不同培養(yǎng)基和儲(chǔ)存條件對(duì)家蠅幼蟲分泌物中溶菌酶含量的影響

王建宇，國 果，楊蔚錦，陶如玉，陳 亞

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)卓越醫(yī)師班，貴州貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550004)

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不同培養(yǎng)基和儲(chǔ)存條件對(duì)家蠅幼蟲分泌物中溶菌酶含量的影響

王建宇1，國 果2*，楊蔚錦2，陶如玉2，陳 亞2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)卓越醫(yī)師班，貴州貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550004)

[目的] 了解不同培養(yǎng)基和儲(chǔ)存條件對(duì)家蠅幼蟲分泌物中溶菌酶含量的影響。 [方法] 分別以豬糞和雞糞為培養(yǎng)基飼養(yǎng)家蠅幼蟲，分別為豬糞處理組和雞糞處理組，用麥麩飼養(yǎng)幼蟲為正常對(duì)照組，麥麩中添加大腸桿菌菌液飼養(yǎng)幼蟲為誘導(dǎo)對(duì)照組，分別提取各組2齡和3齡家蠅幼蟲的分泌物，使用試劑盒檢測(cè)分泌物中溶菌酶含量；分別提取正常對(duì)照組和誘導(dǎo)對(duì)照組中3齡幼蟲的分泌物，測(cè)定在室溫、4 ℃和-20 ℃下不同時(shí)間溶菌酶含量的變化。 [結(jié)果] 豬糞處理組、雞糞處理組、正常對(duì)照組和誘導(dǎo)對(duì)照組中分離的3齡幼蟲分泌物中溶菌酶的平均含量分別為2.462、2.782、1.019、2.117 μg/mL，均顯著高于2齡幼蟲(P<0.05)。豬糞處理組、雞糞處理組和誘導(dǎo)對(duì)照組2齡和3齡幼蟲分泌物的溶菌酶含量均高于正常對(duì)照組(P<0.05)。在室溫下，正常對(duì)照組和誘導(dǎo)對(duì)照組中溶菌酶的活性均僅能維持14 d左右；在-20 ℃下，溶菌酶的活性均可維持70 d左右；在4 ℃下，正常對(duì)照組和誘導(dǎo)對(duì)照組中溶菌酶活性的維持時(shí)間介于室溫和-20 ℃之間，且2組間溶菌酶含量隨時(shí)間的變化規(guī)律有一定差異。 [結(jié)論] 3齡蠅蛆分泌物中溶菌酶含量高于2齡蠅蛆；雞糞培養(yǎng)基和豬糞培養(yǎng)基能顯著增強(qiáng)家蠅2齡和3齡幼蟲分泌物中溶菌酶含量；在-20 ℃儲(chǔ)存條件下，家蠅溶菌酶可在較長時(shí)間內(nèi)保持較高的活性。

家蠅；溶菌酶；豬糞；雞糞

家蠅幼蟲又稱為五谷蟲，中藥五谷蟲即俗稱的蛆[1]，為麗蠅科(Calliphoridae)昆蟲大頭蠅(ChrysomyiamegacephalaFab.)或其他近緣昆蟲的幼蟲[2]。家蠅，又名大頭蠅、紅點(diǎn)蠅、紅頭蠅、羅仙子、水仙子等?！侗静菥V目》蟲目第40卷指出：“凡疔瘡、臁爛可用家蠅研末，香油調(diào)而外敷。鮮者更妙，取咸寒解毒，蠕動(dòng)攻散也”。醫(yī)學(xué)上認(rèn)為，作為傳統(tǒng)中藥材的五谷蟲外敷有治療臁瘡的作用。

溶菌酶(Lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(Muramidase)或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一種堿性蛋白質(zhì)[3]。溶菌酶分為3種類型：c 型，主要代表是雞蛋清溶菌酶(Chicken egg-white lysozyme，cL)；g 型，主要代表是鵝蛋清溶菌酶(Goose egg-white lysozyme，gL)；噬菌體溶菌酶型[4]。溶菌酶在機(jī)體先天免疫中發(fā)揮重要作用，是一種非特異性免疫因子，可以通過其活性中心破壞細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4 糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物逸出，從而使細(xì)菌溶解[5]。溶菌酶作為一種無毒副作用的天然抗菌蛋白，還可用于水產(chǎn)品和肉制品等食品的防腐保鮮，特別是可作為嬰兒食品和配方奶粉良好的添加劑[6]。

家蠅及其幼蟲主要生長在腐物、糞便和垃圾等含有大量細(xì)菌的惡劣環(huán)境中，其體表帶有許多病原菌，能傳播多種疾病，但其自身卻不受這些病原菌的影響，更不會(huì)因?yàn)楦腥静≡鸺蚁壍拇笈劳?，說明家蠅對(duì)病原微生物有更強(qiáng)大的免疫力[7]。筆者所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠅幼蟲分泌物有抗大腸埃希菌的功效，而且此抗菌物質(zhì)不需任何其他的誘導(dǎo)便可產(chǎn)生[8]。從該分泌物中分離并純化到具有廣譜抗菌功能的抗菌活性蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性研究和體內(nèi)免疫活性的初步研究[9]，通過肽指紋圖譜鑒定發(fā)現(xiàn)幼蟲體外分泌物中的抗菌活性物質(zhì)之一是溶菌酶[10]。研究表明，家蠅溶菌酶主要屬于C型溶菌酶[11]，是家蠅免疫防御系統(tǒng)中的一員，也是一種重要的消化酶[12]。

豬糞和雞糞富含優(yōu)良的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，是家蠅幼蟲生長發(fā)育的優(yōu)良培養(yǎng)基[13]。研究表明，對(duì)家蠅進(jìn)行集約化飼養(yǎng)，利用其生態(tài)功能集中轉(zhuǎn)化畜禽糞便等有機(jī)廢物，能夠?qū)⒂袡C(jī)廢物快速熟化，轉(zhuǎn)化為生物有機(jī)肥，降低糞便等培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)含量[14]。然而，目前關(guān)于家蠅幼蟲在不同培養(yǎng)基中生長分泌的溶菌酶活性差異的報(bào)道較少。筆者研究了經(jīng)過豬糞和雞糞培養(yǎng)后家蠅幼蟲體外分泌物中溶菌酶含量的變化，以及不同儲(chǔ)存條件對(duì)溶菌酶活性的影響，旨在為家蠅溶菌酶的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。家蠅(Muscadomestica)由貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)傳代。成蟲以奶粉和白糖為飼料。飼養(yǎng)溫度為(25±1)℃，相對(duì)濕度為50%～60%，光照時(shí)間為12 h。成蟲產(chǎn)卵時(shí)，用飼料接卵。大腸埃希菌(Escherichiacoli) ATCC10503，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。新鮮豬糞和雞糞均取自貴州大學(xué)飼養(yǎng)場(chǎng)。

1.1.2 儀器與試劑。Milli-Q超純水儀(法國millipore公司)、5415R冷凍干燥離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、冷凍干燥系統(tǒng)(丹麥Heto-Holten公司)、μ-Quant掃描酶標(biāo)分光光度儀(美國Bio-Tek公司)；溶菌酶檢測(cè)試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)料預(yù)處理。取新鮮的豬糞和雞糞，使其相對(duì)濕度約為85%。在飼養(yǎng)糞便中加入20%(質(zhì)量比)的麥麩，發(fā)酵10 h備用。

1.2.2 家蠅2齡和3齡幼蟲的準(zhǔn)備。試驗(yàn)組取08：00—10：00所產(chǎn)的家蠅卵，分別置于預(yù)處理后的豬糞和雞糞培養(yǎng)基中飼養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后得到2齡幼蟲，96 h后得到3齡幼蟲。常規(guī)麥麩飼養(yǎng)的幼蟲為正常對(duì)照組，麥麩中加入大腸桿菌菌液(3.56 g/L)飼養(yǎng)的為細(xì)菌誘導(dǎo)組。

1.2.3 家蠅幼蟲分泌物的提取。取2齡和3齡家蠅幼蟲100 g用蒸餾水清潔體表后，浸泡于適量無菌水中，25～26 ℃條件下放置4 h，不斷振蕩。吸取浸液用0.22 μm的無菌濾器過濾除菌，獲得分泌物粗提液。

1.2.4 不同培養(yǎng)基和不同齡期幼蟲分泌物中溶菌酶的含量檢測(cè)。分別取試驗(yàn)組和對(duì)照組蠅蛆分泌物，用藤黃微球菌作為底物，測(cè)定家蠅幼蟲溶菌酶的含量。按照試劑盒說明書計(jì)算溶菌酶含量。

1.2.5 不同儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間幼蟲分泌物中溶菌酶的活性檢測(cè)。將豬糞飼養(yǎng)組的幼蟲分泌物分裝置于室溫、4 ℃、-20 ℃條件下，每隔一定時(shí)間取出，檢測(cè)其溶菌酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基和不同齡期幼蟲分泌物中溶菌酶含量的比較 由表1可知，各組3齡幼蟲分泌物中溶菌酶含量均顯著高于2齡幼蟲(P<0.05)。豬糞培養(yǎng)基、雞糞培養(yǎng)基和細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的2齡和3齡幼蟲，其分泌物中溶菌酶含量均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。

表1 不同培養(yǎng)基和不同齡期幼蟲分泌物中溶菌酶含量的比較

Table 1 The comparison of lysozyme content in the secretions of different instars of larvae cultivated with various kinds of culture media μg/mL

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases stand for significant differences(P<0.05).

2.2 不同儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)幼蟲分泌物中溶菌酶含量的影響 從圖1可以看出，幼蟲分泌物在室溫下溶菌酶含量可以維持7 d，8～14 d溶菌酶活性基本消失；在4 ℃條件下放置7 d溶菌酶含量無明顯變化，但8～21 d溶菌酶含量逐漸下降，22～63 d溶菌酶含量維持在最初測(cè)定值的一半左右，64～70 d溶菌酶活性逐漸消失；放置于-20 ℃下幼蟲分泌物的溶菌酶含量一直比較穩(wěn)定，64～70 d溶菌酶含量無明顯變化。

圖1 不同儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)溶菌酶含量的影響Fig.1 Effects of different storage temperatures and storage time on the lysozyme content

3 討論與結(jié)論

溶菌酶作為一種非特異性免疫因子，廣泛分布于生物體的體液和組織液中[15]。除了天然的抗菌活性外，人溶菌酶與機(jī)體的防御體系密切相關(guān)，其具有抗炎、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等功能，同時(shí)作為內(nèi)源性蛋白質(zhì)，不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良反應(yīng)和副作用[16]。大量研究表明，除植物溶菌酶存在差異外，人和動(dòng)物的溶菌酶在功能和作用機(jī)制上相同或相似。家蠅溶菌酶作為重要的非特異性防御功能因子，與人溶菌酶均屬于C型溶菌酶[17]，具有廣闊的開發(fā)和利用前景。

已有研究表明，魚類消化道所分泌的消化酶對(duì)溶菌酶制品活力的影響因魚的種類和消化道部位的不同而不同[18]。為了進(jìn)一步了解家蠅幼蟲的齡期及生存環(huán)境對(duì)其分泌的溶菌酶活性的影響，筆者檢測(cè)了不同培養(yǎng)基中飼養(yǎng)的2齡、3齡家蠅幼蟲分泌物的溶菌酶含量，根據(jù)在一定濃度的混濁菌液中，由于溶菌酶能水解細(xì)菌細(xì)胞壁上肽聚糖，使細(xì)胞裂解，導(dǎo)致細(xì)菌濃度降低，透光度增強(qiáng)，根據(jù)透光度來推算溶菌酶的含量[19]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，各組3齡幼蟲分泌物中溶菌酶的含量均高于2齡幼蟲。據(jù)推測(cè)，可能是因?yàn)榧蚁売紫x要經(jīng)歷1齡、2齡、3齡3個(gè)時(shí)期，一般情況下1齡和2齡均為家蠅幼蟲的主要生長期，其體內(nèi)主要以合成自身結(jié)構(gòu)蛋白為主，分泌性蛋白的合成較少[20]。3齡幼蟲屬于生長的過渡時(shí)期，其體內(nèi)積累了大量的分泌蛋白，就會(huì)產(chǎn)生更多的分泌性溶菌酶。3齡幼蟲的體液免疫和細(xì)胞免疫功能逐漸趨于完善，能更好地抵御外界侵害，為進(jìn)入蛹期做好充分的準(zhǔn)備。溶菌酶作為家蠅幼蟲分泌的廣譜的抗菌效應(yīng)分子，其分泌量在3齡會(huì)有所提高。因此，3齡家蠅幼蟲是最佳的溶菌酶獲取時(shí)期。大腸桿菌誘導(dǎo)組中溶菌酶含量顯著高于正常對(duì)照組，雞糞處理組和豬糞處理組中溶菌酶含量亦高于正常對(duì)照組，因?yàn)殡u糞與豬糞中含有大量的細(xì)菌、真菌和放線菌等病原菌，可推測(cè)經(jīng)外界病原菌等不利因素誘導(dǎo)后蠅蛆可分泌更多的溶菌酶，并且豬糞和雞糞等天然培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果較單純大腸桿菌菌液好。

溶菌酶作為一種堿性蛋白，不同的環(huán)境條件(如溫度、pH、儲(chǔ)存時(shí)間)均會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生影響[20]。該研究結(jié)果表明，無論是否經(jīng)大腸桿菌菌液誘導(dǎo)，家蠅溶菌酶含量的下降幅度隨著儲(chǔ)存溫度的降低而均逐漸減緩，在-20 ℃儲(chǔ)存溫度下家蠅溶菌酶在70 d內(nèi)仍可保持較高的含量。這說明低溫有利于家蠅溶菌酶的儲(chǔ)存。在4 ℃條件下，誘導(dǎo)對(duì)照組溶菌酶含量高于正常對(duì)照組，亦可推測(cè)出大腸桿菌菌液的誘導(dǎo)可提高家蠅溶菌酶含量。該試驗(yàn)結(jié)果可進(jìn)一步揭示家蠅溶菌酶活性變化的規(guī)律，為其進(jìn)一步開發(fā)和利用提供試驗(yàn)支持。

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Effects of Different Culture Media and Storage Conditions on the Lysozyme Content in the Secretions of Housefly Larvae

WANG Jian-yu1, GUO Guo2*，YANG Wei-jin2et al

(1. Excellent Doctors Class in Grade 2012 in Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004; 2. School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004)

[Objective] To study the effects of different culture media and storage conditions on lysozyme content in the secretions of housefly larvae. [Method] Swine manure and chicken manure were used as the culture media to feed housefly larvae. The housefly larvae in control group were fed with wheat bran and that in induced group were fed with wheat bran with addingEscherichiacoli. The secretions of 2-instar and 3-instar housefly larvae in each group were extracted to determine lysozyme content in the secretions by using reagent kits. The secretions in 3-instar larvae in control group and induced group were extracted to analyze the changes of lysozyme content at room temperature, 4 ℃ and -20 ℃ respectively. [Result] The average lysozyme content in the secretions of 3-instar larvae in swine manure group，chicken manure group，control group and induced group were 2.462，2.782，1.019 and 2.117 μg/mL respectively， significantly higher than that in 2-instar larvae(P<0.05). The lysozyme content in the secretions of 2-instar larvae and 3-instar larvae in swine manure group，chicken manure group and induced group were higher than that in control group(P<0.05).At room temperature, lysozyme activity in control group and induced group could be maintained for about 14 days. At -20 ℃, lysozyme activity could be maintained for about 70 days. At 4 ℃，the maintenance time of lysozyme activity in control group and induced group were in between room temperature and -20 ℃， and lysozyme content in these two groups had some differences at different time. [Conclusion] The lysozyme content in the in the secretions of 3-instar larvae is higher than that in 2-instar larvae. Swine manure culture medium and chicken manure culture medium can significantly increase the lysozyme content in the secretions of 2-instar larvae and 3-instar larvae. And higher lysozyme activity in housefly larvae can be maintained at -20 ℃.

Housefly; Lysozyme; Swine manure; Chicken manure

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160204)；高校博士點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20105215120001)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201310660016)。

王建宇(1993- )，男，山東德州人，本科生，專業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)。*通訊作者，副教授，博士，從事醫(yī)學(xué)昆蟲方面的研究。

2016-09-12

S 476.3

A

0517-6611(2016)31-0005-03