劉 瑤，陳俊海，肖桂龍，孟 燦，曾 蓉，武 波，蔣承建,3*

>(1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點實驗室，山東 青島 266061)

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海洋Pseudomonasaeruginosasp. DES-3的鑒定以及基因ap02對其產(chǎn)蛋白酶的影響研究*

劉 瑤1,2，陳俊海1,2，肖桂龍1,2，孟 燦1,2，曾 蓉1,2，武 波1,2，蔣承建1,2,3*

>(1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點實驗室，山東 青島 266061)

海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，其多樣獨特的生態(tài)環(huán)境造就了其有別于其他環(huán)境的微生物資源。本研究利用蛋白酶的活性篩選策略，從遼寧省營口市某海洋淤泥中分離得到一株產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)勢菌株DES-3。通過微生物形態(tài)學(xué)特征、生理生化性質(zhì)和16S rDNA基因鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系的分析，將該菌株鑒定為銅綠假單胞菌屬，命名為Pseudomonasaeruginosasp. DES-3。其胞外蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為55 ℃和9.0。將來自于堿性污染土壤宏基因組文庫的編碼堿性蛋白酶基因ap02與廣宿主表達(dá)載體pBBR1MCS-5連接，轉(zhuǎn)化至野生型菌株P(guān).aeruginosasp. DES-3細(xì)胞中，成功構(gòu)建了基因工程菌株P(guān).aeruginosasp. DES-3/pBBR1MCS-5-ap02。基因工程菌株的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，較野生型菌株提高了5 ℃。本研究構(gòu)建基因工程菌株的策略可為菌株的改造和相應(yīng)工業(yè)應(yīng)用提供一定的技術(shù)參考。

海洋微生物；堿性蛋白酶；Pseudomonasaeruginosasp.；基因工程菌株

海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，體積在整個生物圈超過90%，面積占地球表面積的71%，其包含的微生物占全球初級生產(chǎn)者的50%左右[1]。從2000年開始，科學(xué)家進(jìn)行了海洋生物普查(Census of Marine Life, CoML)，旨在評估和解釋海洋生物多樣性、分布和豐富程度的國際性研究。報告指出，海洋微生物包括細(xì)菌域、古菌域、真核生物和病毒在內(nèi)的多個類群，初步估計有2億～10億個物種[2]。

堿性蛋白酶廣泛存在于細(xì)菌、霉菌和放線菌中，可用于洗滌、紡織、食品、醫(yī)藥、環(huán)保和生命科學(xué)等領(lǐng)域，其中洗滌劑行業(yè)的應(yīng)用最為廣泛。從海洋環(huán)境中篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株已成為國內(nèi)外研究熱點。1960年，Dane首次從地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis中分離得到堿性蛋白酶，直至現(xiàn)在也仍是產(chǎn)堿性蛋白酶最合適的微生物之一[3]。1972年，Kato等[4]從海洋嗜冷桿菌Psychrobacter中分離到一個新型堿性蛋白酶，至此大量堿性蛋白酶被陸續(xù)從海洋微生物中獲得。1995年，Ogino等[5]篩選到產(chǎn)堿性蛋白酶且耐有機溶劑的銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaLST-03。1998年，作為清潔劑添加劑的堿性蛋白酶是從與海洋中的船蛆共生的細(xì)菌中分離獲得的[6]。2009年，Haddar等[7]從海水中得到菌株BacillusmojavensisA21，純化的兩種堿性蛋白酶BM1和BM2鑒定為絲氨酸蛋白酶類，在非離子表面活性劑中有很好的穩(wěn)定性，與商業(yè)的液體或固體清潔劑能很好的相容。2014年，Anjali等[8]從印度海岸分離出36株產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌，其中編號P15的菌株鑒定為新種Bacillustequilensis，其產(chǎn)生的堿性蛋白酶在分配系數(shù)從-0.76～8.8的有機溶劑中均有很好的耐受性，而且能有效去除面料上的血跡、動物皮毛和攝影膠片中的明膠。

本研究對遼寧省營口市某海洋淤泥進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶的菌株分離篩選，通過微生物形態(tài)學(xué)特征、生理生化性質(zhì)和16S rDNA基因鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系等分析，完成了菌株的分子生物學(xué)鑒定。將來自于宏基因組文庫的堿性蛋白酶基因ap02與廣宿主表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化至野生型菌株P(guān).aeruginosasp. DES-3中，成功構(gòu)建了基因工程菌株P(guān).aeruginosasp. DES-3/pBBR1MCS-5-ap02。本研究可為野生型的菌株改造和工業(yè)應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 菌株的來源

表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)pLysS和表達(dá)載體pET-32a(+)、pMP2444、pBBR1MCS-5均為廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院資源與環(huán)境微生物課題組保存。

1.2 環(huán)境樣品

本課題實驗采用的環(huán)境樣品遼寧營口市某海洋淤泥(122°09′30″E，40°21′39″N)，常溫采集，環(huán)境pH為弱堿性。

1.3 培養(yǎng)基

菌株活化和發(fā)酵采用LB培養(yǎng)基[9]；產(chǎn)蛋白酶的菌株篩選采用LA固體培養(yǎng)基添加2%的脫脂牛奶。

1.4 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

稱取適量的環(huán)境樣品制備懸浮液，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。梯度稀釋后，根據(jù)蛋白酶的活性篩選策略，篩選優(yōu)勢菌株。

1.5 堿性蛋白酶活力的測定

利用蛋白酶制劑[10]中的福林酚法測定蛋白酶活力，參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.6 掃描電鏡

選取固體培養(yǎng)基上的單菌落，經(jīng)菌體收集、固定和臨界點干燥以及離子濺射金等一系列預(yù)處理，然后在掃描電子顯微鏡下鏡檢。具體操作參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.7 分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rDNA基因鑒定中的DNA提取和PCR擴增參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。將PCR產(chǎn)物送至華大基因有限公司測序，對測序后的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，用軟件MEGA 6.0分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1.8 基因ap02對菌株DES-3的產(chǎn)酶特征影響的測定

編碼堿性蛋白酶的基因ap02來自于堿性污染土壤宏基因組文庫[14]。將基因ap02與表達(dá)載體pMP2444、pBBR1MCS-5用BamH Ι和EcoR Ι雙酶切，純化后用T4連接酶在16 ℃過夜連接，然后用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至以0.3 mol/L蔗糖溶液為電轉(zhuǎn)化介質(zhì)的野生菌株DES-3感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建基因工程菌株。將工程菌和野生菌在30 ℃發(fā)酵30 h，將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，分別在不同溫度(50，55，60，65以及70 ℃)和pH=9.0的條件下，測定蛋白酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選結(jié)果

基于蛋白酶菌株的活性篩選策略，經(jīng)分離純化和活性檢測，得到6株產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)勢菌株，對6株菌株進(jìn)行產(chǎn)水解圈時間的統(tǒng)計，并進(jìn)行了粗酶活力的測定，平行實驗3次結(jié)果如表1所示。分析數(shù)據(jù)顯示菌株C1在培養(yǎng)3 h后就產(chǎn)生了清晰的水解圈，相同條件下，發(fā)酵液酶活力最高。選擇菌株C1作為目標(biāo)菌株，命名為DES-3。

表1 6株活性菌株的D/d值和發(fā)酵液酶活Table 1 The D/d value and protease activity of the six primary strains

2.2 菌株DES-3的生理生化特征

挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，革蘭氏染色呈陰性。掃描電鏡下(圖1)，菌株DES-3為細(xì)長桿菌，長短不一，成對或成短鏈狀排列，菌株一端有鞭毛，運動，無芽孢，無莢膜。在肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 h產(chǎn)生粉橙色的半透明圓形菌落。V-P實驗和甲基紅實驗均為陰性，能產(chǎn)生膿青素，不能利用檸檬酸鹽。

圖1 菌株DES-3的掃描電鏡圖Fig.1 The morphology of DES-3 in the scanning electron microscope

2.3 活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用細(xì)菌通用引物27F/1492R對菌株DES-3的16S rDNA基因進(jìn)行擴增，測序獲得的16S rDNA基因序列約1.5 kb，在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，與菌株P(guān)seudomonasaeruginosaPAO1(NR_074 828.1)的一致性較高，為99%，用軟件MEGA 6.0以鄰位相接算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析顯示，菌株DES-3與銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa的親緣關(guān)系最接近，其進(jìn)化關(guān)系趨于一致，初步將菌株DES-3鑒定為銅綠假單胞菌屬，菌株被命名為P.aeruginosasp. DES-3。

圖2 菌株P(guān). aeruginosa sp. DES-3的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析Fig.2 The phylogenetic analysis of P. aeruginosa sp. DES-3

2.4 菌株DES-3蛋白酶活力測定

2.4.1 最適溫度的測定

以1%的比例將菌株DES-3轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)30 h，離心取上清，稀釋一定倍數(shù)后測定蛋白酶活力。實驗中以pH 7.5的磷酸緩沖液作為反應(yīng)緩沖液，設(shè)定梯度溫度，測定不同溫度下的酶活，將測得的最高酶活力設(shè)為100%，計算其他溫度下的相對酶活。由圖3可知，菌株DES-3所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃。

圖3 P. aeruginosa sp. DES-3 蛋白酶的最適溫度Fig.3 The optimal temperature of protease from P. aeruginosa sp. DES-3

2.4.2 最適pH的測定

取處理好的發(fā)酵上清液，設(shè)定反應(yīng)溫度為55 ℃，在不同pH值的緩沖液體系中測定酶活力。由圖4可知，該蛋白酶的最適反應(yīng)為pH=9.0，在pH 7.0～10.0的范圍內(nèi)，相對酶活均在80%以上，推測該蛋白酶為堿性蛋白酶。

圖4 P. aeruginosa sp. DES-3蛋白酶的最適pHFig.4 The optimal pH of protease from P. aeruginosa sp. DES-3

2.5 堿性蛋白酶基因ap02的分析

堿性蛋白酶基因ap02來自于課題組前期所構(gòu)建的堿性污染宏基因組文庫[14]。該基因全長1 146 bp，編碼381個氨基酸，蛋白分子量為39.46 kDa，等電點為8.91。Blast結(jié)果顯示，在氨基酸水平上與Salinibacillusaidingensis(登錄號為WP_044 156 525.1)的peptidase序列一致性為100%。對其功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，推測該蛋白ap02可能屬于肽酶S8超家族或SB宗，為絲氨酸蛋白酶類。對ap02蛋白的蛋白酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應(yīng)溫度為65 ℃，最適作用pH=9.0。

2.6 基因ap02對菌株DES-3產(chǎn)酶活性的影響

將基因ap02與廣宿主表達(dá)載體pMP2444和pBBR1MCS-5連接，轉(zhuǎn)化至原始菌株P(guān).aeruginosasp. DES-3電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建基因工程菌株。實驗中在最適反應(yīng)pH=9.0的條件下，分別將野生菌與工程菌的發(fā)酵液稀釋相同倍數(shù)，在不同溫度50,55,60,65和70 ℃條件下，進(jìn)行酶活力檢測，以測得的最高酶活力為100%。

由圖5可知，野生型菌株DES-3的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，工程菌株P(guān).aeruginosasp. DES-3/pMP2444-ap02的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，工程菌株P(guān).aeruginosasp. DES-3/pBBR1MCS-5-ap02的最適溫度增加至60 ℃，較野生型菌株提高了5 ℃。

圖5 溫度對原始菌株和基因工程菌株酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the enzyme activity of the original and genetically engineered strains

3 結(jié) 論

蛋白酶的經(jīng)濟價值較高，但蛋白酶的最適反應(yīng)條件(溫度和pH等)與實際應(yīng)用條件存在差別，導(dǎo)致酶的催化效率降低。本研究嘗試從遼寧海洋淤泥中篩選得到一株高產(chǎn)蛋白酶菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定屬于銅綠假單胞菌屬，暫命名為P.aeruginosasp. DES-3，測定其產(chǎn)生的蛋白酶最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適反應(yīng)pH=9.0。

目前，蛋白酶的研究已達(dá)到分子研究水平，利用基因工程手段改造蛋白酶產(chǎn)生菌，篩選高產(chǎn)酶活和具有極端酶學(xué)性質(zhì)的菌株是未來的發(fā)展趨勢[15]。Tao課題組利用反向PCR擴增得到能高效結(jié)合重金屬離子的PCs基因，將其轉(zhuǎn)化至Pseudomonasputida感受態(tài)細(xì)胞中，重組菌KT2440-SpPCS表現(xiàn)出對金屬離子Cd和Ag以及Hg具有較好的耐受性[16]。邱吉國將nox基因與廣宿主表達(dá)載體連接，導(dǎo)入到PseudomonasputidaKT2444中，重組菌獲得了尼古丁降解活性[17]。受此啟發(fā)，將ap02基因與廣宿主表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化至P.aeruginosasp. DES-3感受態(tài)細(xì)胞中，將原始菌與工程菌在不同溫度下反應(yīng)。結(jié)果表明，重組菌株P(guān).aeruginosasp. DES-3/pBBR1MCS-5-ap02的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，較野生型菌株提高了5 ℃。

本研究探索了海洋淤泥中的產(chǎn)蛋白酶微生物資源，嘗試將ap02基因?qū)氲揭吧途曛?，成功?gòu)建了兩株基因工程菌株，工程菌P.aeruginosasp. DES-3/pBBR1MCS-5-ap02較野生型菌株的最適溫度提高了5 ℃。本研究為蛋白酶基因工程菌株的改造和工業(yè)應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)參考和技術(shù)支持。

致謝：感謝廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供完善的技術(shù)平臺，感謝蔣承建教授對本文實驗的悉心指導(dǎo)和技術(shù)支持，感謝資源與環(huán)境微生物課題組全體成員的幫助與合作。

[1] LAURO F, MCDOUGALD D, THOMAS T, et al. The genomic basis of trophic strategy in marine bacteria[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2009, 106(37): 15527-15533.

[2] JACK A G, CHRISTOPHER L D. Microbial metagenomics: beyond the genome[J].Annual Review of Marine Science, 2011, 3: 347-371.

[3] CHEN Z, KIM S K. Research and application of marine microbial enzymes: status and prospects[J].Marine Drugs, 2010, 8(6): 1920-1934.

[4] ZHANG L X, AN R, WANG J P, et al. Exploring novel bioactive compounds from marine microbes[J].Current Opinion in Microbiology, 2005, 8(3): 276-281.

[5] OGINO H, MIYAMOTO K, ISHIKAWA H. Organic-solvent-tolerant bacterium, which secretes organic-solvent-stable lipolytic enzyme[J].Applied and Environmental Microbiology, 1995, 60(10): 3884-3886.

[6] GREENE R V, GRIFIN H L, COTTAL M A. Utility of alkaline protease from marine shipworm bacterium in industrial cleansing applications[J].Biotechnology Letters, 1996, 18(7): 759-764.

[7] HADDAR A, AGREBI R, BOUGATEF A, et al. Two detergent stable alkaline serine-proteases from Bacillus mojavensis A21: purification, characterization and potential application as a laundry detergent additive[J].Bioresource Technology, 2009, 100(13): 3366-3373.

[8] ANJALI B, VISHAL C, HARESH K, et al. Production and characterization of a solvent-tolerant protease from a novel marine isolateBacillustequilensisP15[J].Annals of Microbiology, 2014, 64(1): 343-354.

[9] SAMBROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd)[M].New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[10] Protease preparations:GB/T 723527-2009[S].Beijing: Standards Press of China.蛋白酶制劑法：GB/T 723527-2009[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[11] ZHANG S Z. Enzyme industry[M].Beijing: Science Press,1984. 張樹政. 酶制劑工業(yè)[M].北京: 科學(xué)出版社, 1984.

[12] XIE J Y, DONG G J, LIU Z Y. Microbial sample preparation method of the scanning electron microscopy[J].Journal of Chinses Electron Microscopy Society, 2005, 24(4): 440. 謝家儀, 董光軍, 劉振英. 掃描電鏡的微生物樣品制備方法[J].電子顯微學(xué)報, 2005, 24(4): 440.

[13] WEISBERG W G, BARNS S M, PELLETIER D A, et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].Journal of Bacteriology, 1991, 173(2): 697-703.

[14] JIANG C J, LI S X, LUO F F, et al. Biochemical characterization of two novel β-glucosidase genes by metagenome expression cloning[J].Bioresource Technology, 2011, 102(3): 3272-3278.

[15] DENG J Y. Research progress in microbial alkaline protease[J].Modern Food Science and Technology, 2008, 24(3): 293-296. 鄧菊云. 微生物堿性蛋白酶研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(3): 293-296.

[16] YONG X, CHEN Y, LIU W, et al. Enhanced cadmium resistance and accumulation in Pseudomonas putida KT2440 expressing the phytochelatin synthase gene of Schizosaccharomyces pombe[J].Letters in Applied Microbiology, 2013, 58(3): 255-261.

[17] QIU J G. The molecular catabolic mechanism of nicotine byPseudomonassp.HZN6[D].Hangzhou: Zhejiang University, 2014. 邱吉國. 假單胞菌降解尼古丁的分子機制研究[D].杭州: 浙江大學(xué), 2014.

Received: December 4, 2015

Identification of aPseudomonasaeruginosasp. DES-3 From Marine and the Effect of Protease-producing by a Gene ofap02

LIU Yao1,2, CHEN Jun-hai1,2, XIAO Gui-long1,2, MENG Can1,2, ZENG Rong1,2, WU Bo1,2, JIANG Cheng-jian1,2,3

(1.StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-bioresources, Nanning 530004, China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,GuangxiUniversity, Nanning 530004, China; 3.TheKeyLabofMarineBioactiveSubstanceandModernAnalyticalTechnique,SOA, Qingdao 266061, China)

Ocean is the largest ecosystem on the earth, and the microbial resources in the marine environment are significantly different from the others natural eco-systems. In this study, a protease-producing strain DES-3 was obtained by using functional screening strategy from the marine sludge in Yingkou city, Liaoning Province of China. The DES-3 strain was identified as the genus ofPseudomonasaeruginosaand named asPseudomonasaeruginosasp. DES-3 based on the results of microbial morphological characterization, physiological and biochemical properties, and 16S rDNA gene identification and phylogenetic tree analysis. The optimal temperature and pH of the purified protease were 55 ℃ and 9.0, respectively. Furthermore, anap02 gene encoding alkaline protease identified from an alkaline polluted soil metagenomics library, was ligated into a widely host expression vector of pBBR1MCS-5 and transferred into the competition cells ofPseudomonasaeruginosasp. DES-3. Finally, a genetically engineered strain of theP.aeruginosasp. DES-3/pBBR1MCS-5-ap02 was constructed. The enzymatic data indicated that the optimal temperature and pH of theP.aeruginosasp. DES-3/pBBR1MCS-5-ap02 were 60 ℃and 9.0, respectively, the final optimal temperature increased 5 ℃ than that of the originalP.aeruginosasp. DES-3. This study showed a technical reference for the genetic modification of the wild type strain and also provided the potential industrial application.

marine microorganisms; alkaline protease;Pseudomonasaeruginosasp.; genetically engineered strain

2015-12-04

廣西自然科學(xué)基金項目——一個新的胰蛋白酶基因的分子結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能研究(2015GXNSFAA139050)；國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點實驗室項目——海洋胰蛋白酶新基因的分子結(jié)構(gòu)特征和功能研究(MBSMAT-2015-02)

劉 瑤(1990-)，女，湖北天門人， 碩士，主要從事環(huán)境資源與微生物方面研究.E-mail:lyao@6677@126.com

*通訊作者：蔣承建(1980-)，男，廣西桂林人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事新酶的結(jié)構(gòu)和功能方面研究.E-mail:jiangcj0520@gmail.com

Q344+.3

A

1671-6647(2016)04-0553-07

10.3969/j.issn.1671-6647.2016.04.011