王飛，董凌月，安威

（首都醫(yī)科大學細胞生物學系；肝臟保護與再生調(diào)節(jié)北京市重點實驗室，北京 100069）

技術方法

小鼠成體肝臟前體細胞最佳培養(yǎng)條件探索

王飛，董凌月，安威*

（首都醫(yī)科大學細胞生物學系；肝臟保護與再生調(diào)節(jié)北京市重點實驗室，北京 100069）

目的 建立一種專門用于小鼠肝臟前體細胞的培養(yǎng)條件，并鑒定該條件在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中是否能夠維持前體細胞良好的生長狀態(tài)，并減少分化的發(fā)生。方法 配制4種不同配方的培養(yǎng)基，在連續(xù)傳代過程中通過觀察細胞形態(tài)學變化而選擇適用的配方，并經(jīng)Western blot檢測細胞內(nèi)肝細胞標志物白蛋白（albumin，ALB）、肝臟前體細胞標志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）和膽管細胞標志物細胞角蛋白-19（cytokeratin-19，CK-19）表達量的變化，流式細胞術分析細胞周期，以及免疫熒光染色鑒定前體細胞標志物的表達以進一步驗證選擇配方的有效性。結(jié)果 使用第4種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時，細胞形狀規(guī)則，邊界清晰，生長活力較好，連續(xù)傳代培養(yǎng)后細胞的形態(tài)未發(fā)生明顯改變。Western blot檢測顯示，ALB、AFP和CK-19在P0代、P3代和P8代中的表達量沒有顯著改變。流式細胞術結(jié)果顯示，經(jīng)連續(xù)多次傳代的細胞約76%的細胞處于G0／G1期，近24%的細胞處于S＋G2／M期，而且約89%的細胞表達肝臟前體細胞標志物上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）。免疫熒光染色進一步證實了大多數(shù)細胞表達EpCAM。結(jié)論 建立了合適的培養(yǎng)基配方可用于小鼠成體肝臟前體細胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)，為更加深入地研究肝臟前體細胞的機制與再生醫(yī)學方面創(chuàng)造了前提條件。

小鼠成體肝臟前體細胞；連續(xù)傳代；可塑性；培養(yǎng)條件

成體干細胞是存在于已經(jīng)分化的組織器官中的未分化細胞，具有自我更新的能力，并在一定條件下可以分化為各種特異的細胞類型［1］。成體干細胞的研究起始于20世紀60年代對造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSC）的研究［2］。近些年來肝臟成體干細胞的研究取得了很大的進步，早在1958年，Wilson和Leduc就在小鼠肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有多向或雙向分化潛能的肝臟前體細胞［3］，后來又有人發(fā)現(xiàn)肝外來源，如從骨髓來源的肝臟干細胞；并根據(jù)來源不同，將其分為肝源性肝臟前體細胞和非肝源性肝臟前體細胞，前者主要指卵圓細胞［4］，后者主要指來自于骨髓造血干細胞等的前體細胞。成體肝臟的卵圓細胞所占的比例不到肝臟細胞總數(shù)的1%，并且大都處于休眠狀態(tài)，但當肝臟受到毒物損傷，如CCl4、乙硫氨酸，或部分切除后，卵圓細胞可增殖并且分化［5-8］。胡以平等采用倒千里光堿（retrosine，Rs）阻斷本體的肝細胞增殖后，經(jīng)肝臟部分切除作為促有絲分裂的信號，術后14d從小鼠肝臟分離得到的一類具有卵圓細胞性質(zhì)的肝臟前體細胞［9］，并將之命名為肝上皮前體細胞（liver epithelial progenitor cells，LEPCs）。LEPCs屬于雙潛能干細胞［10］，而干細胞的培養(yǎng)相對于其它細胞而言需要的條件較為嚴格，一是需要保證其生長狀態(tài)良好，二是要防止在傳代的過程中出現(xiàn)分化，以維持其可塑性。

本研究對小鼠成體肝臟前體細胞LEPCs的培養(yǎng)條件進行了探索，先后使用了4種不同配方的培養(yǎng)基，首先從形態(tài)學的觀察確定培養(yǎng)基的組成，并通過Western blot檢測、流式細胞術及免疫熒光染色，驗證了所選擇的培養(yǎng)條件在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中，細胞生長狀態(tài)良好，能較好地保持前體細胞的可塑性，為后續(xù)的深入研究提供了保障。

材料與方法

1 細胞

LEPCs由第二軍醫(yī)大學細胞生物學教研室胡以平教授贈予。

2 主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco／BRL公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司，德國ScienCell公司）；mHGF（美國R＆D systems公司）；mEGF（美國 Cell Signaling Technology公司）；胰島素（美國Gibco／BRL公司）；尼克酰胺（美國SUPELCO公司）；BD CycletestTMPlus DNA Kit（美國BD公司）；流式細胞術用PE標記EpCAM單克隆抗體（美國eBioscience公司）；免疫熒光用EpCAM單克隆抗體（英國abcom公司）；流式細胞術用FITC標記DLK1單克隆抗體（英國abcom公司）；ALB多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；AFP多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；CK-19多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標記的抗GAPDH抗體（上?？党缮锟萍加邢薰荆?。

3 培養(yǎng)基

條件1培養(yǎng)基：高糖DMEM、10%FBS、1%青霉素和鏈霉素（雙抗）。

條件2培養(yǎng)基：高糖DMEM、10%FBS、1%雙抗、10μg／ml胰島素、1mmol／L GlutaMAX。

條件3培養(yǎng)基：高糖DMEM、10%FBS、1%雙抗、0.1mmol／L β-巰基乙醇、10ng／ml肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、10ng／ml上皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、10μg／ml胰島素、0.1μmol／L地塞米松、10ng／ml尼克酰胺、50mg／ml慶大霉素。

條件4培養(yǎng)基：高糖DMEM、10%FBS、1%雙抗、0.1mmol／L β-巰基乙醇、10ng／ml HGF、10ng／ml EGF、10μg／ml胰島素、0.6mg／ml尼克酰胺、50mg／ml慶大霉素。

4 LEPCs的傳代培養(yǎng)

將LEPCs分別置于上述不同配方的培養(yǎng)基中，于37℃無菌條件下，在含95%的相對濕度、5%CO2恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每72～96h傳代1次，并于傳代過程中對細胞的狀態(tài)進行觀察。

5 Western blot檢測

裂解培養(yǎng)的LEPCs提取細胞總蛋白，測定所提取樣品蛋白質(zhì)的含量。取50μg蛋白質(zhì)95℃氣浴變性5min后立即置于冰上。將樣品置于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳2h，隨后利用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。在含5%脫脂奶粉的加入Tween-20 Tris鹽緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）中將膜封閉1h，用抗體稀釋液將肝細胞標志物白蛋白（albumin，ALB）、肝臟前體細胞標志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）和細胞角蛋白-19（cytokeratin-19，CK-19）［11］的第一抗體按照合適的稀釋比例進行稀釋（ALB和AFP按1∶800稀釋，CK-19的稀釋比例為1∶500），將膜放入其中后放置于搖床上4°C過夜。TBST漂洗3次，按1∶5000的比例將第二抗體稀釋后與膜室溫搖床孵育1h，TBST再次漂洗3次，化學發(fā)光顯色后于X線片上曝光，常規(guī)進行顯影定影。目的抗體雜交后用洗膜液洗膜后，再次將膜與GAPDH單克隆抗體（按1∶8000稀釋）孵育，作為實驗內(nèi)參。將顯影后X線片結(jié)果掃描，利用Image J軟件計算每個條帶的灰度值。將每個樣本的目的蛋白灰度值除以內(nèi)參照（GAPDH）的灰度值，得到每個樣本的目的蛋白相對含量，并以此比較不同樣本間的表達差異。

6 細胞周期的流式細胞術分析

按照Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit說明書進行操作，具體步驟如下：將培養(yǎng)的LEPCs消化后用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）收集制備單細胞懸液，加入75%乙醇固定，室溫以400g轉(zhuǎn)速離心5 min，棄掉上清，加入A溶液250μl，輕輕混合均勻后室溫放置10min；加入200μl溶液B混合均勻，室溫孵育10min，最后加入200μl碘化丙啶（PI）放置于冰上避光孵育10min后，用流式細胞儀檢測細胞周期。

7 肝前體細胞標志物表達的流式細胞術分析

將培養(yǎng)的LEPCs消化后用PBS收集制備單細胞懸液，加入肝臟前體細胞標志物上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）［12］和胚胎肝臟前體細胞標記物（δ-like 1 homologue，DLK1）［13］的流式抗體染色液，室溫避光孵育1h，同時設立同型陰性對照組，用PBS洗3次后，加入500μl PBS重懸細胞，用流式細胞儀檢測EpCAM和DLK1的表達。

8 免疫熒光檢測染色

選擇生長良好的細胞，用PBS洗去培養(yǎng)基后，4%多聚甲醛固定30min，0.5%Triton X-100輕搖通透細胞30min。加入正常山羊血清封閉液，輕搖封閉50 min。滴加兔抗小鼠EpCAM單克隆抗體（1∶150），4°C過夜。按1∶200稀釋比例加入Alexa Fluor?488標記的山羊抗兔IgG，37°C孵育1h。吸棄第二抗體后，用PBS輕搖清洗3次，每次10min。加入 DAPI染液室溫避光孵育30min，吸去染液，加入PBS，置于熒光顯微鏡下觀察。陰性對照組將第一抗體替換為PBS。

9 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0（Statistic Package for Social Science，SPSS）統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間采用t檢驗。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義，實驗至少重復3次。

結(jié) 果

1 條件4為LEPCs最佳傳代培養(yǎng)條件

圖1　應用4種不同培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)細胞的形態(tài)學觀察。箭示細胞表面突起及模糊的邊界；比例尺，50μmFig.1　Morphology of LEPCs in 4 different media during P0，P3 and P8.Arrows indicate cell surface protuberances and unclear boundaries；scale bar，50μm

為保證LEPCs在連續(xù)傳代的過程中可以保持良好的生長狀態(tài)及分化潛能，我們使用4種含不同物質(zhì)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，將第1代稱為P0，傳代后依次稱為P1、P2及P3等。在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中，觀察各培養(yǎng)條件對細胞形態(tài)的影響。結(jié)果顯示，條件1的培養(yǎng)效果最差，隨著傳代的進行，細胞邊界變得模糊，細胞形態(tài)更為扁平，細胞表面突起增加，傳代時間延長，意味著傳代后細胞與P0相比出現(xiàn)明顯變化，條件1無法作為LEPCs連續(xù)傳代培養(yǎng)的條件（圖1）。條件2培養(yǎng)基的配方來自于文獻中肝臟前體細胞的培養(yǎng)條件［9］。使用條件2后，細胞在P8代時形狀相對條件1更為規(guī)則，但與P0代細胞相比邊界出現(xiàn)模糊，傳代時間明顯增加，因此條件2仍不是最佳的選擇（圖1）。條件3培養(yǎng)基是根據(jù)已有的報道［14，15］加以改良而成。使用條件3培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細胞的生長狀態(tài)明顯好于條件2，但P8代時，細胞的形狀邊界與P0相比仍有一些變化，而且傳代時間也由72h延長至96h（圖1）。條件4培養(yǎng)基是在條件3的基礎上，將10-7mol／L地塞米松去除，并將尼克酰胺的含量由10ng／ml改為0.6mg／ml。使用條件4連續(xù)傳代培養(yǎng)后，P8代的細胞形狀仍如P0一樣規(guī)則，邊界清晰，且細胞的生長活力較好，傳代時間也沒有明顯改變（圖1）。因此后續(xù)的培養(yǎng)過程中均使用條件4的培養(yǎng)基配方。

2 條件4培養(yǎng)LEPCs細胞不改變細胞分子標志物的表達

為進一步明確條件4對LEPCs細胞狀態(tài)的影響，我們首先使用Western blot方法分別檢測P0、P3和P8LEPCs中肝細胞標志物ALB、肝前體細胞標志物AFP和CK-19蛋白質(zhì)表達量的變化情況。結(jié)果顯示，與P0代相比，P3代細胞中 ALB、AFP和 CK-19的蛋白質(zhì)表達量沒有發(fā)生明顯的改變，P8代顯示了相似的結(jié)果（圖2）。這些結(jié)果說明在條件4的培養(yǎng)條件下，LEPCs細胞沒有向肝臟細胞或膽管細胞進行分化，維持了細胞的分化潛能。

圖2　LEPCs連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中肝細胞標志物和肝前體細胞標志物表達的Western blot檢測。A，P0、P3和P8 LEPCs中AFP、ALB和CK-19表達的代表性Western blot；B至D，P0、P3和P8 LEPCs中AFP（B）、ALB（C）和CK-19（D）表達水平的統(tǒng)計學分析Fig.2　Western blot detection of the expression of ALB，AFP and CK-19 in LEPCs during serial passage.A，a representative Western blot result of ALB，AFP and CK-19 expression in P0，P3 and P8 LEPCs；B to D，statistical analysis of the expression levels of AFP（B），ALB（C）and CK-19（D） in P0，P3 and P8 LEPCs

為觀察條件4對連續(xù)傳代培養(yǎng)的LEPCs細胞的細胞周期的影響，我們進而應用流式細胞術分別分析了P0、P3和P8代細胞在細胞周期各時期的比例。結(jié)果顯示（圖3），P0代LEPCs細胞處于G0／G1期約77.7%，S＋G2／M期的細胞大約占22.3%，P3代及P8代各期細胞所占比例沒有明顯變化，說明連續(xù)傳代后LEPCs細胞仍具有較強的分裂增殖能力。

圖3　LEPCs連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中細胞周期的流式細胞術分析。A，P0、P3和P8 LEPCs代表性細胞周期；B，P0、P3和P8 LEPCs細胞周期的統(tǒng)計學分析Fig.3　Flow cytometry analysis of the cell cycle of LEPCs during serial passage.A，representative cell cycles of P0，P3 and P8 LEPCs；B，statistical analysis of the cell cycles of P0，P3 and P8 LEPCs

EpCAM（epithelial cell adhesion molecule）是一種上皮細胞黏附分子，參與調(diào)節(jié)細胞間的黏附，介導細胞間的信號轉(zhuǎn)導、并參與細胞的遷移、增殖與分化等過程，可作為肝臟前體細胞的標志分子［12］。將LEPCs連續(xù)傳代培養(yǎng)6個月后，利用流式細胞儀對LEPCs細胞的肝臟前體細胞標志物的表達進行了檢測。連續(xù)多次傳代后，EpCAM陽性細胞可占到總細胞數(shù)的89%（圖4）。在檢測EpCAM的同時，我們又對胚胎肝臟前體細胞的標志物DLK1的表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)DLK1的表達很低，陽性細胞僅占總細胞數(shù)的12%（圖4）。為驗證流式細胞術的結(jié)果，我們又應用免疫熒光的方法檢測了EpCAM在多次傳代的LEPCs細胞中的表達情況。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下可觀察到絕大多數(shù)細胞表面顯示綠色熒光，而陰性對照則沒有綠色熒光（圖5）。這些結(jié)果均說明，連續(xù)多次傳代培養(yǎng)的LEPCs仍保持良好的增殖能力和未分化狀態(tài)，也進一步表明條件4是一種比較理想的培養(yǎng)LEPCs的培養(yǎng)基。

圖4　肝前體細胞標志物在連續(xù)傳代6個月的　P8 LEPCs中表達的流式細胞術檢測Fig.4　Flow cytometry detection of hepatic progenitor cell markers in P8 LEPCs after serial passage for 6 months

圖5　EpCAM在連續(xù)傳代6個月的　P8 LEPCs中表達的免疫熒光檢測。比例尺，50μmFig.5　Immunofluorescent detection of EpCAM in P8 LEPCs after serial passage for 6 months.Scale bar，50μm

討 論

在長期的慢性肝臟疾病或急性的肝損傷情況下，位于門靜脈周圍的成體肝臟前體細胞即卵圓細胞可被激活［16］。激活后的卵圓細胞可進入肝小葉，并分化為肝細胞和膽管細胞，因此卵圓細胞是一種具有雙向分化潛能的干細胞［17，18］。研究成體肝臟前體細胞的重要意義除可以進行分化機制的研究，臨床治療的應用外，還寄希望于通過構(gòu)建組織支架，接種前體細胞生成新的器官并應用于移植中，但目前該領域的研究仍然在探索中［18］。應用成體肝臟前體細胞的基礎是分離得到前體細胞，并且在傳代培養(yǎng)過程中可以保持良好的狀態(tài)及分化潛能。雖然目前對成體肝臟前體細胞的培養(yǎng)條件已經(jīng)積累了一定的資料［19］，但由于長期傳代培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)條件相對比較苛刻，仍面臨著沒有相對統(tǒng)一標準的問題，在培養(yǎng)條件上仍然處于摸索的階段。

本實驗中所使用LEPCs是經(jīng)單細胞克隆培養(yǎng)所得到的一種類似于肝臟卵圓細胞的成體肝臟前體細胞［9］，具有雙向分化的潛能。我們在對LEPCs的連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基配方的不同會直接影響到LEPCs的生長狀態(tài)及分化潛能，因此探索其合適的培養(yǎng)條件對后續(xù)依賴于LEPCs的肝臟前體細胞分化機制及治療的研究具有十分重要的意義。本實驗配制了4種具有不同配方的培養(yǎng)基對LEPCs細胞進行連續(xù)的傳代培養(yǎng)。條件4在去除了條件3中的地塞米松，并增加了尼克酰胺的濃度后，使LEPCs細胞的狀態(tài)在連續(xù)傳代的過程中沒有發(fā)生明顯改變，而且肝臟前體細胞的標志物AFP始終維持著和P0代細胞相似的水平，同時成熟肝細胞的標志物ALB和膽管細胞的標記物CK-19的表達均未發(fā)生明顯的增加。尼克先酰胺與葡萄糖代謝相關，細胞培養(yǎng)時加入可顯著增加NAD＋的含量，促進ATP合成和能量代謝，更好的維護細胞的生長與繁殖。為進一步確認上述結(jié)果，我們延長了連續(xù)傳代的時間，在6個月后又分析了EpCAM的表達水平，發(fā)現(xiàn)表達Ep-CAM的細胞仍占了絕大多數(shù)。這些結(jié)果意味著LEPCs在條件4培養(yǎng)下，可以一直維持增殖狀態(tài)，而且保持了良好的分化潛能。

DLK1又稱為脂肪前體細胞因子1（preadipocyte factor 1，Pref-1），具有抑制脂肪前體細胞分化的作用。內(nèi)胚層起源的肝臟前體細胞中有DLK1的表達，因此可以將其看作為胚胎肝臟前體細胞的標記物［13］。我們也通過流式細胞分析檢測了連續(xù)傳代后LEPCs中DLK1的表達情況，發(fā)現(xiàn)DLK1的表達水平很低，僅有約11%的細胞表達DLK1，這也說明了成體來源的前體細胞與胚胎來源的前體細胞在蛋白表達水平上的差別，也意味著其分化機制及可塑性具有一定的區(qū)別。

本實驗確定了LEPCs細胞合適的培養(yǎng)條件，為LEPCs細胞相關的研究奠定了基礎。

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Exploration of the optimal culture conditions for adult mouse hepatic progenitor cells

Wang Fei,Dong Lingyue,An Wei*
（Department of Cell Biology；Municipal Key laboratory for Liver Protection and Regulation of Regeneration，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective To establish a specific formula of culture condition for mouse hepatic progenitor cells and identify whether the cells can be maintained in good condition and kept from differentiation during serial passage under this condition.Methods Four different types of media were prepared.The optimal medium was determined based on the morphological changes during serial passage. Expression levels of hepatic marker albumin(ALB),hepatic progenitor cell marker alpha-fetoprotein(AFP),and bile duct epithelium marker cytokeratin-19(CK-19)were detected by Western blot.The cell cycle was analyzed by flow cytometry,and the expression of progenitor cell markers was verified by immunofluorescent staining to further assess the effectiveness of the selected culture medium. Results Cells in the 4th culture medium grew energetically with regular shapes and clear boundaries,and no obvious change in morphology was observed after serial passage.Western blot revealed that ALB,AFP,and CK-19 were expressed stably in P0,P3 and P8 cells.Flow cytometry results showed that after serial passage,about 76%of the cells were in G0／G1 stage and approximately 24%of the cells were in S＋G2／M stage,while 89%of the cells expressed epithelial cell adhesion molecule(EpCAM),a typical hepatic progenitor cell marker.The expression of EpCAM was further confirmed by immunofluorescent staining.Conclusion A specific formula of medium for serial passage of adult mouse hepatic progenitor cells has been established,which provides preconditions for further study of the mechanism of hepatic progenitor cells growth and regenerative medicine.

Adult mouse hepatic progenitor cells；serial passage；plasticity；culture condition

Q253

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.013

2016-06-10

2016-09-20

國家自然科學基金（31371169）

王飛，男（1984年），漢，碩士研究生

（To whom correspondence should be addressed）：anwei＠ccmu.edu.cn