苗同時(shí)注射PolyI∶C能夠明顯提高血清中新城疫抗體的滴度；Zhang等[10]將PolyI∶C和PRRS滅活疫苗混合免疫動(dòng)物后也誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。

在本研究中，在豬偽狂犬滅活疫苗中加入VA5后所產(chǎn)生的抗體明顯高于傳統(tǒng)的活疫苗組和常規(guī)滅活疫苗組，說明免疫增強(qiáng)劑VA5和豬偽狂犬滅活疫苗混合后可以刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多的特異性抗體。此外，在偽狂犬滅活苗中加入VA5免疫增強(qiáng)劑后，IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)量明顯高于活疫苗組和常規(guī)滅活疫苗組，這是由于VA5免疫增強(qiáng)劑中的多種模式識(shí)別受體的配體成分均能使得IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)量增加，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高CD4+/CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，提高動(dòng)物機(jī)體抗病毒感染的能力[11]。

組別：1，活疫苗組PBMC用PRV刺激；2，活疫苗組PBMC用Con A刺激；3，加增強(qiáng)劑的滅活疫苗組PBMC用PRV刺激；4，加增強(qiáng)劑的滅活疫苗組PBMC用Con A刺激；5，常規(guī)滅活疫苗組PBMC用PRV刺激；6，常規(guī)滅活疫苗組PBMC用Con A刺激；7，空白組PBMC用PRV刺激；8，空白組PBMC用Con A刺激Groups: 1，PBMC of live vaccine group stimulated by PRV; 2，PBMC of live vaccine group stimulated by Con A; 3，PBMC of inactive vaccine with immunopotentiator group stimulated by PRV; 4，PBMC of inactive vaccine with immunopotentiator group stimulated by Con A; 5，PBMC of conventional inactive vaccine group stimulated by PRV; 6，PBMC of conventional inactive vaccine group stimulated by Con A; 7，PBMC of blank group stimulated by PRV; 8，PBMC of blank group stimulated by Con A

組別：1.活疫苗組PBMC用PRV刺激；2.活疫苗組PBMC用Con A刺激；3.加增強(qiáng)劑的滅活疫苗組PBMC用PRV刺激；4.加增強(qiáng)劑的滅活疫苗組PBMC用Con A刺激；5.常規(guī)滅活疫苗組PBMC用PRV刺激；6.常規(guī)滅活疫苗組PBMC用Con A刺激；7.空白組PBMC用PRV刺激；8.空白組PBMC用Con A刺激Group: 1，PBMC of live vaccine group stimulated by PRV; 2，PBMC of live vaccine group stimulated by Con A; 3，PBMC of inactive vaccine with immunopotentiator group stimulated by PRV; 4，PBMC of inactive vaccine with immunopotentiator group stimulated by Con A; 5，PBMC of conventional inactive vaccine group stimulated by PRV; 6，PBMC of conventional inactive vaccine group stimulated by Con A; 7，PBMC of blank group stimulated by PRV; 8，PBMC of blank group stimulated by Con A

該免疫增強(qiáng)劑含有天然免疫受體中Toll-like receptor(TLR) 激動(dòng)劑的成分。根據(jù)對(duì)TLR的研究結(jié)果，不同TLR在不同免疫類型的細(xì)胞上的豐度以及在細(xì)胞表面的位置均有差異[12]，且不同信號(hào)通路最終所激活的免疫刺激因子略有差異[6]，但均能有效提高機(jī)體的細(xì)胞免疫[13]。因此，在本研究中，含VA5的滅活疫苗組IL-2和IFN-γ含量大幅上升，細(xì)胞免疫水平得到提高。

機(jī)體Th1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以進(jìn)行相互調(diào)節(jié)，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子可以抑制Th2細(xì)胞的增殖，從而影響IL-10等細(xì)胞因子的分泌[14]。在本次試驗(yàn)中，含增強(qiáng)劑滅活疫苗組的IL-2和IFN-γ的含量有了非常明顯的上升，而IL-4和IL-10的含量上升幅度不明顯，這與Th1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的相互調(diào)節(jié)有關(guān)[7]。

總的來說，含增強(qiáng)劑的滅活疫苗可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，對(duì)偽狂犬流行毒株的免疫效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)活疫苗，這不但可以避免活疫苗所導(dǎo)致的毒力返強(qiáng)等安全問題，而且其免疫效果要優(yōu)于弱毒活疫苗?，F(xiàn)如今，傳統(tǒng)的豬偽狂犬疫苗對(duì)豬偽狂犬病毒變異株的免疫保護(hù)力大大降低，含VA5的豬偽狂犬滅活疫苗的研究有著重要的意義!

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Improved immune efficiency of inactivated vaccine of pseudorabies virus by immunopotentiator

GENG Wen-xue1，TANG Bo2，HUA Tao2，HOU Ji-bo2，ZHANG Dao-hua2，XU Jia-rong1，*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China; 2.NationalResearchCenterofVeterinaryBiologicalsEngineeringandTechnology，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China)

To evaluate the effect of immunopotentiator VA5on immunity potency of inactive vaccine of pseudorabies virus (PRV)，inactive vaccine was mixed with VA5.The comparison test of the immunity potency was conducted by using conventional inactive vaccine of Bartha-K61strain of PRV，inactive vaccine mixed with VA5and attenuated vaccine of Bartha-K61strain.Blood samples were collected at 14and 35days after the first immunization, respectively.Neutralization experiments and cytokine detection were performed.The results showed that，compared with live and inactive vaccine of Bartha-K61strain of PRV，the inactive vaccine with VA5could induce higher neutralizing antibody against the heterologous strain of PRV and increase the expression levels of IL-2and IFN-γ mRNA in porcine peripheral blood lymphocytes (PBMC).Neutralization test showed that VA5could significantly increase the level of neutralizing antibody against the epidemic variation strain of PRV.This experiment showed that VA5could improve the humoral and cellular immunity of inactive PRV vaccine，and provide a basis for paving the better immune effect of inactivated PRV vaccine.

immunopotentiator; inactive PRV vaccine; Bartha-K61strain; immunity potency

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.04

2016-04-18

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX(11)2047]；農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303046); 江蘇省優(yōu)質(zhì)學(xué)科(20150101)

耿文學(xué)(1990—)，男，山東淄博人，碩士研究生，從事預(yù)防傳染病學(xué)研究。E-mail: 13951692816@163.com

*通信作者，許家榮，E-mail: xjr@njau.edu.cn

S851.35

A

1004-1524(2016)11-1828-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1828-1833

http://www.zjnyxb.cn

耿文學(xué)，唐波，華濤，等.免疫增強(qiáng)劑對(duì)豬偽狂犬滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(11): 1828-1833.