雞細(xì)小病毒與禽呼腸病毒二重PCR檢測(cè)方法的建立

奉 彬，謝芝勛，鄧顯文，張艷芳，黃嬌玲，王 盛，范 晴，謝志勤，黃 莉，謝麗基，曾婷婷，羅思思，劉加波

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

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雞細(xì)小病毒與禽呼腸病毒二重PCR檢測(cè)方法的建立

奉 彬，謝芝勛*，鄧顯文，張艷芳，黃嬌玲，王 盛，范 晴，謝志勤，黃 莉，謝麗基，曾婷婷，羅思思，劉加波

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

建立可同時(shí)檢測(cè)雞細(xì)小病毒(Chicken parvovirus，ChPV)與禽呼腸病毒(Avian reovirus，ARV)的二重PCR方法，為防控ChPV與ARV提供技術(shù)支撐。根據(jù)雞細(xì)小病毒 NS1基因和禽呼腸病毒 σC基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物用于檢測(cè)ChPV和ARV，通過(guò)優(yōu)化二重PCR的反應(yīng)體系，特異性、敏感性試驗(yàn)評(píng)價(jià)建立的ChPV與ARV二重PCR。優(yōu)化后的二重PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，其中ChPV與ARV的上、下游引物各1.0 μL，混合模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL；最佳的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 1 min，56.1℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。結(jié)果顯示，建立的二重PCR能夠同時(shí)擴(kuò)增出204 bp ChPV和405 bp ARV片段；該方法對(duì)ChPV與ARV的檢測(cè)敏感性分別達(dá)到58 fg和53 fg，但對(duì)雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒、馬立克病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性支氣管炎病毒等病原體均無(wú)特異性擴(kuò)增，對(duì)ChPV與ARV混合感染的臨床陽(yáng)性病料的檢測(cè)結(jié)果與各病毒單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果符合率為94%以上。建立的二重PCR可用于ChPV與ARV感染的快速鑒別診斷。

雞細(xì)小病毒；禽呼腸病毒；二重PCR；特異性；敏感性

雞細(xì)小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是引起雞腸道疾病重要的病原體之一，可以引起以腹瀉、精神抑郁、體溫調(diào)節(jié)障礙、生長(zhǎng)遲緩、增加飼料消耗等為特征的急性或慢性腸道性疾病、矮小綜合癥、營(yíng)養(yǎng)不良綜合癥[1]。在雞群中普遍存在，主要侵害雛雞，但以商品肉雞感染率較高、蛋雞或種雞次之。自2010年以來(lái)，北美、波蘭、匈牙利、克羅地亞，南韓等[2-6]國(guó)家和地區(qū)相繼暴發(fā)了該病，給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。禽呼腸病毒(Avian reovirus，ARV)是引起禽類(lèi)法氏囊胸腺收縮、關(guān)節(jié)炎、骨骼異常發(fā)育、產(chǎn)蛋率下降以及營(yíng)養(yǎng)吸收障礙綜合征等疾病的一種雙鏈RNA病毒，不同性別和日齡的雞群均可感染[7]。ChPV與ARV是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的主要病原，均能引起雛雞腸道性疾病、矮小綜合癥以及營(yíng)養(yǎng)吸收障礙綜合征等疾病，因此，建立一種快速檢測(cè)ChPV與ARV診斷方法十分必要。Zsak L等[8]根據(jù)ChPV NS1基因的保守序列，建立了ChPV的快速特異PCR檢測(cè)方法；CarratalàA等[9]分別根據(jù)ChPV NS1和VP基因的保守序列，建立了ChPV的快速特異巢式PCR檢測(cè)方法，同時(shí)建立了檢測(cè)ChPV的TaqMan探針熒光定量PCR。于新方等[10]建立了檢測(cè)ARV的一步法RT-PCR，最低能檢測(cè)到10 pg 總RNA的ARV。李天芝等[11]建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 最低則能檢測(cè)到4.8×101拷貝的ARV。曾婷婷等[12]建立的同時(shí)檢測(cè)8種雞免疫抑制病病毒GeXP多重PCR最小檢測(cè)量為每種100 copies/20 μL PCR反應(yīng)體系。Bruhn S等[13]也建立了進(jìn)行ARV檢測(cè)的RT-PCR 方法，適用于檢測(cè)疫苗中污染的外源禽呼腸病毒。與常規(guī)PCR方法相比，多重PCR具有能夠同時(shí)檢測(cè)并且鑒別多種病原體的優(yōu)點(diǎn)，在混合感染的鑒別診斷中具有較高的臨床實(shí)用價(jià)值，目前尚無(wú)ChPV與ARV二重PCR檢測(cè)方法。根據(jù)ChPV NS1基因和ARV σC基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物用于檢測(cè)ChPV和ARV，通過(guò)優(yōu)化二重PCR的反應(yīng)體系，建立一種快速、特異、敏感、重復(fù)性好的二重PCR方法，為防控ChPV與ARV提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與試劑 ChPV、ARV、H9亞型禽流感病毒 (AIV H9)、新城疫病毒 (NDV)、馬立克病病毒 (MDV)、傳染性支氣管炎病毒 (IBV)、傳染性喉氣管炎病毒 (AILTV)均由廣西動(dòng)物疫病病原生物學(xué)與診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。DNA/RNA共提試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen生物技術(shù)(杭州)有限公司；DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體試劑盒、2×Taq PCR Mix購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 引物 參照GenBank中ChPV NS1基因與ARV σC基因的保守序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件DNA Star和Primer 5.0，最后經(jīng)過(guò)NCBI BLAST比對(duì)驗(yàn)證，設(shè)計(jì)出兩對(duì)特異性引物。引物合成于北京六合華大基因科技股份有限公司(表1)。

表1 ChPV/ARV引物序列

1.2 方法

1.2.1 DNA/RNA共抽提及RNA反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)DNA/RNA共提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取ChPV、馬立克病病毒 (MDV)和雞傳染性喉氣管炎病毒 (AILTV)的DNA；同時(shí)抽提ARV、H9亞型禽流感病毒 (AIV H9)、雞新城疫病毒 (NDV)和雞傳染性支氣管炎病毒 (IBV)的RNA，參照反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，直接用于試驗(yàn)，之后將DNA于-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 二重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 二重PCR反應(yīng)體系總體積為25.0 μL，包含ChPV 和ARV上下游引物共2μL，引物濃度稀釋為10 pmol/μL，待用；2×PCR Mix 12.5 μL；ChPV 和ARV的DNA各1 μL共2.0 μL的混合模板，最后用ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。優(yōu)化內(nèi)容為對(duì)二重PCR各引物濃度、體積；對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，退火溫度共設(shè)置8個(gè)溫度梯度(50.0℃～60.0 ℃)， 72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，拍照保存結(jié)果。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 用本試驗(yàn)建立的二重ChPV/ARV PCR對(duì)ChPV、ARV、NDV、MDV、AIV H9、IBV、AILTV的待檢核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)此方法的特異性。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 經(jīng)Beckman UV-800 紫外分光光度計(jì)對(duì)ChPV和ARV的原始核酸濃度進(jìn)行測(cè)定， 分別10倍梯度稀釋后的ChPV和ARV核酸模板用于進(jìn)行二重PCR檢測(cè)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，用以評(píng)估二重PCR方法的敏感性。

1.2.5 臨床樣品檢測(cè) 從2014年10月～2015年12月采集的樣品(雞喉頭、泄殖腔雙棉拭子)中隨機(jī)抽取50份，用建立的二重PCR對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，樣品重復(fù)檢測(cè)兩次。

1.2.6 序列測(cè)序驗(yàn)證 將陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物回收純化，與pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送至英濰捷基(上海)有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 二重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)ChPV和ARV的兩對(duì)引物濃度、引物體積、PCR退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化，最佳引物濃度組合確定為：ChPV和ARV上、下游引物各1.0 μL(圖1)。最佳的退火溫度為56.1 ℃。最佳的二重PCR反應(yīng)體系是： 2 ×PCR Mix 12.5 μL，ChPV和ARV上、下游引物各1.0 μL，混合模板ChPV和ARV各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。最佳的反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 1 min， 56.1 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～9.0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 μL ChPV引物；1～9.1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μL ARV引物；N.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000；1-9.0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8 μL ChPV primer；1-9.1.8,1.6,1.4,1.2,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2 μL ARV primer；N.Negative control

圖1 二重PCR引物體積的優(yōu)化

Fig.1 Optimization of primer volumes of duplex PCR

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.50.0 ℃；2.50.7 ℃；3.51.9 ℃；4.53.8 ℃；5.56.1 ℃；6.58.0 ℃；7.59.2 ℃；8.60.0 ℃；N.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000；1.50.0 ℃；2.50.7 ℃；3.51.9 ℃；4.53.8 ℃；5.56.1 ℃；6.58.0 ℃；7.59.2 ℃；8.60.0 ℃；N.Negative control

圖2 ChPV、ARV二重溫度梯度PCR

Fig.2 Duplex PCR temperature gradient of ChPV and ARV

2.2 二重PCR特異性試驗(yàn)

用本試驗(yàn)所建立的二重PCR對(duì)待檢核酸樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，能夠擴(kuò)增出ChPV 204 bp和ARV405 bp的特異性條帶；而NDV、MDV、AIV H9、IBV、AILTV均不出現(xiàn)特異性條帶(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；N.陰性對(duì)照；1.ChPV+ARV；2.ARV；3.ChPV；4.新城疫病毒；5.馬立克病病毒 ；6.H9亞型禽流感病毒；7.雞傳染性支氣管炎病毒；8.雞傳染性喉氣管炎病毒

M.DNA Marker DL 2 000；N.Negative control；1.ChPV+ARV；2.ARV；3.ChPV；4.NDV；5.MDV；6.AIV H9；7.IBV；8.AILTV

圖3 二重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.3 The specificity test results of duplex PCR

2.3 二重PCR敏感性試驗(yàn)

用Beckman UV-800紫外分光光度計(jì)分別測(cè)得ChPV和ARV的核酸濃度，為58.2 ng/μL和53.0 ng/μL。用優(yōu)化后的二重PCR對(duì)分別10倍梯度稀釋的ChPV和ARV核酸模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，此方法最低能同時(shí)檢測(cè)到58 fg ChPV和53 fg ARV(圖4)。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

從2014年10月～2015年12月采集的樣品(雞喉頭、泄殖腔雙棉拭子)中隨機(jī)抽取50份，用建立的二重PCR對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示有8份ChPV陽(yáng)性樣品，未檢出ARV陽(yáng)性樣品，重復(fù)檢測(cè)與第1次檢測(cè)結(jié)果一致(圖5)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.58.2 ng ChPV+53.0 ng ARV；2.5.8 ng ChPV +5.3 ng ARV；3.582 pg ChPV +530 pg ARV；4.58 pg ChPV +53 pg ARV；5.5.8 pg ChPV +5.3 pg ARV；6.582 fg ChPV +530 fg ARV；7.58 fg ChPV +53 fg ARV；8.5.8 fg ChPV +5.3 fg ARV；9.0.58 fg ChPV +0.53 fg ARV; N.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000；1.58.2 ng ChPV+53.0 ng ARV；2.5.8 ng ChPV +5.3 ng ARV；3.582 pg ChPV +530 pg ARV；4.58 pg ChPV +53 pg ARV；5.5.8 pg ChPV +5.3 pg ARV；6.582 fg ChPV +530 fg ARV；7.58 fg ChPV +53 fg ARV；8.5.8 fg ChPV +5.3 fg ARV；9.0.58 fg ChPV +0.53 fg ARV; N.Negative control

圖4 二重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.4 The sensitivity test results of duplex PCR

2.5 測(cè)序結(jié)果

擴(kuò)增的基因片段序列經(jīng)Blast比對(duì)分析顯示，擴(kuò)增的204 bp ChPV目的片段同源性高達(dá)98%，405 bp ARV目的片段同源性高達(dá)99%。

3 討論

雞的腸道類(lèi)疾病嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，由ChPV和ARV引起雞腸道傳染病較為常見(jiàn)，臨床癥狀較相似，且在臨床上呈現(xiàn)出混合感染，給臨床診斷帶來(lái)困難。常規(guī)的檢測(cè)方法難以同時(shí)對(duì)它們進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒別診斷，不能對(duì)這些疾病進(jìn)行有效的防制，嚴(yán)重地制約了現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。

目前，鑒定病毒的方法主要依靠傳統(tǒng)的病毒分離、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA等，但是這些方法通常具有耗時(shí)費(fèi)力且敏感性不高等弊端， 相反PCR方法則具有操作簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)[14]。臨床檢測(cè)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)多種的病原體混合感染的情況，因此，急切需要一種低成本、高效率的檢測(cè)手段對(duì)批量臨床進(jìn)行快速的檢測(cè)鑒別。本試驗(yàn)建立的二重PCR技術(shù)能夠?qū)hPV和ARV 兩種家禽腸道傳染病病原進(jìn)行快速的鑒別診斷，與常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)相比，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省了大量的人力物力等資源，有利于此類(lèi)疫病的預(yù)防、控制和撲滅。二重(或多重)PCR方法利用兩對(duì)(或多對(duì))引物同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)(或多個(gè))模板，彌補(bǔ)了常規(guī)PCR的不足。但是，二重(或多重)PCR的同一體系中存在引物對(duì)和多種模板，擴(kuò)增反應(yīng)中引物對(duì)之間、不同模板之間、引物對(duì)與模板之間都可能存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此，試驗(yàn)中應(yīng)該對(duì)各種條件分別進(jìn)行優(yōu)化，避免引物對(duì)和模板之間的非特異性結(jié)合，防止出現(xiàn)非特性擴(kuò)增，同時(shí)要盡可能的避免引物二聚體的產(chǎn)生。此外，擴(kuò)增的目的片段需要有合適的退火梯度，使得各引物對(duì)退火條件盡可能保持一致，以保證其擴(kuò)增產(chǎn)物量的相對(duì)平衡[15-16]。

本試驗(yàn)針對(duì)ChPV NS1基因、ARV σC基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出2段特異性片段，長(zhǎng)度分別為204 bp和405 bp，目的片段之間具有明顯的長(zhǎng)度差異(>100 bp)，在同一體系中便于鑒別，且每一對(duì)引物的擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)。本試驗(yàn)建立的方法能夠檢測(cè)到樣本中ChPV和ARV核酸，因此，可用于監(jiān)控雞群感染ChPV和ARV后的排毒情況及臨床上ChPV和ARV流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)。核酸質(zhì)量的好壞是直接影響PCR靈敏度的另一重要因素。在臨床檢測(cè)中往往以糞便(棉拭子)為樣品，但是由于糞便中含有多種抑制PCR反應(yīng)因子，因此建議使用商品化的核酸提取試劑盒以獲得較好質(zhì)量的核酸。此外，為了減少樣品的假陰性，采樣后應(yīng)對(duì)樣品盡快進(jìn)行處理，且將樣品置于低溫條件下運(yùn)輸、保存。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照；3～24.臨床病料

本試驗(yàn)根據(jù)ChPV和ARV的保守基因序列，設(shè)計(jì)合成用于檢測(cè)ChPV和ARV的兩對(duì)特異性引物，同時(shí)鑒別出兩種病毒，其優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，其中ChPV上、下游引物各1.0 μL，ARV上、下游引物各1.0 μL，混合模板ChPV和ARV各1.0 μL共2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL；最佳的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56.1 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。退火溫度優(yōu)化過(guò)程中，在50.0 ℃～60.0 ℃均能成功擴(kuò)增出特異性目的片段，表明優(yōu)化的ChPV/ARV二重PCR能夠確保一定溫度范圍內(nèi)擴(kuò)增效率的相對(duì)平衡。特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)表明，該ChPV/ARV二重PCR能夠成功擴(kuò)增出ChPV和ARV的特異性片段，相反，對(duì)AIV H9、NDV、MDV、IBV、AILTV等不敏感，具有良好的特異性；該ChPV/ARV二重PCR能同時(shí)檢出58 fg的ChPV和53 fg的ARV核酸模板，敏感性較高，能夠在臨床上滿足ChPV和ARV的混合感染檢測(cè)的要求。

本研究用建立的二重ChPV/ARV PCR方法對(duì)來(lái)自廣西區(qū)內(nèi)的50份病料進(jìn)行檢測(cè)，采用一步法擴(kuò)增對(duì)臨床病料進(jìn)行了二重PCR檢測(cè)對(duì)比，結(jié)果兩者的符合率為94%以上。該方法可以在一份樣品中同時(shí)檢測(cè)出兩種病原體，符合臨床上對(duì)多種疾病的同步診斷的要求，對(duì)于這兩種疫病的鑒別診斷和混合感染檢測(cè)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Chicken Parvovirus and Avian Reovirus

FENG Bin,XIE Zhi-xun,DEN Xian-wen,ZHANG Yan-fang,HUANG Jiao-ling,WANG Sheng,FAN Qin, XIE Zhi-qin,HUANG Li,XIE Li-ji,ZENG Ting-ting,LUO Si-si,LIU Jia-bo

(GuangxiVeterinaryResearchInstitute，GuangxiKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，Nanning,Guangxi,530001，China)

A duplex PCR assay for detecting both chicken parvovirus (ChPV) and avian reoviruses (ARV) was developed to provide technical support for effective control of ChPV and ARV.According to the conserved gene sequences of ChPV NS1 and ARV σC in GenBank,two sets of specific primers were designed.The duplex PCR for simutaneous detection of ChPV and ARV was established by optimizing the reaction conditions.The optimized PCR reaction system was 2×PCR Mix 12.5 μL,of which sense primer and anti-sense primer of ChPV and ARV was 1.0 μL each.The mixed template was 2.0 μL and added to 25.0 μL with ddH2O.The optimal reaction procedure was 95 ℃ initial denaturation for 5 min; 95 ℃ degeneration for 1 min,56.1 ℃ annealing for 1 min,72 ℃ for 1 min in 35 cycles; 72 ℃ extension for 10 min.The result indicated that the duplex PCR assay successfully amplified 204 bp for ChPV,405 bp for ARV.The sensitivity of the assay was 58 fg for ChPV and 53 fg for ARV,but it was not sensitive to other chicken pathogens,such as Newcastle disease virus,H9 subtype avian influenza virus,Marek′s disease virus,infectious bronchitis virus,infectious laryngotracheitis virus.The results detected by the duplex PCR had a 94% coincidence rate with the results detected by single PCR for the ChPV and ARV respectively.The duplex PCR assay is a quick,sensitive and specific test for detection of ChPV and ARV.

Chicken parvovirus; Avian reovirus; duplex PCR; specificity; sensitivlity

2016-05-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160512)；廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFCA118006);國(guó)家“萬(wàn)人計(jì)劃”領(lǐng)軍人材專(zhuān)項(xiàng) (2016-37)；廣西科技項(xiàng)目(15-140-31-A-1，15-140-31-B-1)；南寧市科技攻關(guān)項(xiàng)目(20152308)

奉 彬(1987-) ,女 ,廣西賀州人 ,碩士 ,主要從事禽病快速診斷技術(shù)研究。*通訊作者

S852.659.2

A

1007-5038(2016)11-0014-05