實時熒光定量PCR檢測畜禽肉制品中鴨源性成分

林彥星，張彩虹，阮周曦，劉建利，宗 卉，廖立珊，孫 潔，楊俊興，呂建強，花群義，曹琛福

(深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518045)

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實時熒光定量PCR檢測畜禽肉制品中鴨源性成分

林彥星，張彩虹，阮周曦，劉建利，宗 卉，廖立珊，孫 潔，楊俊興，呂建強，花群義，曹琛福*

(深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518045)

根據(jù)鴨mtDNA COX基因上的保守序列設計特異性引物和TaqMan探針，建立實時熒光定量PCR用于檢測畜禽肉制品中的鴨源性成分。結(jié)果表明，建立的方法特異性強，與鵝、雞、羊、牛等15種動物DNA無非特異性擴增；靈敏度高，可檢測1.0 pg/μL鴨源DNA的存在；重復性好，同DNA濃度所測得Ct值的變異系數(shù)均小于3%；應用該法對模擬混合樣品進行檢測，結(jié)果與預期相符，且常見肉類DNA的存在并不影響該法對鴨源性成分檢測的靈敏度。說明本試驗建立的鴨源性成分實時熒光定量PCR法特異、敏感、穩(wěn)定，可快速準確檢測畜禽肉制品中含有的鴨源性成分。

實時熒光定量PCR；檢測；鴨源性成分

“民以食為天，食以安為先”，食品安全是關(guān)乎人人的重大民生問題。肉制品中摻雜摻假是我國食品行業(yè)中存在的問題之一，一些不法商販或企業(yè)為獲取高額利潤，鋌而走險以廉價的鴨肉冒充羊肉、牛肉進行生產(chǎn)經(jīng)營，欺騙消費者。由于鴨肉的紋理相對于豬肉比較像牛羊肉，且在加工過程中往往會加入羊肉粉、香精等添加劑以掩蓋其造假行為，使摻假產(chǎn)品具有更大的欺騙性和隱蔽性，這種肉類摻雜摻假行為違反我國《食品安全法》的有關(guān)要求，嚴重危害了公民的生命權(quán)和健康權(quán)，嚴重擾亂了市場經(jīng)濟秩序和社會秩序。因此，有必要建立敏感高效的方法來檢測肉畜禽肉制品中的鴨源性成分。

PCR是目前動物源性成分鑒別的主流技術(shù)，因為不同物種的基因組不同，依據(jù)物種的特異序列，可以用引物經(jīng)過PCR擴增特異的產(chǎn)物來鑒別物種源性[1]。我國已經(jīng)建立了牛、羊、豬、馬、驢、兔、狗等動物源性成分的普通PCR/實時熒光定量PCR鑒定方法和標準，但還未制定實時熒光定量PCR檢測鴨源性成分的標準。與普通PCR相比，實時熒光定量PCR在封閉的體系中進行擴增和實時檢測，無需電泳就可以對結(jié)果進行分析，避免了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的污染和EB(溴化乙錠)帶來的危害，自動化程度高，檢測周期短，且擴增目的片段較小，尤其適用于經(jīng)過深加工的食品，在動物源性成分鑒別檢測中的具有廣闊的應用前景[2-10]。

線粒體DNA( mitochondrial DNA,mtDNA) 是唯一存在于細胞器中且相對獨立的基因組[11]，具有高度的物種特異性，在細胞中的拷貝數(shù)多[12]，可有效降低食品加工造成的DNA損失[13]，是近年來動物源性成分鑒定中用的較多的目標基因。本項目通過比較分析鴨與其他畜禽類mtDNA中多個編碼區(qū)(coding sequence，CDS)的同源性，結(jié)合引物和探針的設計要求，最終選用細胞色素C氧化酶III(cytochrome c oxidase subunit III,COX3)作為靶基因；目前國內(nèi)外未見應用熒光定量PCR擴增該基因片段進行鴨源性成分鑒定的報道。論文通過設計并篩選特異性引物和探針，對反應體系和反應條件進行優(yōu)化，以及特異性、靈敏性和重復性試驗等，建立了鴨源性成分實時熒光定量PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備 高通量自動化樣品處理工作站(FASTH21)，瑞士CONSUL AR公司產(chǎn)品；小型恒溫混勻儀、掌上離心機、臺式高速離心機(Centrifuge 5415 R)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；微量分光光度計Nanodrop 2000C，美國Thermo公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(7500 Fast Real-time PCR System)，美國ABI公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 血液組織細胞基因組提取試劑盒(離心柱型)、深加工食品DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Probe qPCR Mix，東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；引物與熒光探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR引物與TaqMan探針設計 根據(jù)NCBI GenBank已發(fā)表的鴨(Anas platyrhynchos)線粒體基因序列(NC-009684.1)，用Primer Express3.0及DNASTAR PrimerSelect軟件設計用于擴增鴨COX3基因部分序列的特異性引物和探針。上游引物DP1序列為5′-CTTACTCACAACCTCAGGGCTAG-3′，下游引物DP2序列為5′-TGTAGGTGTGTGGTGGCCTT-3′，探針序列DQ為5′-(FAM) CTCATCTATCCTGCTAGCCGCCG(BHQ1)-3′，擴增片段長度151 bp。并將設計的引物探針序列與鵝、雞、鴿、鵪鶉、豬、牛、馬、羊等多種常見畜禽COX3上相對應的基因片段進行比對。

1.2.2 模板DNA的提取 稱取待檢樣品200 g，使用高通量自動化樣品處理工作站對樣品進行均質(zhì)處理。取50 mg樣品均質(zhì)于1.5 mL離心管中，加入600 μL～800 μL裂解液，65℃作用30 min，期間不時振蕩混勻；12 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移上清于潔凈離心管中，加入400 μL三氯甲烷-異丙醇(24∶1)，混勻；12 000 r/min離心5 min，取上清液；加0.8倍體積預冷的異丙醇，沉淀；12 000 r/min離心5 min，棄上清液；750 mL/L乙醇洗滌1次，晾干；加入50 μL滅菌雙蒸水溶解沉淀，制成DNA溶液，保存于-20℃?zhèn)溆?。也可用基因組提取試劑盒提取DNA。

1.2.3 實時熒光定量PCR反應體系與條件 根據(jù)反應體系母液的特性及其推薦的適用于7500 Fast熒光PCR儀的體系參數(shù)，設定反應條件為95℃ 20 s；95℃ 3 s,60℃ 30 s，40個循環(huán)。反應總體積為20 μL，其中Probe qPCR Mix 10 μL，50×ROX reference dye 0.04 μL，鴨肉模板DNA 0.8 μL，采用不同的引物濃度(5 pmol～20 pmol)和探針濃度DQ(2 pmol～10 pmol)配比，最后用雙蒸水補至20 μL，通過試驗篩選出最佳的引物和探針濃度。

1.2.4 特異性試驗 分別用鵝、雞、火雞、鴿、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、驢、馬、綿羊、山羊、牛、豬、狗、魚等純?nèi)馓崛〉腄NA作為模板進行實時熒光定量PCR反應，以驗證引物與探針對于鴨源性成分檢測的特異性；以鴨肉DNA作為陽性對照，并以雙蒸水為模板設置空白對照。另外，用普通PCR方法[14]對鴨肉DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 靈敏度試驗 用微量分光光度計檢測鴨肉DNA濃度，然后以羊肉DNA做稀釋液，10×系列稀釋鴨肉DNA，進行實時熒光定量PCR反應，觀察該方法的靈敏度及羊肉成分的存在對靈敏度的影響，用羊肉DNA為模板作為陰性對照。

1.2.6 重復性試驗 批內(nèi)重復性試驗：將上述敏感性試驗中100～10-4稀釋的共5個不同濃度DNA作為模板進行實時熒光定量PCR檢測，每個濃度做3個重復；批間重復性試驗：將5個不同濃度的DNA模板在同一反應條件下進行3次獨立的實時熒光定量PCR檢測，根據(jù)Ct值的差異計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)，評估所建立檢測方法的重復性和穩(wěn)定性。

1.2.7 模擬混合樣品中鴨源性成分的檢測 在牛肉、羊肉、豬肉、鵝肉中分別按50%、20%、10%、5%、1%的比例加入鴨肉，按1.2.2所述方法提取DNA，采用本試驗建立的實時熒光定量PCR方法對20份模擬混合樣品進行檢測，并分別設置牛肉、羊肉、豬肉、鵝肉4份陰性對照和1份空白對照。

2 結(jié)果

2.1 引物探針序列比對結(jié)果

利用DNAMan軟件將設計的引物探針序列與常見畜禽COX3基因片段進行比對，發(fā)現(xiàn)上游引物、下游引物以及探針與各對照物種間分別存在4個、3個和7個以上堿基的差異(表1)，差異值介于21.21%～39.39%，

2.1 實時熒光定量PCR反應體系的優(yōu)化

通過對實時熒光定量PCR的引物、探針濃度進行優(yōu)化，最終確定20 μL反應體系中，引物DP1、DP2各1 μL(10 pmol)，探針DQ 0.5 μL(5 pmol)。反應條件為95℃ 20 s；95℃ 3 s,60℃ 30 s，40個循環(huán)。熒光PCR結(jié)果鴨肉DNA出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，空白對照無擴增。

2.2 特異性試驗結(jié)果

以鴨肉DNA作為陽性對照，以鵝、雞、火雞、鴿、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、驢、馬、綿羊、山羊、牛、豬、狗、魚肉等另外15種動物DNA為檢測模板進行引物探針的特異性試驗，結(jié)果表明，僅鴨的DNA擴增出典型的S型曲線，其他物種模板及空白對照均無閾值信號產(chǎn)生(圖1)，表明該檢測方法特異性良好。而普通PCR(SN/T 3731.5-2013)也從所提取的鴨肉DNA中擴增出約226 bp的DNA片段(圖2)，驗證了該熒光PCR的特異性。

2.3 靈敏度試驗結(jié)果

微量分光光度計測得鴨肉DNA濃度為37.1 ng/μL，以羊肉DNA為稀釋液做10×系列稀釋(100～10-6)，鴨肉DNA含量從37.1 ng/μL遞減到0.000 037 1 ng/μL；實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示100～10-5稀釋的鴨肉DNA模板Ct值分別為17.534 9、21.496、25.120 4、28.420 1、31.602 6、35.672 1。其中，10-4稀釋對應的鴨肉DNA濃度為3.71 pg/μL，擴增曲線明顯，Ct值為31.602 6，說明該方法的檢測靈敏度可達到pg級，且羊肉DNA的存在并不影響該方法對鴨源性成分檢測的靈敏度(圖3)。

表1 鴨源性成分檢測引物探針序列與其他物種相應序列的比較

1.鴨肉DNA；2～16.分別是鵝、雞、火雞、鴿、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、驢、馬、綿羊、山羊、牛、豬、狗、魚DNA；17.空白對照

1.Duck DNA; 2-16.DNA of goose,chicken,turkey,pigeon,quail,francolin,ostrich,ass,horse,sheep,goat,cattle,pig,dog,fish respectively；17.Blank control

圖1 熒光PCR特異性檢測結(jié)果

Fig.1 The results of specificity test by real-time PCR

由于10-5稀釋對應的鴨肉DNA含量極微小(0.371 pg/μL)，Ct值為35.672 1，但未出現(xiàn)典型的擴增曲線；將鴨肉DNA含量稀釋至1 pg/μL時，Ct值小于35。綜合試驗情況，將Ct值35作為該方法的檢測閾值，在實驗判定有效的情況下，如有FAM熒光檢出，且Ct值≤35.0，則判定樣品中含有鴨源性成分；如未檢測到有Ct值或Ct值>35.0，則不含鴨源性成分或每微升含量低于pg級。

M.DNA 標準 DL 2 000；1.鴨DNA PCR產(chǎn)物；2.空白對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR products of duck DNA; 2.Blank control

圖2 普通PCR擴增結(jié)果

Fig.2 The results of PCR amplification

1～7.鴨肉DNA，DNA含量分別是37.1、3.71、0.371、0.037 1、0.003 71、0.000 371、0.000 037 1 ng/μL；8.陰性對照(羊DNA)；9.空白對照

1-7.Duck DNA contents were 37.1,3.71,0.371,0.037 1,0.003 71,0.000 371,0.000 037 1 ng/μL respectively；8.Negative control (sheep DNA); 9.Blank control

圖3 實時熒光定量PCR敏感性試驗

Fig.3 Sensitivity test of real-time PCR

2.4 重復性試驗結(jié)果

取100～10-4稀釋的共5個濃度的鴨肉DNA分別做3個批內(nèi)重復試驗(圖4)和3個批間重復試驗(圖5)。將試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)0.62%～1.64%，批間變異系數(shù)(CV)0.24%～2.34%；而將批內(nèi)試驗和批間試驗加起來共6個重復中，同DNA濃度所測得Ct值變異系數(shù)(CV)0.86%～2.73%，均小于3%(表2)，說明該方法具有很好的重復性和穩(wěn)定性。

1～3.鴨肉DNA 37.1 ng/μL；4～6.鴨肉DNA 3.71 ng/μL；7～9.鴨肉DNA 0.371 ng/μL；10～12.鴨肉DNA 0.037 1 ng/μL；13～15.鴨肉DNA 0.003 71 ng/μL；16.陰性對照(羊肉DNA)；17.空白對照

1-3.Duck DNA content were 37.1 ng/μL,4-6.Duck DNA 3.71 ng/μL,7-9.Duck DNA 0.371 ng/μL,10-12.Duck DNA 0.037 1 ng/μL,13-15.Duck DNA 0.003 71 ng/μL；16.Negative control (sheep DNA); 17.Blank control

圖4 實時熒光定量PCR批內(nèi)重復試驗

Fig.4 Reproducibility of intra-assay of real-time PCR

1～5.鴨肉DNA，含量分別是37.1、3.71、0.371、0.037 1、0.003 71 ng/μL；6.陰性對照(羊肉DNA)；7.空白對照

1-5.Duck DNA contents were 37.1,3.71,0.371,0.037 1,0.003 71 ng/μL respectively；6.Negative control (sheep DNA); 7.Blank control

圖5 實時熒光定量PCR批間重復試驗

Fig.5 Reproducibility of inter-assay of real-time PCR

2.5 模擬混合樣品中鴨源性成分檢測結(jié)果

檢測結(jié)果顯示，在按50%、20%、10%、5%、1%的比例摻入鴨肉的牛肉、羊肉、豬肉、鵝肉中均獲得有效的擴增曲線，準確的檢出鴨源性成分，且隨著摻入量的減少，Ct值均相應的升高；陰性對照及空白對照均未檢出，結(jié)果與預期完全相符。

表2 5份不同DNA濃度的鴨DNA模板的批內(nèi)和批間重復性試驗

3 討論

線粒體基因組分子結(jié)構(gòu)簡單，無組織特異性，在所有組織細胞中，均含有大量的線粒體。通過檢索NCBI GenBank已發(fā)表的鴨、鵝、雞、火雞、鴿、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、驢、馬、貓、綿羊、山羊、牛、狗、兔、豬細胞色素C氧化酶Ⅲ(COX3)基因序列，可知上述大部分動物COX3基因大小為784 bp(火雞為787 bp，牛781 bp)，用軟件DNAMAN將鴨COX3基因片段分別與上述其他動物進行比較，在禽類間的一致性為80.56%～89.67%，與哺乳動物類的一致性介于70.15%～74.74%之間。本試驗根據(jù)鴨線粒體COX3基因設計多套用于擴增其特異性片段的引物和探針，擴增片段長度83 bp～165 bp，最終篩選出其中特異性最強一對引物探針，擴增片段長度為151 bp。目的片段較短，適于對畜禽肉制品中的鴨源性成分進行檢測，這是因為食品生產(chǎn)加工過程中由于加工工藝等的不同，會受到加工工藝流程等方面的影響，肉類DNA片段會變小，因此利用PCR技術(shù)進行動物源性成分鑒定時，目的片段要求盡可能較短[15]。

在實時熒光定量PCR的研究中，判定是否陽性的Ct值并沒有統(tǒng)一標準，需根據(jù)不同的樣品、目的及引物探針的特異性來綜合分析并制定檢測閾值。本試驗制定的方法將Ct值35作為該方法的陽性判定值，鴨源性成分的檢測限介于10-4～10-5之間，即摻入的鴨肉DNA含量達1 pg/uL時就可以檢出。由于本試驗制定的檢測鴨源性成分的實時熒光定量PCR靈敏度極高，畜禽肉制品中檢出含有鴨源性成分并不能簡單判定摻假，還應綜合分析，因為一方面摻假的目的是獲取更大的利潤，摻入鴨肉的比例太低則無利可圖；另一方面正常的食品生產(chǎn)加工、運輸中不同原料或產(chǎn)品間均存在著交叉污染的可能。本試驗所建立的鴨源性成分實時熒光定量PCR快速、簡便，具有很好的特異性、靈敏度和重復性，為畜禽肉制品中鴨源性成分檢測提供了更為高效、便捷的檢測方法，適用于食品安全檢測、口岸出入境動物產(chǎn)品的檢測等方面，應用范圍廣泛，適用性強。

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A Real-time Fluorescent PCR for Detection of Duck-derived Ingredients in Meat Products of Livestock and Poultry

LIN Yan-xing,ZHANG Cai-hong,RUAN Zhou-xi,LIU Jian-li,ZONG Hui,LIAO Li-shan, SUN Jie,YANG Jun-xing,LV Jian-qiang,HUA Qun-yi,CAO Chen-fu

(ShenzhenEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen，Guangdong,518045,China)

To develop a real-time fluorescent PCR assay for detection of duck-derived ingredients in meat products of livestock and poultry,the specific PCR primers andTaqman probe were designed based on the conserved sequence of cytochrome c oxidase subunit III gene of duck mitochondrial DNA.The results show that,the assay had high specificity and sensitivity,only amplifies the target gene fragment of duck and the detection limit is 1.0 pg/μL.And this assay had good reproducibility,the coefficient of variation of Ct values is less than 3%.Application of the assay to detect simulation mixed samples,the result is in line with expectations,and the presence of common meat DNA did not affect the sensitivity of detection of duck-derived ingredients.In summary,this real-time fluorescent PCR assay is specific,sensitive and stable,It can quickly and accurately detect the duck-derived ingredients in meat.

real-time fluorescent PCR; detection; duck-derived ingredients

2016-04-18

林彥星(1980-)，男，廣東潮州人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物及動物產(chǎn)品檢驗檢疫工作。*通訊作者

S851.4

A

1007-5038(2016)11-0048-06