馬儒林，張舜，李蓓，楊露，張瀟，汪超，李佩，夏濤，王愛國,*

1. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，武漢 430030 2. 環(huán)境與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地--湖北省環(huán)境衛(wèi)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢)，武漢 430030 3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，石河子 832000

?

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡在PBDE-47致大鼠海馬損傷中的作用

馬儒林1,2,3，張舜1,2，李蓓1,2，楊露1,2，張瀟1,2，汪超1,2，李佩1,2，夏濤1,2，王愛國1,2,*

1. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，武漢 430030 2. 環(huán)境與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地--湖北省環(huán)境衛(wèi)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢)，武漢 430030 3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，石河子 832000

為了明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)介導(dǎo)的凋亡在2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenylether, PBDE-47)致大鼠神經(jīng)毒性中的作用，在腦發(fā)育的突增期(出生第10天)，分別用0 mg·kg-1、1 mg·kg-1、5 mg·kg-1和10 mg·kg-1PBDE-47進(jìn)行單次灌胃染毒，并從出生第8天開始每天給予150 mg·kg-1ERS抑制劑4-苯基丁酸(phenylbutyric acid, PBA)，持續(xù)3周。仔鼠出生第8周末，從對照組、10 mg·kg-1PBDE-47處理組、150 mg·kg-1PBA處理組和150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE處理組中隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。然后將所有動物斷頭處死，分離大鼠海馬組織，觀察其海馬組織形態(tài)學(xué)改變、測定ERS標(biāo)志分子(GRP78、IRE1和CHOP)和凋亡相關(guān)蛋白Cyt c的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，10 mg·kg-1PBDE-47處理可導(dǎo)致雌性大鼠海馬CA4區(qū)細(xì)胞排列紊亂、錐形神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少甚至消失，尼氏小體數(shù)量減少，大鼠逃避潛伏期延長(P < 0.05)。5和10 mg·kg-1PBDE-47處理可顯著上調(diào)ERS相關(guān)蛋白IRE1和CHOP的表達(dá)水平(P < 0.05)，并明顯增強(qiáng)海馬組織凋亡相關(guān)蛋白Cyt c的表達(dá)。PBA干預(yù)可明顯降低PBDE-47誘導(dǎo)的IRE1和CHOP以及Cyt c蛋白的表達(dá)水平，提示PBDE-47可通過ERS介導(dǎo)凋亡，導(dǎo)致大鼠海馬組織損傷，從而影響大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚；雌性SD大鼠；神經(jīng)毒性；海馬損傷；水迷宮實(shí)驗(yàn)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；凋亡

Received 30 November 2015 accepted 5 April 2016

2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenylether, PBDE-47)是溴代阻燃劑多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)在環(huán)境介質(zhì)中最常見、毒性最強(qiáng)的同系物之一[1]，目前在土壤、空氣及人體脂肪、血清、乳汁和胎盤組織等環(huán)境介質(zhì)中均檢測到其存在[2]。PBDE-47進(jìn)入機(jī)體后對其靶部位如甲狀腺、脂肪組織、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等均可產(chǎn)生損害[3]。已有研究證實(shí)在大腦發(fā)育突增期PBDE-47暴露可導(dǎo)致大鼠和小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受損，表現(xiàn)為成年后學(xué)習(xí)記憶能力下降、自主活動增多等[4]，但其機(jī)制尚未完全闡明。

包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的多種刺激均可造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)紊亂，從而導(dǎo)致未折疊蛋白/錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)，但機(jī)體可通過未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)防御ERS的有害作用。然而，當(dāng)ERS持續(xù)時(shí)間過長或UPR適應(yīng)功能不足，嚴(yán)重或慢性的UPR活化會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBDE-47可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y凋亡水平升高[6-7]，而且PBDE-47可以激活SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生UPR[8]?；谇捌趯?shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇在大腦發(fā)育突增期(出生第10天)對大鼠進(jìn)行一次性PBDE-47灌胃染毒，構(gòu)建PBDE-47發(fā)育期暴露的大鼠模型[1]并用ERS抑制劑4-苯基丁酸(phenylbutyric acid, PBA)進(jìn)行干預(yù)[9]，觀察PBDE-47對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用及其對海馬組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cyt c和ERS標(biāo)志分子(GRP78、IRE1和CHOP)表達(dá)水平的影響，以期探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性中的作用，為PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑

PBDE-47應(yīng)用液配制：稱取PBDE-47(純度100%，美國Accustandard公司)40 mg，溶解于20 mL玉米油，室溫下，超聲處理30 min，配制成母液，4 ℃保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)，用玉米油稀釋到設(shè)定濃度，按10 μL·g-1灌胃。

PBA應(yīng)用液配制：將3 g PBA(美國Sigma公司)溶于1 L生理鹽水中，40 ℃水浴溶解，配制成終濃度3 mg·mL-1的應(yīng)用液，4 ℃儲存?zhèn)溆?。臨用時(shí)，按25 μL·g-1腹腔注射，每天2次，注射終劑量是150 mg·kg-1。

1.2 動物分組及處理

220～270 g成年清潔級Sprague-Dewley(SD)大鼠(雌性20只，雄性10只)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心提供(許可證號SCXK(鄂)2010-0009)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按雄雌1:2合籠。仔鼠出生當(dāng)天記為第0天，仔鼠出生第5天，將雌性大鼠隨機(jī)分為6組：對照組、1 mg·kg-1PBDE-47處理組、5 mg·kg-1PBDE-47處理組、10 mg·kg-1PBDE-47處理組、150 mg·kg-1PBA處理組和150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE-47處理組，每組10只。在仔鼠出生第8天給予150 mg·kg-1PBA處理組和150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠150 mg·kg-1PBA腹腔注射，持續(xù)3周。在出生第10天，各處理組通過腹腔注射方法分別給予相應(yīng)劑量的PBDE-47進(jìn)行一次性染毒，仔鼠隔天稱重一次。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

仔鼠出生第8周，從對照組、10 mg·kg-1PBDE-47處理組、150 mg·kg-1PBA處理組和150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE-47處理組中每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，前4天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠尋找平臺的潛伏期和游泳路徑以評價(jià)其空間認(rèn)知功能。第5天將平臺撤除進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，以平臺所在象限時(shí)間和游泳路徑占總時(shí)間和總路徑的比值評價(jià)大鼠的空間記憶能力。

1.4 標(biāo)本采集及處理

仔鼠出生第8周末頸椎脫臼處死，分離腦組織，每組取3只大鼠的大腦組織，用4%多聚甲醛固定24 h后常規(guī)石蠟包埋用于形態(tài)學(xué)觀察；余下的大腦組織分離海馬組織經(jīng)液氮處理后-80 ℃保存，用于蛋白提取。

1.5 海馬組織形態(tài)學(xué)觀察

將固定于多聚甲醛的大腦組織取出，常規(guī)切片后，經(jīng)HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織形態(tài)。1.6 IRE1、GRP78、CHOP及Cyt c蛋白表達(dá)水平測定

提取海馬組織蛋白并測定濃度；每孔加入80 μg總蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后加入IRE1抗體(英國Abcam公司，1:800)、GRP78抗體(美國Proteintech公司，1:500)、CHOP(美國Santa Cruz公司，1:300)及Cyt c抗體(美國Proteintech公司，1:1000)，4 ℃孵育過夜，洗脫緩沖液漂洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠Ig G(美國Pierce公司)，室溫孵育1 h，使用發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，采用Quantity One軟件(美國Bio-Rad公司)分析目的蛋白條帶，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 PBDE-47暴露可致SD大鼠青春期體重增長加快

各組動物出生后增重速度呈加快趨勢，40 d前后到達(dá)峰值，隨后增重速度開始下降。如表1所示，在增重最快的第40天，10 mg·kg-1PBDE-47組大鼠增重較對照組快，并持續(xù)到出生后60 d，而150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE組大鼠從出生后第50天開始，增重較對照組快，提示一定劑量的PBDE-47暴露可導(dǎo)致SD大鼠青春期體重增長加快。

表1 PBDE-47暴露和4-苯基丁酸(PBA)干預(yù)對大鼠不同時(shí)間點(diǎn)增重的影響

注：與Control比較，*P < 0.05；與10 mg·kg-1PBDE處理組比較，#P < 0.05。

Note: Compared with Control,*P < 0.05; Compared with 10 mg·kg-1PBDE group,#P < 0.05.

2.2 PBA干預(yù)可拮抗PBDE-47暴露導(dǎo)致的SD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力損傷

如表2所示，10 mg·kg-1PBDE-47處理會延長定位航行實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠找到平臺的平均潛伏期和平均路徑，而150 mg·kg-1PBA干預(yù)可拮抗PBDE-47對平均潛伏期和平均路徑的延長。如表3所示，在空間探索實(shí)驗(yàn)中，雖然各組動物之間在平臺所在象限的活動時(shí)間和路徑百分比的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠在中心區(qū)域活動的時(shí)間和路徑百分比較對照組低(P<0.05)，而150 mg·kg-1PBA處理組大鼠在中心區(qū)域的活動時(shí)間和路徑百分比較對照組高(P<0.05)，150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE處理組大鼠在中心區(qū)域的活動時(shí)間和路徑百分比較10 mg·kg-1PBDE處理組高，提示PBA干預(yù)可改善PBDE-47染毒所致大鼠長時(shí)程記憶損傷。

2.3 PBA干預(yù)可改善PBDE-47對SD大鼠海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷

HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠海馬組織齒狀回和CA3區(qū)細(xì)胞排列緊密，有大量核染色較深的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，10 mg·kg-1PBDE-47處理可導(dǎo)致海馬組織齒狀回和CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列散亂，錐形神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少甚至消失。與10 mg·kg-1PBDE-47 處理組相比，150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE處理組大鼠海馬組織齒狀回和CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列較緊密且錐形神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多(圖1)。

圖1 PBDE-47處理與PBA干預(yù)對SD大鼠海馬結(jié)構(gòu)的影響(HE染色 ×40)Fig. 1 Effects of PBDE-47 and PBA on morphological structure of hippocampus of SD rats (HE×40)

表2 PBDE-47及PBA處理對水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的影響

注：與對照組比較，*P < 0.05；與10 mg·kg-1PBDE處理組比較，#P < 0.05。

Note: Compared with Control,*P < 0.05; Compared with 10 mg·kg-1PBDE group,#P < 0.05.

表3 PBDE-47及PBA處理對水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)的影響

注：與對照組比較，*P < 0.05；與10 mg·kg-1PBDE處理組比較，#P < 0.05。

Note: Compared with Control,*P < 0.05; Compared with 10 mg·kg-1PBDE group,#P < 0.05.

2.4 PBDE-47暴露和PBA干預(yù)對海馬組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與對照組相比，10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠海馬組織中IRE1、GRP78和CHOP等ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)水平升高，而1和5 mg·kg-1PBDE-47處理的大鼠海馬組織中，僅CHOP蛋白表達(dá)水平升高，表明一定劑量的PBDE-47可誘導(dǎo)海馬組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致UPR的過度激活。PBA干預(yù)后，IRE1、GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)水平相對于10 mg·kg-1PBDE-47處理組顯著下降(P< 0.05)，表明PBA可拮抗PBDE-47所導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

2.5 PBDE-47暴露和PBA干預(yù)對海馬組織凋亡相關(guān)蛋白Cyt c表達(dá)的影響

如圖3所示，與對照組相比，5 mg·kg-1PBDE-47處理組、10 mg·kg-1PBDE-47處理組和150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE-47處理組Cyt c表達(dá)水平升高(P < 0.05)，提示細(xì)胞凋亡水平升高，而1 mg·kg-1PBDE-47處理組和150 mg·kg-1PBA組Cyt c蛋白表達(dá)水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相較于10 mg·kg-1PBDE-47處理組，150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE-47處理組海馬Cyt c蛋白表達(dá)水平降低(P< 0.05)，提示PBA干預(yù)可拮抗PBDE-47所致大鼠海馬組織凋亡水平的升高。

圖2 PBDE-47處理與PBA干預(yù)對SD大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 注：A，IRE1、GRP78和CHOP蛋白條帶；B，IRE1、GRP78和CHOP蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)條圖；與對照組比較，* P < 0.05；與10 mg·kg-1 PBDE-47處理組比較，# P < 0.05。Fig. 2 Effects of PBDE-47 and PBA on the expression levels of ERS related protein in hippocampus of SD ratsNote: A, protein bands of IRE1, GRP78 and CHOP; B, Straight bar chart of IRE1, GRP78 and CHOP expression level; Compared with Control, *P < 0.05; compared with 10 mg·kg-1 PBDE-47, # P < 0.05.

圖3 PBDE-47處理和PBA干預(yù)對海馬凋亡相關(guān)蛋白Cyt c表達(dá)水平的影響 注：A，Cyt c蛋白條帶；B，Cyt c蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)條圖；與對照組比較， P < 0.05；與10 mg·kg-1 PBDE-47處理組比較，# P < 0.05。Fig. 3 Effects of PBDE-47 and PBA on the expression levels of Cyt c in hippocampus of SD rats Note: A, protein bands of Cyt c; B, Straight bar chart of Cytc expression level; Compared with Control, *P < 0.05; compared with 10 mg·kg-1 PBDE-47, # P < 0.05.

3 討論(Discussion)

潛伏期是Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)一個(gè)很重要的參照指標(biāo)，可以反映動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的好壞。潛伏期短，預(yù)示著動物的學(xué)習(xí)記憶能力好，但是潛伏期和動物自身的游泳速度有關(guān)，因此，潛伏期并不能作為判斷動物記憶力好壞的最終指標(biāo)，還需要結(jié)合諸如游泳速度、上臺前路程等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。嚙齒類動物游泳有繞邊性，而平臺是靠近水池中心的，如果動物在水池中心區(qū)域內(nèi)活動時(shí)間和路程長，反映其空間記憶能力好，反之，則反映其空間記憶能力差。本實(shí)驗(yàn)的水迷宮結(jié)果顯示，通過訓(xùn)練，對照組、150 mg·kg-1PBA處理組和150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠平均潛伏期迅速下降而10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠平均潛伏期變化不大。在正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠平均潛伏期大于對照組大鼠，而游泳速度與對照組大鼠無差異，并且在中心區(qū)域的活動時(shí)間構(gòu)成比和活動路徑構(gòu)成比均較對照組大鼠低，表明10 mg·kg-1PBDE-47處理可損害大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，該結(jié)果與多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果一致[1, 3]，也與人群流行病學(xué)研究中PBDE-47導(dǎo)致兒童智力發(fā)育障礙[10]的結(jié)果相吻合。使用PBA干預(yù)后，10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠平均潛伏期和平均路徑以及中心區(qū)域活動時(shí)間占比等與對照比相比無明顯差別，表明PBA干預(yù)可減輕PBDE-47染毒對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。

隨著對海馬功能認(rèn)識的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)海馬齒狀回和CA1區(qū)和CA3區(qū)一樣，對形成與學(xué)習(xí)和記憶及空間信息編碼有關(guān)的長時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation, LTP)發(fā)揮重要的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠出生后60 d，對照組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，齒狀回和CA3區(qū)有大量核染色較深的錐形神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體較為豐富且染色較深，隨著PBDE-47染毒劑量的增加，海馬組織齒狀回和CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列散亂，齒狀回和CA3區(qū)染色較深的膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少甚至消失，神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體數(shù)量減少，且染色較淺，表明神經(jīng)元蛋白合成能力下降。而150 mg·kg-1PBA+10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列較10 mg·kg-1PBDE-47處理組大鼠整齊，且齒狀回和CA3區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量更多。這些結(jié)果表明，PBDE-47導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降與其引起的腦內(nèi)認(rèn)知相關(guān)區(qū)域損傷密切相關(guān)，PBA干預(yù)可改善PBDE-47染毒所致的海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能異常。

PBA通過穩(wěn)定肽鍵結(jié)構(gòu)，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)能力而增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)適應(yīng)能力[11]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，PBA可以下調(diào)GRP78、IRE1和CHOP的表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)從而降低凋亡水平[12]?；罨蟮腎RE1可促進(jìn)GRP78等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶的轉(zhuǎn)錄，從而提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力，也可激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)進(jìn)而活化c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[13]；IRE1還可激活CHOP的表達(dá)，在ERS狀態(tài)下，CHOP可下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，使胞漿中的Beclin-1從Bcl-2-Beclin-1復(fù)合物中解離而啟動自噬，促進(jìn)錯誤折疊蛋白的降解，保護(hù)細(xì)胞度過應(yīng)激狀態(tài)[14-15]。CHOP也可通過誘導(dǎo)BAX、p53正向細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子(p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA)等促凋亡因子導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]，在本研究中，不同染毒劑量的PBDE-47均導(dǎo)致大鼠海馬CHOP的表達(dá)上調(diào)，提示PBDE-47染毒可導(dǎo)致海馬組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活UPR通路導(dǎo)致CHOP的表達(dá)增加，10 mg·kg-1PBDE-47處理導(dǎo)致大鼠海馬IRE1和GRP78蛋白表達(dá)升高，且凋亡相關(guān)蛋白Cyt c蛋白表達(dá)水平升高，表明隨著PBDE-47染毒劑量的增加，海馬組織神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度逐漸加重，導(dǎo)致凋亡水平升高，該結(jié)果與海馬組織形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果以及水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

綜上所述，結(jié)合大鼠神經(jīng)行為、海馬組織形態(tài)學(xué)以及凋亡水平和ERS標(biāo)志分子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡參與了PBDE-47致大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性，PBA干預(yù)可降低PBDE-47導(dǎo)致的大鼠海馬組織病理及其功能分子表達(dá)的異常改變而保護(hù)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞。

致謝：本項(xiàng)目由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81273021，81430076)資助。

[1] He P, Wang A, Niu Q, et al. Toxic effect of PBDE-47 on thyroid development, learning, and memory, and the interaction between PBDE-47 and PCB153 that enhances toxicity in rats [J]. Toxicology and Industrial Health, 2011, 27(3): 279-288

[2] Dingemans M M, van den Berg M, Westerink R H. Neurotoxicity of brominated flame retardants: (In)Direct effects of parent and hydroxylated polybrominated diphenyl ethers on the (developing) nervous system [J]. Environmental Health Perspectives, 2011, 119(7): 900-907

[3] Eriksson P, Jakobsson E, Fredriksson A. Brominated flame retardants: A novel class of developmental neurotoxicants in our environment?[J]. Environmental Health Perspectives, 2001, 109(9): 903-908

[4] Shy C G, Huang H L, Chang-Chien G P, et al. Neurodevelopment of infants with prenatal exposure to polybrominated diphenyl ethers [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2011, 87(6): 643-648

[5] Schroder M, Kaufman R J. ER stress and the unfolded protein response [J]. Mutation Research, 2005, 569(1-2): 29-63

[6] He P, He W, Wang A, et al. PBDE-47-induced oxidative stress, DNA damage and apoptosis in primary cultured rat hippocampal neurons [J]. Neurotoxicology, 2008, 29(1): 124-129

[7] He P, Wang A G, Xia T, et al. Mechanism of the neurotoxic effect of PBDE-47 and interaction of PBDE-47 and PCB153 in enhancing toxicity in SH-SY5Y cells [J]. Neurotoxicology, 2009, 30(1): 10-15

[8] Jiang C, Zhang S, Liu H, et al. The role of the IRE1 pathway in PBDE-47-induced toxicity in human neuroblastoma SH-SY5Y cells in vitro [J]. Toxicology Letters, 2012, 211(3): 325-333

[9] Ayala P, Montenegro J, Vivar R, et al. Attenuation of endoplasmic reticulum stress using the chemical chaperone 4-phenylbutyric acid prevents cardiac fibrosis induced by isoproterenol [J]. Experimental and Molecular Pathology, 2012, 92(1): 97-104

[10] Roze E, Meijer L, Bakker A, et al. Prenatal exposure to organohalogens, including brominated flame retardants, influences motor, cognitive, and behavioral performance at school age [J]. Environmental Health Perspectives, 2009, 117(12): 1953-1958

[11] Fa M, Xia L, Anunu R, et al. Stress modulation of hippocampal activity--Spotlight on the dentate gyrus [J]. Neurobiology of Learning and Memory, 2014, 112: 53-60

[12] Kim D S, Li B, Rhew K Y, et al. The regulatory mechanism of 4-phenylbutyric acid against ER stress-induced autophagy in human gingival fibroblasts [J]. Archives of Pharmacal Research, 2012, 35(7): 1269-1278

[13] Chakrabarti A, Chen A W, Varner J D. A review of the mammalian unfolded protein response [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108(12): 2777-2793

[14] Yan F, Li J, Chen J, et al. Endoplasmic reticulum stress is associated with neuroprotection against apoptosis via autophagy activation in a rat model of subarachnoid hemorrhage [J]. Neuroscience Letters, 2014, 563: 160-165

[15] Wang Z Y, Lin J H, Muharram A, et al. Beclin-1-mediated autophagy protects spinal cord neurons against mechanical injury-induced apoptosis [J]. Apoptosis, 2014, 19(6): 933-945

[16] Cazanave S C, Elmi N A, Akazawa Y, et al. CHOP and AP-1 cooperatively mediate PUMA expression during lipoapoptosis [J]. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology, 2010, 299(1): G236-G243

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Roles of Endoplasmic Reticulum Stress Mediated Apoptosis in SD Rat’s Hippocampus Injure Induced by PBDE-47

Ma Rulin1,2,3, Zhang Shun1,2, Li Bei1,2, Yang Lu1,2, Zhang Xiao1,2, Wang Chao1,2, Li Pei1,2, Xia Tao1,2, Wang Aiguo1,2,*

1. Department of Occupational and Environmental Health, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, China 2. MOE (Ministry of Education) Key Lab of Environment and Health; State Key Laboratory of Environment Health (Incubation); Key Laboratory of Environment and Health (Wuhan) of Ministry of Environmental Protection, Wuhan 430030, China 3. Department of Preventive Medical, Medical College, Shihezi University, Shihezi 832000, China

To investigate the roles of endoplasmic reticulum stress mediated apoptosis in neurotoxicity of SD rats induced by 2,2’,4,4’-tetrabromodiphenylether (PBDE-47), 60 neonatal female Sprague-Dawley rats were randomly divided into 6 groups, and 2 groups of them were injected by intraperitoneal two times a day to give 4-phenylbutyric acid (PBA), an inhibitor of endoplasmic reticulum stress, for a total dose of 150 mg·kg-1continued for 3 weeks from the eighth day after birth. At the tenth day, they were administered with 0 and 10 mg·kg-1PBDE-47 in single gavage respectively. Similarly, animals in the other 4 groups received 0 mg·kg-1, 1 mg·kg-1, 5 mg·kg-1and 10 mg·kg-1PBDE-47 respectively. At the eighth weekend, 8 rats in Control, 10 mg·kg-1PBDE-47 group, 150 mg·kg-1PBA group, and 150 mg·kg-1PBA+ 10 mg·kg-1PBDE-47 group were administrated Morris water maze experiment to test their spatial learning and memory ability. Then all animals were sacrificed and hippocampus were isolated. HE staining was observed in hippocampus, the apoptosis levels and ERS markers (GRP78, IRE1 and CHOP) expression levels in hippocampus were observed with Western blooting. The results of Morris water maze experiment showed that 10 mg·kg-1PBDE-47 damaged the learning and memory ability, and the PBDE-47 exposed group needed more time and longer distance to find the platform (P<0.05). Histology detection found that PBDE-47 caused the disordered arrangement of the cells in hippocampal CA3 region, the decrease and even disappearing of deeply stained conical neurons and the reduction of Nissl body. The protein expression levels of Cyt c, IRE1 and CHOP were significantly increased in the 5 and 10 mg·kg-1PBDE-47 groups as compared to control. Moreover, PBA ameliorated the increase expression of ERS relative proteins, and the level of cell apoptosis were decreased evidently. Collectively, these results approve that PBDE-47 could damage the hippocampal neuron and disturb the learning and memory ability through the endoplasmic reticulum mediated apoptosis.

PBDE-47; female SD rat; neurotoxicity; hippocampus injure; water maze experiment; endoplasmic reticulum stress; apoptosis

10.7524/AJE.1673.5897.20151130021

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81430076，81273021)

馬儒林(1978-)，男，博士研究生，講師，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，Email：marulin@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: wangaiguo@mails.tjmu.edu.cn

2015-11-30 錄用日期：2016-04-05

1673-5897(2016)2-387-07

X171.5

A

簡介：王愛國(1963—)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文80余篇。

馬儒林, 張舜, 李蓓, 等. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡在PBDE-47致大鼠海馬損傷中的作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(2): 387-393

Ma R L, Zhang S, Li B, et al. Roles of endoplasmic reticulum stress mediated apoptosis in SD rat’s hippocampus injure induced by PBDE-47 [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 387-393 (in Chinese)