肝癌患者血清和組織中prohibitin的表達(dá)及其臨床意義

石娟娟 楊寧 吳鳳萍 楊穎 李梅 張欣 賈曉黎 尹佳鋒 黨雙鎖

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·論 著·

肝癌患者血清和組織中prohibitin的表達(dá)及其臨床意義

石娟娟 楊寧 吳鳳萍 楊穎 李梅 張欣 賈曉黎 尹佳鋒 黨雙鎖

目的 研究抑制素prohibitin(PHB)在肝癌患者血清和組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)肝癌患者和健康人各82例血清PHB濃度。應(yīng)用RT-PCR和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)PHB在30例肝癌患者組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)水平。同時(shí)，收集肝癌患者的臨床資料，分析PHB表達(dá)與各臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果 PHB在肝癌患者和健康人血清中濃度分別為227.97 pg/mL和55.78 pg/mL，肝癌患者血清PHB濃度明顯高于健康人(Z=-4.532，P=0.000)；肝癌患者血清中的PHB濃度與ALT、TBil、AFP呈正相關(guān)(r=0.337，P=0.034；r=0.431，P=0.006；r=0.319，P=0.045)。在肝癌組織和癌旁組織中PHB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.3%和86.7%，與正常肝組織(6.7%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在肝癌組織和癌旁組織中PHB mRNA的表達(dá)較正常組織亦明顯升高；肝癌組織中PHB表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期和AFP含量相關(guān)，即腫瘤低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期、AFP≥400 μg/L的腫瘤組織中PHB表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 PHB在肝癌患者血清和組織中均高表達(dá)，分別與肝臟損傷的程度和HCC惡性程度相關(guān)，提示PHB可能參與HCC的發(fā)生和發(fā)展。

抑制素；肝細(xì)胞性肝癌；甲胎蛋白；血清；組織

抑制素(prohibitin，PHB)是重要的細(xì)胞膜蛋白超家族成員之一，廣泛高表達(dá)于多種腫瘤組織中，參與抑制細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等諸多細(xì)胞生命活動(dòng)[1, 2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，PHB在一些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，如肝癌、胃腸癌、胰腺癌、子宮頸癌、前列腺癌等[3-7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PHB在人肝癌細(xì)胞株Huh 7和SMMC-7721中均有表達(dá)且在SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)量較高[8]，提示PHB可能和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。因此，本研究通過檢測(cè)肝癌患者血清中PHB的表達(dá)水平，探討PHB在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的臨床意義。

資料和方法

一、研究對(duì)象

血清標(biāo)本為2015年3月至2016年3月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科住院肝癌患者82例，其中男63例，女19例，平均年齡(48.4±13.3)歲，排除術(shù)前進(jìn)行過抗腫瘤治療或有其他惡性腫瘤證據(jù)的患者。健康對(duì)照者82例來自健康體檢部，其中男59例，女23例，平均年齡(46.8±11.4)歲。組織標(biāo)本為2013年11月至2015年10月普外科住院的肝癌患者30例，其中男21例，女9例，平均年齡(50.5±14.3)歲；均經(jīng)過兩名病理學(xué)家進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估證實(shí)，排除術(shù)前進(jìn)行過抗腫瘤治療或有其他惡性腫瘤證據(jù)的患者。選出最具代表性的腫瘤組織和癌旁組織，同一患者的非腫瘤性肝組織標(biāo)本作為陰性對(duì)照。該研究經(jīng)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，標(biāo)本收集取得患者本人或家屬同意。

二、主要試劑與儀器

prohibitin酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R&D systems，美國(guó))；E.Z.N.A.○RTotal RNA Kits(Omega，美國(guó))；AMV Reverse Transcriptase (RT) kit，SYBR○RPremix ExTaqⅡkit(TAKARA，日本)；兔抗prohibitin蛋白抗體(Santa，美國(guó))；羊抗兔二抗(ABGENT，美國(guó))。實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))、普通倒置顯微鏡(Nikon，日本)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國(guó))等。

三、肝功能和AFP的檢測(cè)

肝功能檢查采用全自動(dòng)生化分析儀(日立7170型，日本)，AFP采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

四、ELISA法檢測(cè)血清PHB的含量

采用prohibitin酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，同時(shí)設(shè)三個(gè)復(fù)孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；同時(shí)設(shè)置空白孔，空白孔加入50 μL樣本稀釋液。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體100 μL，37 ℃恒溫箱孵育60 min。棄去液體，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔再加入終止液50 μL，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值(pg/mL)。

五、實(shí)時(shí)定量PCR

采用E.Z.N.A.○RTotal RNA Kits說明書提取組織總RNA；按AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；按SYBR○RPremix ExTaqⅡ kit實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，以GAPDH做內(nèi)參。25 μL反應(yīng)體系為12.5 μL 2×SYBR ExTaqⅡ、2 μL cDNA、1 μL上游引物(10 μmol)、1 μL下游引物(10 μmol)、8.5 μL無RNA酶水。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40次循環(huán)。按ΔΔCT=2-(Ct目的基因-Ct GAPDH)計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。PHB上游引物：5′-CGTAATGTGCCAGTCATCA-3′，PHB下游引物5′-AGTTCTCCAGCATCAAAGC-3′。GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH下游引物5′-TGGTGAAGACGC AGTGGA-3′。

六、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中PHB的表達(dá)

手術(shù)切除標(biāo)本離體后均立即取材，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚的連續(xù)切片。具體操作步驟：放置組織切片于烤箱，68 ℃ 20 min；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；采用0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液高溫抗原熱修復(fù)15 min，冷卻至室溫；3% H2O237 ℃孵育20 min以阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶；正常羊血清工作液封閉30 min；依次滴加一抗4 ℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育20 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥，封片；倒置顯微鏡觀察并拍照。染色結(jié)果判定，由兩名病理學(xué)家進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估。在顯微鏡下，隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù))和染色強(qiáng)度，根據(jù)兩者進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比率<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；兩項(xiàng)結(jié)果相加≥3分為陽(yáng)性。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用W檢驗(yàn) (Shapiro-Wilk) 檢測(cè)數(shù)據(jù)正態(tài)性；偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示。組間差異性比較采用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PHB在肝癌患者血清中的表達(dá)情況

經(jīng)ELISA法檢測(cè)可知，原發(fā)性肝癌患者血清PHB含量為227.97(36.99～ 639.83)pg/mL，健康人血清含量為55.78(26.06～70.30)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.532，P=0.000)。

二、PHB在肝癌患者血清中的含量與臨床資料的關(guān)系

肝癌患者血清中的PHB濃度與患者年齡、性別、AST、γ-GT、ALP均無相關(guān)性，而與ALT、TBil、AFP具有相關(guān)性(P<0.05)，并且呈正相關(guān)，即肝癌患者ALT、TBil、AFP值越高，PHB濃度越高，見表1。

三、PHB在肝癌患者組織中的表達(dá)情況

PHB在各組肝組織中均有表達(dá)，主要表達(dá)與胞質(zhì)和胞核中，隨表達(dá)強(qiáng)度不同，可依次表現(xiàn)為淡黃、棕黃至棕褐色不等，散在或團(tuán)簇狀分布(見圖1A)。在肝癌組織和癌旁組織中PHB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.3%和86.7%，與正常肝組織(6.7%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。同時(shí)，在肝癌組織和癌旁組織中PHB mRNA的表達(dá)較正常組織明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1B。

表1 肝癌患者血清中PHB含量與臨床資料相關(guān)性分析

注：ALT：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，AST：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶， TBil：總膽紅素，γ-GT：谷酰轉(zhuǎn)肽酶， ALP：堿性磷酸酶，AFP：甲胎蛋白

四、PHB在肝癌患者組織中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

PHB在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、肝外是否轉(zhuǎn)移、門靜脈是否存在癌栓均無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而PHB表達(dá)與肝癌患者的腫瘤分化程度、TNM分期和AFP含量相關(guān)，即腫瘤低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期、AFP≥ 400 μg/L的腫瘤組織中PHB表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

圖1 PHB在肝癌患者組織中的表達(dá)情況

組別例數(shù)PHB蛋白(例,%)+-χ2值P值正常肝組織302(6.7)28(93.3)癌旁組織 3022(73.3)8(26.7)30.2400.000肝癌組織 3026(86.7)4(13.3)38.5710.000

表3 肝癌患者肝臟組織中PHB含量

討 論

蛋白質(zhì)是機(jī)體生物功能的主要承擔(dān)者，任何疾病發(fā)生發(fā)展過程中表達(dá)異常的蛋白一定與該疾病的致病機(jī)制之間存在著某種聯(lián)系。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，組織蛋白的異常表達(dá)的作用不容忽視[9]。因此，尋找表達(dá)異常的蛋白并研究其功能是探索肝癌致病機(jī)制的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在各種腫瘤中PHB蛋白表達(dá)異常，引起了廣泛關(guān)注。研究顯示，PHB基因敲除會(huì)抑制人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5凋亡和擴(kuò)散，其作用機(jī)制依賴于NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；同時(shí)發(fā)現(xiàn)PHB在維護(hù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化表型和浸潤(rùn)表型中扮演著重要的角色[10]。PHB在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC97-H中高表達(dá)，高表達(dá)的PHB進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖和增加腫瘤細(xì)胞遷移性[11]。進(jìn)而提示PHB可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展以及發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。但是，目前PHB作為一種潛在的抑制腫瘤增殖的基因在肝癌患者血清和組織中的mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況研究鮮見，尚缺少足夠的臨床證據(jù)。本研究通過檢測(cè)肝癌患者的血清和組織中PHB的表達(dá)以及分析其與臨床參數(shù)相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清PHB濃度明顯高于正常人，并且與ALT、TBil、AFP均呈正相關(guān)，即肝癌患者ALT、TBil、AFP值越高，PHB濃度越高，提示PHB可能與肝臟損傷的程度相關(guān)，肝損傷越重，PHB濃度越高。這與Ren等[12]的研究相似，其研究結(jié)果顯示通過采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)PHB在胃癌患者血清組織中表達(dá)顯著增高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PHB mRNA和蛋白在肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)均高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PHB mRNA與其蛋白的變化在這三種肝組織間相一致，表明PHB蛋白變化是因?yàn)镻HB基因轉(zhuǎn)錄變化的結(jié)果。進(jìn)而證實(shí)PHB在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展。Kang等[13]研究顯示，與癌旁正常組織比較，胃癌組織PHB mRNA和蛋白水平顯著升高，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。作者推測(cè)PHB表達(dá)水平亦可能與肝癌惡性程度相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中PHB表達(dá)水平與肝癌的腫瘤分化程度、TNM分期和AFP含量相關(guān)，即腫瘤低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期、AFP≥ 400 μg/L的腫瘤組織中PHB表達(dá)明顯升高，提示PHB表達(dá)水平與肝癌惡性程度相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝癌患者的血清和組織中PHB的表達(dá)均上調(diào)，證實(shí)了PHB可能參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展。而血清中PHB表達(dá)與ALT、TBil、AFP均呈正相關(guān)，組織中PHB表達(dá)與肝癌的腫瘤分化程度、TNM分期和AFP含量相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了PHB的表達(dá)水平可能與肝臟損傷的程度和肝癌惡性程度相關(guān)。本研究為PHB參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展提供了一定的基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是PHB在肝癌發(fā)生發(fā)展中具體的作用機(jī)制尚不清楚，尚需要進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯：錢燕)

Clinical significances and expressions of prohibitin in patients with hepatocellular carcinoma

SHIJuan-juan,YANGNing,WUFeng-ping,YANGYing,LIMei,ZHANGXin,JIAXiao-li,YINJia-feng,DANGShuang-suo.

DepartmentofInfectiousDiseases,theSecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China

Correspondingauthor:DANGShuang-suo,Email:dang212@126.com

Objective To investigate serum and tissue expressions and the clinical significances of prohibitin in patients with hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Serum PHB levels in 82 HCC patients and 82 healthy individuals were determined by ELISA assay. The expression of PHB in the 30 pairs of HCC tissues, paracancerous tissues and normal tissues were detected by real-time PCR and immunohistochemistry assay. The clinical data were collected to determine the correlation between PHB and clinical features. Results Serum PHB protein level in HCC patients was significantly increased when compared with healthy individuals group (227.97 vs. 55.78 pg/mL, Z= -4.532,P=0.000). The expression of PHB in HCC patients had positive correlation with alanine aminotransferase (ALT,r=0.337,P=0.034), total bilirubin (TBil,r=0.431,P=0.006) and AFP (r=0.319,P=0.045). The positive rate of PHB in HCC tissues and paracancerous tissues were 73.3% and 86.7% that were significantly higher than that of the normal tissues, respectively. The PHB mRNA expression in HCC tissues and paracancerous tissues were also higher than that of the normal tissues. The expression of PHB in HCC patients had correlation with differentiation grade, TNM stage and AFP. Conclusion PHB is overexpressed in HCC patients tissues and serum and correlated with the degree of liver injury and tumor malignancy, indicating that PHB may be involved in the occurrence and progression of HCC.

Prohibitin; Hepatocellular carcinoma; AFP; Serum; Tissue

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31500650)

710004 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科(石娟娟，楊寧，吳鳳萍，楊穎，李梅，張欣，賈曉黎，黨雙鎖)，檢驗(yàn)科(尹佳鋒)

黨雙鎖，Email: dang212@126.com

2016-08-12)