樹突狀細(xì)胞聯(lián)合共培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療晚期胃癌臨床療效觀察

劉曉玲，董　猛，郭紅月，唐毅玲，韓景智，崔東暉

樹突狀細(xì)胞聯(lián)合共培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療晚期胃癌臨床療效觀察

劉曉玲，董猛，郭紅月，唐毅玲，韓景智，崔東暉

目的：探討樹突狀細(xì)胞（DC）共培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）聯(lián)合化療治療晚期胃癌的療效與安全性。方法：選取66例晚期胃癌患者，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組,每組33例患者，觀察組化療4周期后予DC-CIK生物治療，對(duì)照組常規(guī)化療，觀察治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群、血清腫瘤標(biāo)志物的改變及臨床療效,記錄不良反應(yīng)。結(jié)果：觀察組1個(gè)月后胃癌患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例均有不同程度提高（P＜0.05）。觀察組血清腫瘤標(biāo)志物CEA在治療后1個(gè)月為（11.36±2.62）ng/mL，而對(duì)照組為（22.16±13.45）ng/mL，觀察組CEA水平較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）?？陀^緩解率15.2%，疾病控制率33.3%。結(jié)論：DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合化療晚期胃癌，可延緩疾病進(jìn)展，改善患者免疫功能，是安全、有效的治療方法。

樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞；化療；進(jìn)展期胃癌

胃癌5年生存率僅30%左右[1]，發(fā)病早期無特異癥狀及體征，導(dǎo)致大多數(shù)患者確診時(shí)已為進(jìn)展期，晚期胃癌多數(shù)無手術(shù)價(jià)值，即便手術(shù)復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率也極高。隨著分子和細(xì)胞生物技術(shù)的發(fā)展，免疫治療成為繼手術(shù)、化療、放療之后惡性腫瘤的第4種主要治療方法[2]。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是一種專職抗原呈提細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），在抗原呈提中處于核心地位，能誘導(dǎo)出抗原特異性細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）反應(yīng)[3]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞（cytokined-induced killer，CIK）來源于外周血單個(gè)核細(xì)胞，是在體外經(jīng)過多種細(xì)胞因子激活和一段時(shí)間的培養(yǎng)獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用具有高效性和非主要組織相容性復(fù)合體限制性的特點(diǎn)，是一類殺瘤活性強(qiáng)和抗瘤譜廣的新型抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞[4]。2011年10月—2014年10月，我們觀察了局部晚期無法切除或切除后復(fù)發(fā)或有遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移的胃癌患者，探索細(xì)胞免疫的有效性與安全性。

1　資料與方法

1.1一般資料選取河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院外一科2011年10月—2014年10月66例胃癌患者，男40例，女26例；年齡42～70歲，中位年齡58歲。均經(jīng)病理確診，其中腺癌50例，印戒細(xì)胞癌16例。隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各33例。見表1。入選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）分期標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)為III～I(xiàn)V期；重要臟器功能正常，無自身免疫疾??；卡氏評(píng)分＞60分；兩組評(píng)分無差異性（P＞0.05）。預(yù)期生存時(shí)間超過3個(gè)月。患者或家屬簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1　66例晚期胃癌患者一般資料例比較

1.2治療方法對(duì)照組采用XELOX方案(第1 d靜脈點(diǎn)滴奧沙利鉑130 mg/m2溶于5%葡萄糖250 mL，大于2 h，第1～14 d口服卡培他濱1000 mg/m2，2次/d，21 d為1個(gè)周期)化療，共4周期。觀察組予4周期XELOX方案化療后的第14 d，輸入制備好的DC-CIK細(xì)胞。

1.3DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)自患者本人采集抗凝全血100 mL，加淋巴細(xì)胞分離液制備出單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)一步純化，用AIMV無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度（4～6）×106個(gè)/mL，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，收集非貼壁細(xì)胞和貼壁細(xì)胞。將非貼壁細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于培養(yǎng)瓶，分別加入IFN-γ1000 U/mL。24 h后，50 ng/mL Anti-CD3和IL-2500 U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d進(jìn)行一次擴(kuò)瓶傳代，于第8 d收集CIK細(xì)胞。貼壁細(xì)胞計(jì)數(shù)并加入rhGM-CSF 1000 U/mL和rhIL-4500 U/mL，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d半量換液，培養(yǎng)至第6 d加入TNF-α（500 U/mL），第8 d收獲DCs，然后將CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞按1∶5的比例繼續(xù)培養(yǎng)4 d，獲得DC-CIK細(xì)胞。

1.4細(xì)胞表型測(cè)定取第1 d的DCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表型，CD11c為（15.09±3.04）%，CD83為（7.02± 0.65）%為CD86為（35.1±3.96）%。取第7 d DCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表型，CD11c為（25.8±0.3）%，CD83為（50.35±2.67）%，CD86為（77.06±5.2）%。取d 1 CIK細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞表型，CD8為（15.09± 2.14）%、CD3為（31.78±0.15）%，CD56為（7.08± 1.19）%，取d 12 CIK細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表型，CD8為（38.89±0.35）%，CD3為（73.99±2.13）%，CD56為（19.67±6.78）%。其中CD3+、CD56+細(xì)胞達(dá)20%以上。

1.5DC-CIK治療方案在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第9 d、10 d、11 d、12 d收集細(xì)胞，離心、洗滌后溶于生理鹽水，霉菌檢測(cè)試驗(yàn)陰性，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力大于85%，以采血之日作為第1 d，收集第12 d時(shí)DC-DIK細(xì)胞，0.9%生理鹽水溶液洗滌3次后配成100 mL液體，1 h內(nèi)靜點(diǎn)回輸患者體內(nèi)，每天輸1次，每次回輸細(xì)胞數(shù)1×109，連續(xù)5 d為1個(gè)療程，每個(gè)療程回輸細(xì)胞總數(shù)（5～6）×109個(gè)。4～6次/年，2個(gè)月1次。

1.5流式細(xì)胞儀測(cè)定外周T淋巴細(xì)胞亞群變化于回輸前1 d及治療4周后，分別采集空腹時(shí)靜脈血5 mL，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群的標(biāo)志CD3+、CD4+、CD8+、及CD4+/CD8+比值。

1.6療效評(píng)價(jià)患者在接受最后一次DC-CIK細(xì)胞治療后，復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能、血清腫瘤標(biāo)志物和外周血T淋巴細(xì)胞亞群，并進(jìn)行上腹部強(qiáng)化CT、肺CT及腹腔彩超、ECT檢查，進(jìn)行不良反應(yīng)及臨床療效評(píng)估。治療1個(gè)月后再次評(píng)估，其后每3～6個(gè)月復(fù)查評(píng)估一次，隨訪2年。近期療效評(píng)估按實(shí)體瘤療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）、疾病進(jìn)展（PD），以CR+PR計(jì)算客觀緩解率（objective response rate，ORR），CR+PR+SD計(jì)算疾病控制率（disease control rate，DCR），總生存時(shí)間（overall surviral，OS）是從DC疫苗治療到死亡或隨訪截止日期。觀察治療前后血常規(guī)、肝腎功能的變化，觀察治療過程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)如發(fā)熱、皮疹、惡心、嘔吐、腹瀉等。

2　結(jié)果

2.1淋巴細(xì)胞亞群變化與對(duì)照組相比，觀察組接受DC-CIK治療1個(gè)月后外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值均較治療前提高。與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　2組患者外周血T細(xì)胞亞群變化（±s，%）

表2　2組患者外周血T細(xì)胞亞群變化（±s，%）

組別對(duì)照組觀察組CD3+43.09±3.34 66.30±2.15 CD4+21.48±4.45 38.67±3.03 CD8+27.09±4.21 32.74±2.81 CD4+/CD8+1.03±0.45 1.47±0.90

2.2腫瘤標(biāo)志物變化觀察組1個(gè)月后檢測(cè)血清CA19-9、CEA、CA125的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，治療組CA19-9、CEA水平顯著下降，CA125水平無顯著變化。見表3。

表3　2組患者外周血腫瘤標(biāo)志物變化（±s）

表3　2組患者外周血腫瘤標(biāo)志物變化（±s）

組別對(duì)照組觀察組CA19-9（ng/mL）44.02±7.35 17.39±3.79 CEA（ng/mL）22.16±13.45 11.36±2.62 CA125(KU/L) 17.62±7.54 16.03±3.38

2.3近期療效觀察組5例PR、6例SD、20例PD，客觀緩解率15.2%，疾病控制率33.3%。對(duì)照組3例PR、5例SD、25例PD，客觀緩解率為9.1%，疾病控制率為24.2%。見表4。

表4　2組患者近期療效

2.4隨訪隨訪時(shí)間6～24個(gè)月，中位隨訪8.9個(gè)月。觀察組23例死亡，10例仍在隨訪中。隨訪患者中位生存時(shí)間6.3個(gè)月，6個(gè)月生存率40%，9個(gè)月生存率31%。對(duì)照組27例死亡，6例仍在隨訪中。隨訪患者中位生存時(shí)間4.5個(gè)月，6個(gè)月生存率32%，9個(gè)月生存率21%。

2.5安全性觀察組1例在DC-CIK細(xì)胞回輸后出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高達(dá)38.3℃，1例出現(xiàn)乏力。均經(jīng)對(duì)癥處理好轉(zhuǎn)。治療前后血常規(guī)及肝腎功能均未見明顯變化。

3　討論

胃癌是我國高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是因?yàn)闄C(jī)體不能進(jìn)行有效的免疫防御反應(yīng)，致使腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除。惡性腫瘤患者免疫力低下，目前的主要治療方法手術(shù)、放療、化療都會(huì)加重機(jī)體免疫功能的破壞，且對(duì)于晚期胃癌患者上訴療法效果并不理想。放療、化療殺傷腫瘤，主要針對(duì)腫瘤異常的增殖能力，即使臨床治愈，仍有大量腫瘤細(xì)胞殘存。而細(xì)胞免疫治療主要通過激活和強(qiáng)化機(jī)體免疫系統(tǒng)，利用抗原特異性細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。因此，腫瘤細(xì)胞免疫治療成為了副作用最小最有希望的治療方法。

DC-CIK共培養(yǎng)時(shí)，DC分泌IL-2、IL-12、IFR-γ等細(xì)胞因子，可促進(jìn)CIK增殖，顯著提高CIK細(xì)胞的殺瘤活性。同時(shí)，DC表面的CD40和CIK表面的CD40配體結(jié)合，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生負(fù)面影響。DC-CIK細(xì)胞治療目前已經(jīng)在血液系統(tǒng)腫瘤及實(shí)體瘤[5-6]治療中均取得了良好效果，并且CIK細(xì)胞能夠借助非特異性免疫殺傷作用對(duì)腫瘤患者體內(nèi)的微小殘余病灶進(jìn)行清除[7]。CIK細(xì)胞主要通過NKG2D受體途徑發(fā)揮溶細(xì)胞效應(yīng)，清除惡性腫瘤患者殘存的腫瘤細(xì)胞或腫瘤微病灶，可有效防止復(fù)發(fā)[8-9]。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為惡性腫瘤患者體內(nèi)DC缺乏，導(dǎo)致殺傷細(xì)胞的呈遞作用減弱，進(jìn)而造成CIK的殺傷活性減低[10-11]。因此，將DC與CIK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，可增強(qiáng)機(jī)體殺滅腫瘤細(xì)胞的能力，構(gòu)建高效穩(wěn)定的免疫系統(tǒng)，緩解患者T細(xì)胞免疫功能低下的特點(diǎn)，有助于解除腫瘤患者的免疫無能，有研究發(fā)現(xiàn)化療后給予免疫治療有1+1＞2的療效[12]。

機(jī)體的抗腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，體內(nèi)抗腫瘤免疫主要由CD4+T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞完成。CD4+CD8+細(xì)胞比值為中心的免疫調(diào)節(jié)，是機(jī)體免疫狀態(tài)的中心環(huán)節(jié)。惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制因子抑制淋巴細(xì)胞分化增殖，使CD4+/CD8+降低，機(jī)體免疫功能受損。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+細(xì)胞比值均有增高。說明CD-CIK細(xì)胞治療能提高患者免疫功能狀態(tài)，增加機(jī)體抗腫瘤免疫，且與化療藥物起到療效協(xié)同作用，減少耐藥的發(fā)生。2年的隨訪結(jié)果顯示，觀察組客觀緩解率和疾病控制率均較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DC-CIK聯(lián)合化療能提高晚期胃癌患者的生存率。

鮑峰等[13]回顧性研究了68例晚期胃癌患者于手術(shù)及放、化療后靜脈輸注DC-CIK細(xì)胞治療的療效及不良反應(yīng)，結(jié)果能顯著改善患者生存質(zhì)量，延長生存時(shí)間安全有效。楊濤等[14]通過DC-CIK聯(lián)合治療晚期實(shí)體瘤患者，42例可評(píng)價(jià)病灶，其中2例CR，9例PR，15例SD。要跟東等[15]使用DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合化療對(duì)37例進(jìn)展期胃癌患者治療結(jié)果顯示，所有患者CD4+、CD8+比率、NK細(xì)胞百分比等較治療前均明顯升高，且在改善患者生存率和復(fù)發(fā)率方面也有積極意義。本研究中1例發(fā)熱，經(jīng)對(duì)癥治療好轉(zhuǎn)，目前有學(xué)者認(rèn)為，生物治療出現(xiàn)中度發(fā)熱是機(jī)體免疫功能正常反應(yīng)的結(jié)果，該反應(yīng)對(duì)治療有益。DC-CIK治療安全性好，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。

本研究66例晚期胃癌患者經(jīng)DC-CIK聯(lián)合治療后，臨床癥狀明顯緩解，延緩了疾病進(jìn)程。但晚期患者腫瘤負(fù)荷過大，機(jī)體免疫抑制狀態(tài)極大地限制了細(xì)胞免疫治療療效的顯現(xiàn)，因此其應(yīng)用時(shí)機(jī)及如何使其能更高提升機(jī)體免疫功能，規(guī)范融入腫瘤綜合治療，成為了一項(xiàng)有希望和富于挑戰(zhàn)性的任務(wù)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，上訴問題會(huì)得到解決，細(xì)胞免疫生物治療會(huì)成為一種重要的腫瘤治療方法。

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（收稿：2015-08-06修回：2016-01-10）

（責(zé)任編輯李 勇）

Clinical Efficiency Observation of Dendritic Cells and Cytokine-induced Killer Cells Combination Therapy on Advanced Gastric Cancer Patients

LIU Xiao-ling，DONG Meng，TANG Yi-ling，et al.Department of Surgery I,Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine of Hebei Province,Cang?zhou（061001），China

ObjectiveTo investigate the safety and clinical effects of dendritic cells（DCs）co-cultured with cytokine-induced killer cells（CIK）combined with chemotherapy on patients with advanced gastric cancer. MethodsSixty-six patients with advanced gastric cancer were divided into two groups randomly，33 pa?tients in each group.The patients in the observation group were treated with DC-CIK after four cycle chemo?therapy,while the patients in the control group were treated with chemotherapy only.Tlymphocyte subtypes and serum tumor markers were compared between the two groups，The clinical effects were analysed and the safety was observed.ResultsThe ratios of CD3+,CD4+,CD8+and CD4+/CD8+in peripheral blood of the patients were increased after one month treatment（P＜0.05）.The serum tumor marker CEA was found（11.36±2.62）ng/ mL in the observation group,and（22.16±13.45）ng/mL in the control group after one month treatment.CEA in the observation group was decreased obviously as compared with the control group(P＜0.05).The objective re?sponse rate was 15.2%，and the disease control rate was 33.3%.ConclusionDC-CIK cells combined with chemotherapy can prolong the progression of advanced gastric cancer，by enhancing the autoimmune function, so as a safe and effective treatment.

Dendritic cells;cytokine-induced killer cells;chemotherapy;advanced gastric cancer

R735.2

A

1007-6948(2016)02-0124-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.02.005

河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院外一科（滄州 061001）

崔東暉,E-mail：lxl-1984-2@163.com