王小柱

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧　沈陽　110003）

雞肉組織中磺胺氯達嗪鈉的高效液相色譜法檢測

王小柱

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧沈陽110003）

本試驗通過引入磺胺嘧啶鈉、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺氯吡嗪等7種磺胺藥與磺胺氯達嗪鈉進行高效液相色譜殘留對比分析，建立了一種在雞肉組織中磺胺氯達嗪鈉的高效液相色譜檢測法。這對控制雞肉組織中磺胺類藥物殘留、保障人類健康具有重要意義。

磺胺氯達嗪鈉；雞肉組織；高效液相色譜法；檢測

磺胺類藥物（Sul fonamides，Sas）是指具有對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱，主要用于預防和治療細菌感染性疾病的化學治療，對危害家禽的某些原蟲也有作用。但磺胺類藥物在服用后可引起惡心、嘔吐、頭暈、全身無力等不良反應，易在腎小管、腎盂、輸尿管、膀胱等處形成結晶，引起腰痛、血尿、尿路阻塞等，長期服用甚至可以形成結石。駕駛員、高空作業(yè)者等群體更需慎服。

磺胺類藥物在體內代謝緩慢，因此，磺胺類藥物的殘留也日益引起人們對食物安全的關注。食物中磺胺類藥物的殘留可引起過敏性體質人的過敏反應，使病原菌產(chǎn)生抗藥性等，因此，許多國家對食品中磺胺類藥物的最大殘留量作了嚴格的限定，如歐洲和美國肉類產(chǎn)品的最大殘留量為100 ng/g，牛奶中為10 ng/g[1]。

雞肉是磺胺類藥物殘留的靶組織，研究雞肉組織中磺胺類藥物殘留分析方法對其殘留的監(jiān)控具有重要的價值。目前對于SAs殘留分析的報道很多，主要是各種高效液相色譜法（HPLC），采用恒溶劑或梯度分離的方式，通過直接紫外法（UV）、熒光衍生化法或比色法進行檢測，這些方法通常需要多個液-液分配（LLF）、濃縮等步驟[2]，操作比較復雜，并且針對雞肉組織樣品的殘留分析資料較少。本試驗選擇國內較常見的7種磺胺類藥物與磺胺氯噠嗪鈉作為比照對象[3]，以堿性氧化鋁柱固相萃?。⊿PE）和恒溶劑洗脫HPLC為基礎[4]，建立了雞肉組織中的磺胺氯噠嗪鈉的殘留分析方法，對控制雞肉組織中該藥的殘留、保證雞肉的正常出口、保障人類身體健康具有重要意義。

1　材料與方法

1.1試驗材料雞肉樣品由沈陽市商檢所提供，4℃保存待用。

1.2試驗方法

1.2.1色譜條件色譜柱：C18柱，250㎜×4.6㎜i.d.

流動相：乙腈-磷酸（0.017 mol/L）（20+80）

流速：1.0 mL/min

檢測波長：270 nm

進樣量：20μL

保留時間：14.653～15.128 min

1.2.2標準溶液的制備

1.2.2.1磺胺嘧啶鈉準確稱取將磺胺嘧啶鈉標準品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容、搖勻，作為儲備液。C=105ng/mL。

1.2.2.2磺胺二甲基嘧啶準確稱取將磺胺二甲基嘧啶標準品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻。作為儲備液。C=105ng/mL。

1.2.2.3磺胺間甲氧嘧啶準確稱取將磺胺間甲氧嘧啶標準品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻。作為儲備液。C=105ng/mL。

1.2.2.4磺胺甲惡唑準確稱取將磺胺甲惡唑標準品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻。作為儲備液。C=105ng/mL。

1.2.2.5磺胺二甲氧嘧啶準確稱取將磺胺二甲氧嘧啶標準品10 mg，放入100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻。作為儲備液。C=105ng/mL。

1.2.2.6磺胺喹惡啉準確稱取將磺胺喹惡啉標準品10 mg，放入100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻。作為儲備液。C=105ng/mL。

1.2.2.7磺胺氯吡嗪準確稱取將磺胺氯吡嗪標準品10 mg，放入100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻。作為儲備液。C=105ng/mL。

1.2.2.8磺胺氯達嗪鈉準確稱取將磺胺氯達嗪標準品10 mg，放入100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻。作為儲備液。C=105ng/mL。

1.2.2.98種藥物的混合液從已配制好的上述8種溶液各吸取1 mL置于100 mL容量瓶中，用流動相溶解，定容，搖勻。

1.2.3樣品處理將雞肉組織解凍、絞碎，用分析天平準確稱取雞肉組織5.0 g，量取乙腈25 mL，加入4.0 g無水硫酸鈉，一起置于勻漿杯中，用玻璃棒攪拌。勻漿機勻漿后，將樣液倒入50 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min；將分離后的殘渣再用25 mL乙腈處理，玻璃棒攪拌，振蕩10 min后，3 000 r/min離心5 min；合并兩次上清液置于分液漏斗中，加入正己烷30 mL，同向手動振蕩10 min后，取下層液體，置于旋轉蒸發(fā)瓶中，再加入正丙醇10 mL，在54℃下用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，殘留物用3 mL 95%的乙腈溶解。搖動1 min后，過Sep-Pak氧化鋁柱（需預先用95%的乙腈10 mL平衡柱體），殘留物再加95%的乙腈5 mL溶解，搖動1 min后過柱，不收集樣液。用70%的乙腈10 mL洗脫，收集洗脫液并加入5 mL正丙醇。于54℃條件下用旋轉蒸發(fā)儀濃縮干燥。殘留物用2 mL已超聲過的流動相溶解，溶解后的液體用帶過濾膜的注射器收集。所制樣液用高效液相色譜儀進行檢測。

1.3標準曲線

1.3.1繪制標準曲線的原理由磺胺氯達嗪鈉的系列濃度與圖譜顯示的峰面積繪制標準曲線，濃度與峰面積成正向關系（線性關系）。本試驗的藥物添加濃度在標準曲線線性范圍之內，說明本試驗方法可行。

1.3.2儲備液的稀釋及進樣稀釋過程

1.3.2.1磺胺氯達嗪鈉C=500 ng/mL的配置從磺胺氯達嗪的原液中用刻度吸管各吸取1 mL放入200 mL容量瓶中，用流動相溶解，搖勻，定容至刻度。所得樣液為所要稀釋的濃度。

1.3.2.2磺胺氯達嗪鈉C=400 ng/mL的配置從磺胺氯達嗪的原液中用刻度吸管各吸取1 mL放入250 mL容量瓶中，用流動相溶解，搖勻，定容至刻度。

1.3.2.3磺胺氯達嗪鈉C=200 ng/mL的配置從C=400 ng/mL的容量瓶中，用25 mL的移液管吸取25 mL的溶液放到50 mL的容量瓶中，用流動相溶解，搖勻，定容至刻度。

1.3.2.4磺胺氯達嗪鈉C=100 ng/mL的配置從C=500 ng/mL的容量瓶中，吸取5 mL的溶液置于25 mL容量瓶中，用流動相溶解，搖勻，定容至刻度。

1.3.2.5磺胺氯達嗪鈉C=50 ng/mL的配置從C= 500 ng/mL的容量瓶中，吸取5 mL溶液置于50 mL容量瓶中，用流動相溶解，搖勻，定容至刻度

1.3.2.6磺胺氯達嗪鈉C=20 ng/mL的配置從C= 400 ng/mL的容量瓶中，吸取5 mL的溶液置于100 mL的容量瓶中，用流動相溶解，搖勻，定容至刻度。

1.3.2.7磺胺氯達嗪鈉C=10 ng/mL的配置從C= 500 ng/mL的容量瓶中，吸取1 mL的溶液置于50 mL的容量瓶中，用流動相溶解，搖勻，定容至刻度。

1.3.3標準曲線的繪制根據(jù)磺胺氯達嗪鈉的系列濃度與相應圖譜的峰面積（S）確定標準曲線，建立回歸方程。

1.4樣品添加回收率的測定按照樣品處理方法進行制備樣液，用高效液相色譜儀進行檢測。在0.05～0.5 mg/kg添加濃度范圍內，每個濃度梯度的樣品設置5次重復。

1.5變異系數(shù)的測定將空白組織中添加磺胺氯達嗪鈉（濃度為500 ng/mL）標準品，按此濃度的50%、100%、200%添加，按標準各測定3次（每次5個平行），由測出的回收率進行檢測其變異系數(shù)，變異系數(shù)=標準差/平均數(shù)×100%。

2　結果與分析

2.188種藥物標準溶液的色譜檢測結果8種藥物混合標準液經(jīng)高液相色譜儀檢測，圖譜顯示，磺胺氯達嗪鈉與其他7種磺胺類藥物的圖譜峰形互不重疊（圖1）。說明磺胺氯達嗪鈉與其他7種磺胺類藥物的添加可以明顯區(qū)分，各藥物互不干擾。

圖1　8種藥物的混合液的色譜圖Fig.1　Chromatogram o f 8 kinds o f drug m ixtures

藥物保留時間順序：磺胺嘧啶鈉；磺胺二甲基嘧啶；磺胺間甲氧嘧啶；磺胺氯達嗪鈉；磺胺甲惡唑；磺胺氯吡嗪；磺胺二甲氧嘧啶；磺胺喹惡啉。

藥物保留時間：磺胺嘧啶鈉5.550 min；磺胺二甲基嘧啶7.275 min；磺胺間甲氧嘧啶12.453 min；磺胺氯達嗪鈉15.128 min；磺胺甲惡唑19.840 min；磺胺氯吡嗪35.607 min；磺胺二甲氧嘧啶38.143 min；磺胺喹惡啉41.445 min。

2.2線性回歸方程根據(jù)磺胺氯達嗪的系列濃度與相應圖譜的峰面積確定標準曲線，建立回歸方程（表1）。

2.3樣品添加回收率與相關數(shù)據(jù)的結果分為添加樣和陰性樣（不含磺胺氯達嗪鈉）兩組，在陰性樣中按50%、100%、200%添加磺胺氯達嗪鈉對照品，按標準各測定3次（每次5個平行）（表2）?；前仿冗_嗪鈉的平均回收率在55.0%～81.3%之間，陰性樣響應值為0，說明其組織成分無干擾，方法可行。

按照檢測限的定義，磺胺氯噠嗪鈉的檢測限為0.005 mg/kg，定量限低于0.01 mg/kg，50%濃度添加的變異系數(shù)（RSD）為4.17%～7.35%，100%濃度添加的變異系數(shù)為4.60%～7.96%，200%濃度添加的變異系數(shù)為2.32%～7.28%。

表1　回歸方程及相關系數(shù)Table1　The regression equation and correlation coe fficient

表2　回收率結果Table2　Recovery results

3　討論

3.1樣品的選取空白雞肉組織的選取對試驗的成功起重要的作用。如果雞肉組織中含有磺胺類藥物，那么試驗得出的圖譜就無法進行有效區(qū)分。故而在添加藥物之前，必須確保雞肉空白樣品不含有任何磺胺類藥物，以免影響試驗結果。

3.2樣品處理方法SAs屬于堿性兩性藥物，主要呈弱酸性，等電點范圍為pH 3～5，極性較高，一般采用極性溶劑提取和堿性溶液與溶劑反萃取凈化的方法處理樣品。曾用氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯做提取溶劑，0.1 mol/L氫氧化鈉和溶劑反萃取凈化，但大部分參試的SAs回收率低（低于60%），并且樣品干擾和乳化嚴重。

3.3測定方法的選擇食用畜產(chǎn)品中磺胺藥物殘留的分析檢測方法有多種，包括滴定法[5]、氣相色譜[6]、液相色譜、毛細管電泳[7]及生物分析方法[8]等，最常用的是液相色譜法，液相色譜常用的檢測方法有紫外吸收[9]、熒光[10]、電化學檢測[11]及質譜法[12]等方法。最終試驗選擇HPLC法。HPLC是SAs最常用、最方便的測定方法。采用C18柱分離和直接紫外法檢測。試驗表明，該方法同樣適合腸衣、肝、腎中磺胺類藥物殘留量的測定，如改變色譜分離條件，該方法可推廣應用到磺胺間氧噠嗪等其他磺胺類藥物殘留量的檢測。

3.4流動相的選擇根據(jù)SAs的理化性質，有機溶劑和pH都對SAs的保留有重要的影響。為便SAs獲得有效保留和分離，并且防止固定相表面殘余的硅醇基導致SAs色譜峰脫尾，一般采用酸性流動相（離子抑制）。8種磺胺類藥物的出峰順序和保留時間依次為：磺胺嘧啶鈉、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯達嗪鈉、磺胺甲惡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹惡啉。

3.5檢測波長的選擇利用二極管陣列檢測器檢測，得到8種成分的吸收光譜圖，判斷出各成分的最大吸收波長，為了兼顧8種成分的同時測定，選擇紫外檢測法進行檢測，檢測波長為270 nm，利用保留時間進行定性。

4　結論

4.1本試驗建立了雞肉組織中磺胺氯達嗪鈉的提取、凈化方法。

4.2本試驗建立了雞肉組織中磺胺氯達嗪鈉的HPLC法色譜條件；色譜柱為C18柱（250㎜×4.6㎜ i. d）、流動相為乙腈-磷酸（0.017 mol/L）（20+80）、流速為1.0 mL/min、檢測波長270 nm、進樣量20μL，保留時間為14.653～15.128 min。

4.3本試驗建立的雞肉組織中磺胺氯達嗪鈉的HPLC檢測法最低檢測限為0.005 mg/kg，定量限低于0.01 mg/kg，變異系數(shù)為2.32%～7.96%。此法適用于磺胺類藥物的殘留檢測，并為磺胺類藥物殘留檢測的進一步研究奠定了基礎。

[1]王向勇，張磊，李敬光.持久性有機污染物膳食攝入的研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2014，5（2）：438-444.

[2]吳景，刑書霞，曹進.食品中維生素檢測技術進展[J].食品安全質量檢測學報，2015，6（8）：2882-2889.

[3]李曉雯，遲秋池，夏蘇捷，等.高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法檢測豬肉中22種磺胺類獸藥殘留[J].食品安全質量檢測學報，2015，6（5）：1736-1742.

[4]段語暉，衛(wèi)引茂.基于新型硼酸固相萃取柱的多巴胺色譜分析方法[J].分析化學研究報告，2013，41（3）：406-411.

[5]李潤豐，趙希艷，高亞弟.2，6-二氯靛酚反滴定法測定紅色早疏中紅色還原型VC[J].營養(yǎng)學報，2012，34（5）：507-509.

[6]王建玲，候學會，王國慶.氣相色譜-質譜聯(lián)用法在食品安全分析中的應用[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（8）：110-114.

[7]董亞蕾，陳曉佼，胡敬，等.高效毛細管電泳在食品安全檢測中的應用的進展[J].色譜，2012，30（11）：1117-1126.

[8]劉斌，張印兵，岑小波.生物分析方法驗證在藥物非臨床評價中的應用[J].中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（3）：480-485.

[9]韋日偉，王昆，吳先富，等.藥物中有關物質檢測方法的研究進展及應用[J].中國藥師，2015，18（5）：851-855.

[10]于長泳.IBV熒光定量PCR檢測方法的建立及對感染雞體內病毒的檢測[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014，12：1-6.

[11]蘭小淞，呂延成.碳納米管技術在食品安全檢測中的應用進展[J].食品科學，2014，35（21）：344-349.

[12]劉凱，王麗那，李建忠.飼料和雞肉中利巴韋林的測定——超高效液相色譜—串聯(lián)質譜法[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014，5：15-19.

Detection of Sulfachloropyridazine sodium in Chicken tissues w ith established HPLC

Wang Xiaozhu
(Liaoning Institute of safety supervision for animal products,LiaoningShenyang110003)

In this experiment,with the residual comparison of 7 kinds of sul fa drugs：sul fadiazine,sul famethazine,sul famonomethoxine,sul famethoxazole,sul fadimethoxine,sul faquinoxaline, sul faclozines with sul fachloropyridazine sodium,we establ ished a new HPLC method to detect the residual of Sul fachloropyridazine sodium in chicken tissues.This method could have a signi f icant impor tance in the detection of Sul fachloropyridazine sodium residual and protection of human heal th.

Sul fachloropyridazine sodium;Chicken tissues;HPLC;Detection

O657.1

B

1672-9692(2016)02-0010-05

2015-12-23

王小柱（1983-），男，遼寧遼陽人，碩士研究生，中級畜牧師，主要從事飼料、獸藥、畜產(chǎn)品安全監(jiān)督執(zhí)法工作。