響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉提取物的制備工藝

侯偉峰，郭 超，范云鵬，麻武仁，宋曉平

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 中獸醫(yī)藥研究所，陜西楊凌 712100)

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響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉提取物的制備工藝

侯偉峰，郭 超，范云鵬，麻武仁，宋曉平*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 中獸醫(yī)藥研究所，陜西楊凌 712100)

優(yōu)化杜仲葉提取物制備的工藝條件，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以杜仲葉提取物浸膏得率和綠原酸轉(zhuǎn)移率為評價指標，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計法優(yōu)化杜仲葉提取物制備的工藝條件。杜仲葉提取物制備的最佳工藝條件為乙醇濃度500 mL/L，液料比10∶1(mL/g)，提取溫度97℃，提取4次，每次30 min；在此最佳工藝條件下，杜仲葉提取物浸膏得率和綠原酸轉(zhuǎn)移率綜合評分均值為99.08，與預(yù)測值基本一致。響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化的杜仲葉提取物制備工藝穩(wěn)定可靠。

響應(yīng)面法；杜仲葉；綠原酸；高效液相色譜

杜仲(EucommiaulmoidesOliv)為杜仲科杜仲屬植物，傳統(tǒng)用藥中，杜仲一直以皮入藥，其性味甘溫，具有補肝腎，強筋骨，安胎的功效，主治腎虛腰痛，腰肢無力，風(fēng)濕痹痛和胎動不安[1]，但樹皮的剝離對于杜仲生長十分不利?，F(xiàn)代研究表明，杜仲葉中主要含有綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷、蘆丁及兒茶等成分，具有顯著的抗菌、增強免疫、促進生長及改善肉質(zhì)等作用[2-7]。鑒于杜仲葉的主要有效成分、藥理作用與杜仲皮基本一致，且杜仲葉廉價易得，杜仲葉代皮入藥具有重要的潛在應(yīng)用價值。本試驗以杜仲葉提取物得率及綠原酸轉(zhuǎn)移率為評價指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉提取物制備的最佳工藝條件，旨在為杜仲葉的進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 綠原酸對照品(含量96.2%，批號110753-201415)，購自中國食品藥品檢定研究院；杜仲葉(秦仲1號品種)，2015年8月10日采自陜西省略陽縣金家河鎮(zhèn)寒峰村萬畝杜仲基地。

1.1.2 主要儀器 ChromasterΜltra Rs超高效液相色譜儀(diode array detector 6430型二極管陣列檢測器，binary pump)，日本HITACHI公司產(chǎn)品；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；BSA224S-CW型電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 甲醇(色譜純，批號20140410)，乙腈(色譜純，批號20141106)，磷酸(色譜純，批號20130824)，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(分析純，批號2015061501)，購自成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸含量測定方法的建立

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Welchrom C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長：327 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，固定相：C18柱，流動相：乙腈-0.4%磷酸(13∶87，V/V)。

1.2.1.2 綠原酸對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品10.5 mg加500 mL/L甲醇定容于10 mL棕色量瓶中，得1 050 μg/mL綠原酸標準溶液，再分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于1 mL棕色容量瓶中，加500 mL/L甲醇定容至刻度，分別得到105、210、315、420、525、630 μg/mL不同濃度梯度的對照品溶液[1]。

1.2.1.3 標準曲線的繪制 將1.2.1.2中不同濃度的綠原酸對照品溶液過0.22 μm濾器過濾，照1.2.1.1色譜條件下操作，高效液相色譜儀注入10 μL，測定峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.1.4 方法學(xué)驗證試驗 對綠原酸含量測定的方法，進行加樣回收率、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗，計算加樣回收率及相對標準偏差(RSD)[8]。

1.2.2 杜仲葉提取物制備的工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗

①單因素試驗設(shè)計。準確稱量杜仲葉粉 20 g，置于 500 mL圓底燒瓶中，以浸膏得率為評價指標，分別固定液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)中的4個因素，改變另1個因素，考察單因素對杜仲葉浸膏得率的影響[9]。

②浸膏得率的計算。杜仲葉提取液，減壓濃縮至小體積，置于蒸發(fā)皿內(nèi)，50℃水浴加熱蒸除溶劑至恒重得浸膏，計算浸膏得率。

1.2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

①響應(yīng)面法試驗設(shè)計。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以液料比(A)、提取溫度(B)、提取次數(shù)(C)等為考察影響因素，以綠原酸轉(zhuǎn)移率(權(quán)重系數(shù)0.7)和浸膏得率(權(quán)重系數(shù)0.3)為評價指標[10]，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，應(yīng)用Design Expert 8.0設(shè)計3因素3水平優(yōu)化提取工藝(表1)，并進行回歸模型方差分析和驗證試驗。

表1 杜仲葉提取物制備工藝響應(yīng)面法試驗的因素和水平

②轉(zhuǎn)移率測定及計算方法。浸膏中綠原酸含量的測定： 稱取浸膏0.37 g置于具塞錐形瓶中，加入500 mL/L甲醇25 mL，超聲波助溶，過濾，取續(xù)濾液，過0.22 μm濾器，按1.2.1中的方法測定綠原酸含量。杜仲葉中綠原酸含量的測定： 稱取杜仲葉粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入500 mL/L甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用500 mL/L甲醇補足減失的重量，提取3次，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm濾器[1]，按1.2.1中的方法測定綠原酸含量，并計算綠原酸轉(zhuǎn)移率：

③制備工藝驗證試驗。按照響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳提取工藝做3次平行試驗，與理論值相比較，計算相對誤差。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸含量測定的標準曲線

綠原酸含量測定的回歸方程為y=2 887 462x-148 005，r=0.999 8，在105 μg/mL～630 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積值有良好的線性關(guān)系(圖1)。精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗RSD均小于2.00%；平均回收率為102.17%(浸膏RSD=1.24%)和103.62%(杜仲葉RSD=1.74%)；說明該方法的準確度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

圖1 綠原酸對照品標準曲線

2.2 杜仲葉提取物制備的工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素試驗結(jié)果 液料比、提取溫度、提取次數(shù)對浸膏得率有較明顯影響，因此設(shè)定提取時間0.5 h，乙醇濃度50%,對料液比、溫度、提取次數(shù)等進行響應(yīng)面法優(yōu)化篩選試驗。

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝試驗結(jié)果 杜仲葉提取物制備響應(yīng)面法試驗結(jié)果見表2。浸膏得率及綠原酸轉(zhuǎn)移率加權(quán)綜合評分Y對液料比A、提取溫度B和提取次數(shù)C的二次多項回歸方程y=87.10+1.55A+4.56B+1.95C-0.011AB+3.03AC-0.70BC+3.83A2+1.64B2-3.07C2。模型的P<0.01，說明該回歸模型達到極顯著水平，失擬誤差P>0.05，說明模型對試驗擬合較好，可用此模型對杜仲葉提取浸膏得率和綠原酸轉(zhuǎn)移率進行分析和預(yù)測。方差分析表明，B對響應(yīng)值影響極顯著；交互項AC達到顯著水平，說明液料比和提取次數(shù)存在交互作用；A2和C2對響應(yīng)值影響顯著，說明液料比和提取次數(shù)對結(jié)果的影響不是簡單的線性關(guān)系。試驗因素對杜仲葉提取浸膏得率和綠原酸轉(zhuǎn)移率的影響順序為，提取溫度>提取次數(shù)>液料比(表3)。

由Design Expert預(yù)測的最佳條件為：液料比10∶1，提取溫度100℃，次數(shù)4.7次。根據(jù)實際情況及可操作性，調(diào)整最佳提取工藝條件為液料比10∶1，提取溫度97℃(水浴設(shè)定溫度100℃，實測溫度為97℃)，提取次數(shù)4次。按修正的最佳條件進行3次驗證試驗，綜合評分分別為97.80、99.38和100.06，均值為99.08，與預(yù)測值(100.16)基本一致(相對誤差1.08%<5%)。說明相應(yīng)模型可以較好反映浸膏得率和綠原酸轉(zhuǎn)移率的提取條件。

表2 杜仲葉提取物制備響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果

注：括號內(nèi)為對應(yīng)的編碼值，綜合評分=綠原酸轉(zhuǎn)移率/綠原酸最大轉(zhuǎn)移率×70%+浸膏得率/浸膏最大得率×30%；杜仲葉中綠原酸含量測定均值為1.41%。

Note:Brackets for the corresponding encoded value,the composite score = transfer rate of chlorogenic acid / the maximum transfer rate of chlorogenic acid × 70% + extract yield / the maximum extract yield × 30%; the mean content of chlorogenic acid in EF is 1.41%.

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析

注：“**” 表示差異極顯著，P<0.01；“*” 表示差異顯著，P<0.05。

Note:"**" represents extremely significant difference,P<0.01;"*" represents significant difference,P<0.05.

3 討論

3.1 綠原酸含量測定方法的建立

杜仲葉中綠原酸含量測定方法主要有紫外分光光度法、紙層析-紫外分光光度法和高效液相色譜法。研究表明，紫外分光光度法因雜質(zhì)干擾較大，重復(fù)性差，紙層析-紫外分光光度法可去除雜質(zhì)干擾，但耗時較長，準確性差，高效液相色譜法快速、準確、方便，精密度、穩(wěn)定性較高,重復(fù)性好[11-14]。本試驗曾采用紫外分光光度法測量杜仲葉中綠原酸的含量，但在327 nm附近處峰形不明顯，干擾物較多；采用高效液相色譜法測定時，327 nm處峰形明顯規(guī)整，杜仲葉中綠原酸含量1.41%，高于紫外分光光度法所測含量，且理論塔板數(shù)大于8 000，與相鄰峰分離度大于3。

3.2 杜仲葉提取物制備的最佳工藝條件

響應(yīng)面法試驗次數(shù)少、周期短、所求回歸方程精度高，試驗數(shù)據(jù)更加接近實際值，在中獸藥提取工藝優(yōu)化中已逐漸取代正交試驗法[15-17]。本試驗先經(jīng)單因素試驗，確定了影響杜仲葉提取物制備的主要因素，進一步應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了最佳工藝條件。方差分析結(jié)果表明，提取溫度對杜仲葉提取物得率及綠原酸轉(zhuǎn)移率有極顯著影響，液料比與提取次數(shù)存在交互作用，且液料比及提取次數(shù)的影響不是簡單的線性關(guān)系。按乙醇濃度50%，液料比10∶1，提取溫度97℃，提取4次，每次提取0.5 h的最佳工藝條件，杜仲葉提取物得率及綠原酸轉(zhuǎn)移率綜合評分99.08，與預(yù)測值基本一致，為杜仲葉提取物制備的最佳工藝條件。

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Optimization of Preparation Technics of Extract from Eucommia Folia Using Response Surface Methodology

HOU Wei-feng,GUO Chao,FAN Yun-peng,MA Wu-ren,SONG Xiao-ping

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,InstituteofTraditionalChineseVeterinaryMedicine,Yangling,Shaanxi,712100,China)

The aim of this study was to optimize the extraction technology of Eucommia folia (EF).On the basis of single factor experiment,to be used the extract yield of EF and transfer rate of chlorogenic acid composite score as the indexes of evaluation,the extraction technology of EF was optimized by using Box-Behnken central composite design method.The optimal extraction technology of EF was as follows:ethanol concentration,liquid to solid ratio,extraction temperature,extraction times and extraction time were 50%,10∶1(mL/g),97℃，4 times and 30 min,respectively.Under the condition,the mean composite socre was 99.08 ,which is almost the same as the predictive value.The extraction technology to optimize the EF by response surface method (RSM) is stable and reliable.

response surface methodology; Eucommia folium; chlorogenic acid; high performance liquid chromatography

2016-04-19

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303040)；西北農(nóng)林科技大學(xué)科技發(fā)展基金項目(A2990215141)

候偉峰(1989-)，男，山西運城人，碩士研究生，主要從事中獸藥研究。*通訊作者

S859.3

A

1007-5038(2016)11-0074-04