李嘉晟，童浩杰，張凱龍，楊坤，羅媛媛，金園庭

(中國(guó)計(jì)量大學(xué)，杭州310018)

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貴南沙蜥染色體核型與聚類(lèi)分析

李嘉晟，童浩杰，張凱龍，楊坤，羅媛媛，金園庭*

(中國(guó)計(jì)量大學(xué)，杭州310018)

貴南沙蜥Phrynocephalusguinanensis為近年沙蜥屬新命名的物種，形態(tài)上區(qū)別于貴德沙蜥P.putjatia與青海沙蜥P.vlangalii，而最近沙蜥分子系統(tǒng)發(fā)育研究的結(jié)果不支持貴南沙蜥為一有效種，它在分子樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上與貴德沙蜥一亞分支樣本聚在一起。本文觀察貴南沙蜥核型為2n=24I+24m，具有12對(duì)大染色體和12對(duì)小染色體，其中大染色體均為端部類(lèi)型，且無(wú)性別相關(guān)的異型染色體。青海11個(gè)沙蜥種群染色體特征的聚類(lèi)分析表明貴南沙蜥與貴德沙蜥聚于同一分支，該分支構(gòu)成青海沙蜥分支的姐妹支，證實(shí)貴南沙蜥與貴德沙蜥具有較近的核型演化關(guān)系。研究結(jié)果不支持貴南沙蜥為有效物種。

貴南沙蜥；核型；聚類(lèi)分析；系統(tǒng)分化

染色體的大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)具有多樣性。不同分類(lèi)群核型特征不同，它不僅表現(xiàn)在屬間、種間，也表現(xiàn)在種內(nèi)不同種群間，這為探討屬、種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及生物的系統(tǒng)發(fā)育提供了重要的依據(jù)(Mayr，1969；Stebbins，1971)。染色體核型作為研究物種分類(lèi)、演化的重要手段，已成為細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法，并常被用來(lái)解決形態(tài)分類(lèi)難以解決的問(wèn)題，是現(xiàn)代綜合分類(lèi)的有效手段之一(吳甘霖，2006)。

沙蜥屬Phrynocephalus屬有鱗目Squamata爬行綱Reptilia鬣蜥科Agamidae，約40個(gè)物種，按繁殖方式可分為卵生沙蜥和胎生沙蜥(趙爾宓等，1998；趙肯堂，1999)。我國(guó)的沙蜥屬核型均來(lái)自共同的核型祖先，可分為3個(gè)核型類(lèi)群：(1)2n=48(包括12對(duì)大染色體和12對(duì)小染色體)，所有胎生沙蜥屬于這一類(lèi)；(2)2n=46(包括11對(duì)大染色體和12對(duì)小染色體)，所有卵生沙蜥(大耳沙蜥P.mystaceus除外)屬于這一類(lèi)；(3)2n=48(包括11對(duì)大染色體和13對(duì)小染色體)，卵生的大耳沙蜥屬于這一類(lèi)(曾曉茂等，1997；邱清波等，2007)。

青藏高原上主要分布著6種胎生沙蜥：青海沙蜥P.vlangalii、西藏沙蜥P.theobaldi、紅尾沙蜥P.erythrurus、南疆沙蜥P.forsythii、貴德沙蜥P.putjatia和近年命名的貴南沙蜥P.guinanensis(Jietal.，2009)。貴南沙蜥僅分布在青海省海南藏族自治州貴南縣的一片連續(xù)沙丘(長(zhǎng)寬各20～40 km)，分布區(qū)與貴德沙蜥(主要分布在青海湖盆地及其東南部貴德、貴南)鄰近但互不重疊(Jinetal.，2014)。兩者個(gè)體大小與體色特征差異顯著：貴南沙蜥體色具兩性異形，兩性成體在背部、尾與前肢側(cè)面以及腹部周緣的顏色都存在差異(Jietal.，2009)，而貴德沙蜥沒(méi)有明顯的體色兩性異形。

貴德沙蜥異型性染色體的缺失證實(shí)它與具有異型性染色體的青海沙蜥存在遺傳差異(王躍招等，2002)。近期研究證實(shí)貴德沙蜥為一有效的系統(tǒng)分類(lèi)物種(Guo & Wang，2007；Jinetal.，2008；Jin & Brown，2013)。不同于貴南沙蜥僅僅分布于貴南縣的一片連續(xù)沙丘，貴德沙蜥廣泛分布于青海湖盆地及其東部與南部的荒漠和半荒漠地帶(Jinetal.，2014)。應(yīng)用線粒體基因和核基因研究證實(shí)貴南沙蜥與貴德沙蜥遺傳分化不明顯，貴南沙蜥系統(tǒng)分化上應(yīng)歸屬于貴德沙蜥(Jinetal.，2014)。

本文采用骨髓細(xì)胞染色體制備的實(shí)驗(yàn)方法，旨在研究貴南沙蜥的核型特征，并分析貴南沙蜥與其他近緣沙蜥物種的染色體特征的聚類(lèi)關(guān)系。以期揭示貴南沙蜥與青海沙蜥、貴德沙蜥及其他胎生沙蜥核型特征的演化關(guān)系，為胎生沙蜥系統(tǒng)分類(lèi)與多樣性研究提供新證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

貴南沙蜥成體(5♂♂，5♀♀)于2014年8月采自青海省海南藏族自治州貴南縣過(guò)馬營(yíng)鎮(zhèn)(35°47′N(xiāo), 101°02′E)。樣本處理前飼養(yǎng)于中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 骨髓染色體制備

分別在貴南沙蜥皮下和腹腔各注射2次一定量(按25 μg·g-1體質(zhì)量比例)的0.5%秋水仙素溶液，間隔16 h。第二次注射2 h后將蜥蜴處死，取出四肢骨，在含有1 mL KCl低滲液(0.075 M)的培養(yǎng)皿中用止血鉗將四肢骨粉碎，使骨髓細(xì)胞充分滲出。取滲出液于離心管中，37 ℃水浴20～30 min。1 200 r·min-1離心10 min，棄上清，加入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1 mL，輕輕混勻后固定5 min。離心棄上清后加入固定液進(jìn)行2次固定，固定時(shí)間15～20 min。1200 r·min-1離心10 min，棄上清，留下一小部分(約0.1 mL)，用滴管輕輕地將沉淀物打勻。用滴管吸取懸浮液3～4滴于冰水浸泡過(guò)的載玻片上，在酒精燈上微烤，自然晾干。Giemsa染色8 min，用清水洗去多余染液，自然晾干。上述方法參照曾曉茂等(1997)的制片方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

選取雌、雄共44個(gè)較好的中期分裂相，用顯微鏡(E100，Nikon)對(duì)其放大照相。用Adobe Photoshop處理染色體核型圖，Image J測(cè)量染色體并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，染色體相對(duì)長(zhǎng)度=待測(cè)的單個(gè)染色體長(zhǎng)度/整套染色體長(zhǎng)度×100%。染色體分類(lèi)依據(jù)Levan等(1964)的標(biāo)準(zhǔn)，按臂比分為4 類(lèi)：(1)中部著絲粒染色體(m)，臂比為1.0～1.7；(2)亞中部著絲粒染色體(sm)，臂比為1.7～3.0；(3)亞端部著絲粒染色體(st)，臂比為3.0～7.0；(4)端部著絲粒染色體(t)，臂比為7.0～∞。染色體臂數(shù)(NF)統(tǒng)計(jì)及類(lèi)型縮寫(xiě)符號(hào)參照Gorman(1973)的標(biāo)準(zhǔn)：中部著絲粒染色體為V，亞中部著絲粒染色體為sV，端部著絲粒染色體為I，亞端部著絲粒染色體為sI，微小染色體為m。染色體特征加權(quán)采用王躍招等(2002)的方法進(jìn)行：即Wi=Ai×(ΣMi)/n，其中Wi為加權(quán)值，Ai為編碼值，有異型性染色體的Ai=1，無(wú)異型性染色體的Ai=0，Mi為第i對(duì)大染色體的相對(duì)長(zhǎng)度，n為大染色體對(duì)數(shù)。染色體特征的聚類(lèi)分析以居群為單位進(jìn)行，先用Matlab計(jì)算居群間的歐式距離，構(gòu)建歐式距離矩陣，然后用MEGA 6.0使用非加權(quán)組平均法(UPGMA)建樹(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 貴南沙蜥染色體核型

對(duì)貴南沙蜥個(gè)體骨髓細(xì)胞的中期分裂相進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示所有分裂相染色體組均由12對(duì)大染色體和12對(duì)小染色體組成，且均為端部著絲粒染色體，未見(jiàn)與性別相關(guān)的異型性染色體(圖1)。其中，最長(zhǎng)的染色體的相對(duì)長(zhǎng)度為12.953±0.034，最短的為4.937±0.016，其臂比均為∞(表1，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表述為Mean±SE)。因此，貴南沙蜥核型模式為2n=24I+24m，臂數(shù)NF=48。

2.2 染色體特征聚類(lèi)分析

應(yīng)用已發(fā)表的貴德沙蜥與青海沙蜥染色體核型數(shù)據(jù)(王躍招等，2002)，包含本研究取得的貴南沙

表1 貴南沙蜥染色體測(cè)量值

圖1 貴南沙蜥核型圖(100×)

A為雄性個(gè)體，B為雌性個(gè)體。

A represents male, B represents female.

蜥核型特征數(shù)據(jù)在內(nèi)，我們對(duì)來(lái)自青海各地共計(jì)11個(gè)沙蜥地理種群(表2)進(jìn)行了染色體特征的系統(tǒng)聚類(lèi)分析。由于其中8個(gè)青海沙蜥種群雌性個(gè)體中存在異型性染色體(表2)，我們分別進(jìn)行了異型性染色體特征加權(quán)分析和異型性染色體特征非加權(quán)分析，然后分別用MEGA構(gòu)建非加權(quán)組平均法(UPGMA)系統(tǒng)樹(shù)(圖2)。從系統(tǒng)樹(shù)可見(jiàn)，11個(gè)種群分為2個(gè)分支，其中貴南沙蜥種群貴南(Guinan)與貴德沙蜥2種群貴德(Guide)和天祝(Tianzhu)聚為一個(gè)分支，剩余的8個(gè)青海沙蜥種群聚為另一分支。

3 討論

研究結(jié)果顯示貴南沙蜥染色體核型模式為2n=24I+24m。曾曉茂等(1997)將我國(guó)沙蜥核型分為3類(lèi)：11對(duì)大染色體類(lèi)群(2n=46=22I+24m)、12對(duì)大染色體類(lèi)群(2n=48=24I+24m)和大耳沙蜥類(lèi)型(2n=48=2V+8sV+12sI+26m)。貴南沙蜥為胎生蜥蜴，與貴德沙蜥、青海沙蜥、南疆沙蜥、澤當(dāng)沙蜥P.zetangensis和紅尾沙蜥等我國(guó)特有的其他胎生沙蜥(曾曉茂等，1997；王躍招等，2002)同歸屬具有12對(duì)大染色體類(lèi)群的胎生沙蜥。

貴南沙蜥大染色體均為端部類(lèi)型，未見(jiàn)與性別相關(guān)的異型染色體，這與貴德沙蜥相同；但不同于其他胎生沙蜥物種，如青海沙蜥(王躍招等，2002)。因此，從核型看貴南沙蜥與貴德沙蜥更相近。比較

圖2 青海11個(gè)沙蜥種群基于大染色體相對(duì)長(zhǎng)度的系統(tǒng)聚類(lèi)分析

Fig.2 The cluster relationship based on macrochromosomal relative length of elevenPhrynocephaluspopulations in Qinghai

A.ZW/ZZ為加權(quán), B.ZW/ZZ為不加權(quán)。

A.ZW/ZZ represents the weighted, B.ZW/ZZ represents the unweighted.

表2 沙蜥各居群大染色體相對(duì)長(zhǎng)度

分析貴南沙蜥與青海沙蜥和貴德沙蜥樣本染色體特征的聚類(lèi)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，貴南沙蜥與貴德沙蜥種群樣本處于同一分支，而青海沙蜥不同種群樣本聚于另一不同分支，兩分支呈姐妹分歧關(guān)系；因此，染色體特征聚類(lèi)分析結(jié)果依然支持貴南沙蜥與貴德沙蜥為同一物種，這與近期基于線粒體基因與核基因的分子系統(tǒng)分類(lèi)的研究結(jié)果一致(Jinetal.，2014)。

然而由于貴南沙蜥和貴德沙蜥體色表型與生態(tài)地理分布差異顯著(Jietal.，2009；Jinetal.，2014)，且具有很近的起源祖先，在分子系統(tǒng)分化上，貴南沙蜥所有樣本都聚在分布于青海湖盆地外的貴德沙蜥主分支的一亞分支內(nèi)，表明貴南沙蜥和貴德沙蜥具有最近的起源祖先，而顯著的表型分化提示貴南沙蜥與貴德沙蜥是一個(gè)有意思的生態(tài)進(jìn)化類(lèi)群，有待進(jìn)一步開(kāi)展表型特征與遺傳分化研究。

致謝：感謝付昕蕾同學(xué)的實(shí)驗(yàn)工作、數(shù)據(jù)整理分析，以及李素芳、柳立軍老師給予的染色體具體實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

邱清波, 杜宇, 林熾賢. 2007. 沙蜥屬13種蜥蜴基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[J]. 海南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 20(4): 350-354.

王躍招, 曾曉茂, 方自力, 等. 2002. 沙蜥屬一有效種貴德沙蜥及紅原沙蜥的分類(lèi)研究[J]. 動(dòng)物分類(lèi)學(xué)報(bào), 27(2): 372-383.

吳甘霖. 2006. 核型分析在細(xì)胞分類(lèi)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)雜志, 23(1): 39-41.

曾曉茂, 王躍招, 劉志君, 等. 1997. 九種沙蜥的核型——論中國(guó)沙蜥屬核型演化[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 43(4): 399-410.

趙爾宓, 江躍明, 黃慶云, 等. 1998. 拉漢英兩棲爬行動(dòng)物名稱(chēng)[M]. 北京: 科學(xué)出版社.

趙肯堂. 1999. 沙蜥屬[M]// 趙爾宓, 趙肯堂， 周開(kāi)亞, 等.中國(guó)動(dòng)物志 有鱗目 蜥蜴亞目. 北京: 科學(xué)出版社: 151-193.

Gorman GC. 1973. The chromosomes of the Reptilia, a cytotaxonomic interpretation[M]// Chiarelli AB, Capanna E. Cytotaxonomy and vertebrate evolution. New York: Academic Press: 349-424.

Guo X, Wang Y. 2007. Partitioned Bayesian analyses, dispersal-vicariance analysis, and the biogeography of Chinese toad-headed lizards (Agamidae:Phrynocephalus): a re-evaluation[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 45: 643-662.

Ji X, Wang YZ, Wang Z. 2009. New species ofPhrynocephalus(Squamata, Agamidae) from Qinghai, northwest China[J]. Zootaxa， 1988: 61-68.

Jin YT, Brown RP, Liu NF. 2008. Cladogenesis and phylogeography of the lizardPhrynocephalusvlangalii(Agamidae) on the Tibetan plateau[J]. Molecular Ecology, 17: 1971-1982.

Jin YT, Brown RP. 2013. Species history and divergence times of viviparous and oviparous Chinese toad-headed sand lizards (Phrynocephalus) on the Qinghai-Tibetan Plateau[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 68: 259-268.

Jin YT, Yang ZS, Brown RP,etal. 2014. Intraspecific lineages of the lizardPhrynocephalusputjatiafrom the Qinghai-Tibetan Plateau: Impact of physical events on divergence and discordance between morphology and molecular markers[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 71: 288-297.

Levan A, Fredga K, Sandberg AA. 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J]. Hereditas, 52(2): 201-220.

Mayr E. 1969. Principles of systemstic zoology[M]. McGraw: Hill Book Company.

Stebbins GL. 1971. Chromosome evolution in higherplants[M]. London: Edward Aronld: 88.

Chromosomal Karyotype Characteristics and Systematic Cluster Analysis ofPhrynocephalusguinanensis

LI Jiasheng, TONG Haojie, ZHANG Kailong, YANG Kun, LUO Yuanyuan, JIN Yuanting*

(China Jiliang University, Hangzhou 310018, China)

Phrynocephalusguinanensiswas a newly named species and phenotypically different fromP.putjatiaandP.vlangalii.Recent molecular systematic analysis onPhrynocephalussuggested thatP.guinanensiswas an invalid species and its population was clustered into a subclade ofP.putjatiaon the tree topology.As a basic method of cellular genetics research, chromosomal karyotype analysis has been an alternative effective way for studying the modern comprehensive classification.In this study, the medullary cell ofP.guinanensiswas used to prepare chromosome for karyotype analysis and the chromosomal karyotype characteristics were used to investigate the cluster relationship amongP.guinanensisand otherPhrynocephalusspecies.The results showed that chromosomal karyotype ofP.guinanensiscould be expressed as 2n=24I+24m, which had twelve pairs of macrochromosomes belonging to end type and twelve pairs of microchromosomes.No heteromorphic sex chromosomes were observed.Based on the result of cluster analysis of elevenPhrynocephaluspopulations distributed in Qinghai province,P.guinanensisand allP.putjatiaspecimens were clustered as a sister clade, and this also indicated thatP.guinanensiswas an invalid species with the most closely evolutionary relationship withP.putjatia.

Phrynocephalusguinanensis; karyotype; cluster analysis; phylogenetic divergence

2015-12-31 接受日期：2016-01-30 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372183)

李嘉晟(1997—), 男，本科生, 主要從事分子進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)研究

*通信作者Corresponding author，E-mail：jinyuanting@126.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20150417

Q959.6

A

1000-7083(2016)03-0391-04