四逆散對高脂血癥小鼠血脂代謝途徑的影響

吳越 朱峰 劉建平 李永民

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·論著·

四逆散對高脂血癥小鼠血脂代謝途徑的影響

吳越 朱峰 劉建平 李永民

目的 探討四逆散對高脂血癥C57BL/6小鼠脂代謝的影響并初步探討其機制。方法 40只SPF級C57BL/6小鼠作為研究對象，隨機分為對照組、模型組、四逆散(0.9 mg/g體質(zhì)量)組、枳實(0.9 mg/g體質(zhì)量)組，分別以生理鹽水、四逆散水煎劑、枳實水煎劑灌胃，干預(yù)時間為90天。全自動生化分析儀檢測血清甘油三脂(triglyceride，TG)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、ELISA法檢測血清載脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1，APOA-Ⅰ)水平及實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測肝臟以及小腸組織中APOA-I的mRNA基因表達情況。結(jié)果 在脂代謝方面，四逆散干預(yù)可顯著防止高脂飲食小鼠血清TG、LDL-C水平的升高(P<0.05)，顯著提升血清中HDL-C和APOA-I水平(P<0.05)，顯著增加肝臟中APOA-I的mRNA表達程度(P<0.05)。結(jié)論 四逆散可能是通過促進肝臟APOA-I mRNA表達和增加APOA-I分泌來干預(yù)血脂水平。

四逆散； 高脂血癥； 載脂蛋白A-I

高脂血癥是指血中脂肪代謝或轉(zhuǎn)運異常而導(dǎo)致的任一或所有的脂質(zhì)和(或)脂蛋白異常升高。高脂血癥的存在增加了高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、冠心病和腦卒中等疾病的發(fā)病率，并且影響其嚴重程度[1-2]。目前用于干預(yù)高脂血癥患者的降脂藥物可能有導(dǎo)致其轉(zhuǎn)氨酶升高或其他毒副作用產(chǎn)生的風(fēng)險[3]，在積極干預(yù)高脂血癥患者及高危人群的血脂水平的同時尋找新的低毒高效的防治藥物是目前的迫切需求[4]。中醫(yī)學(xué)的整體觀念對治療各種疾病具有一定的指導(dǎo)意義和優(yōu)勢，“高脂血癥”屬于中醫(yī)“痰濕”“濁阻”等范疇[5]。高脂血癥發(fā)病與肝郁脾滯、氣機不暢、運化不利而致痰濕郁滯密切相關(guān)，其治療以疏肝健脾、調(diào)暢氣機、除濕化痰為主。四逆散作為漢代名醫(yī)張仲景所著《傷寒論》中的經(jīng)方可達木疏土、安和中州，臨床上主要用于治療肝脾氣滯、脾胃虛弱或氣機郁遏等證[6]。在本實驗中筆者團隊采用高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠作為研究模型，觀察四逆散對脂質(zhì)代謝途徑的干預(yù)。

1 材料

1.1 實驗材料

SPF級C57BL/6雄性小鼠40只，體質(zhì)量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物具備實驗動物合格證書SCXK(京)2012-0001號。實驗動物在清潔級層流架中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(23±2)℃，照明時間每天12小時(7：00～19：00)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行試驗。

1.2 高脂飼料配置

3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10 %豬油、81.3 %基礎(chǔ)飼料，實驗動物所用普通飼料和高脂飼料均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0008。

1.3 藥品

四逆散中柴胡、枳實、白芍、炙甘草均由中國北京同仁堂(集團)有限責(zé)任公司購買。藥材洗凈后以10倍量水煎煮1.5小時，倒出濾液，再以5倍量水煎煮1小時，合并濾液水浴濃縮成每毫升含生藥1.5 g，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試劑

總甘油三酯測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白固醇測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；載脂蛋白A-I測定試劑盒購自武漢基因美生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；TRIzol法提取總RNA所用TRIzol試劑購于Invitrogen公司、用于RT-PCR的Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR?Premix Ex Taq TM II試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.5 儀器

儀器包括全自動生化分析儀、Thermo Scientific Heraeus Fresco 21微量離心機、Thermo Multiskan MK3全自動酶標(biāo)儀、Thermo Arktik多功能PCR儀、Thermo Scientific NanoDrop 2000、ABI 7300實時熒光定量PCR儀。

2 方法

2.1 動物分組及標(biāo)本采集

健康雄性C57BL/6實驗小鼠40只，飼養(yǎng)1周后隨機分為4組，每組10只：對照組、模型組、四逆散組、枳實組(陽性對照組)。每日給予足量飼料，空白對照組以普通飼料喂養(yǎng)，其余組均以高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料若第二天還有剩余則用新的高脂飼料代替，自由飲水[7]。四逆散組用上述四逆散煎液灌胃，劑量0.02 mL/(g·d)，枳實組用上述枳實煎液灌胃，劑量0.02 mL/(g·d)，模型組和空白組用生理鹽水灌胃0.02 mL/(g·d)，每天1次，以高脂飼料喂養(yǎng)開始連續(xù)90天，禁食不禁水16小時，麻醉后摘眼球取血備用。采血后處死，每只小鼠取肝臟、小腸，焦硫酸二乙酯處理水清洗后分裝到焦硫酸二乙酯處理過的凍存管中，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血清相關(guān)指標(biāo)測定

將全血室溫放置0.5小時，4000 rpm離心5分鐘，取上層血清為測試樣品，按試劑盒說明分別測定血清甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、ELISA法檢測血清載脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1，APOA-I)。

2.3 肝臟和小腸中APOA-I mRNA表達的檢測

TRIzol法提取小鼠肝臟及小腸總RNA，組織在液氮中研磨成粉后，每50 mg組織加入1mL TRIzol，根據(jù)TRIzol試劑說明書進行總RNA提取。按照說明書逆轉(zhuǎn)錄。(1)在RNase free的離心管內(nèi)配制混合液：Total RNA：1 μL；5×gDNA Eraser Buffer：2 μL；gDNA Eraser：1 μL；RNase Free dH2O：up to 10 μL。(2)42℃溫育2分鐘以除去基因組DNA。(3)取上述反應(yīng)液10 μL，5×PrimeScripT?Buffer2(for Real Time)：4 μL；PrimeScripT?RT Enzyme Mix I：1 μL；RT Primer Mix：1 μL；RNase Free dH2O：up to 20 μL。反轉(zhuǎn)錄體系為37℃15分鐘、85℃5秒、4℃，獲取cDNA模版。(4)qPCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq II(TIIRNaseH Plus)(2×)：10 μL；Primer R (10 μM)：0.8 μL；Primer F (10 μM)：0.8 μL；ROX Reference Dye(50×)：0.4 μL；cDNA：2 μL；dH2O：6 μL。PCR反應(yīng)條件為：20 μL反應(yīng)體系兩步法PCR擴增，預(yù)變性95℃30秒，PCR反應(yīng)95℃5秒、60℃31秒，共40個循環(huán)。引物信息見表1。

表1 APOA-ImRNA和β-actin引物信息

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血清TG、LDL-C、HDL-C及APOA-I水平

與對照組相比，模型組小鼠血清TG和LDL-C水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，四逆散組和枳實組小鼠血清TG和LDL-C水平均顯著降低(P<0.05)，四逆散組HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。四逆散組和枳實組TG和HDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。四逆散組血清APOA-I含量明顯高于模型組和對照組(P<0.05)，但枳實組APOA-I只與模型組有差別(P<0.05)，說明四逆散可通過提高血清APOA-I促進脂質(zhì)在體內(nèi)的消化。見表2。

3.2 小腸和肝臟APOA-I mRNA基因?qū)崟r熒光定量方法檢測

3.2.1 方法的特異性分析 溶解曲線可見APOA-I mRNA基因與β-Actin RNA基因的熒光定量產(chǎn)物均呈較為銳利的單一峰(圖1、圖2)，溶解溫度Tm分別為86.1℃和84.9℃。溶解曲線中沒有其他雜峰出現(xiàn)，可知在用SYBR Green熒光染料進行RT-PCR檢測時，熒光信號全部為RT-PCR擴增產(chǎn)物，沒有其他干擾，驗證了反應(yīng)的特異性。

表2 四逆散對高脂血癥小鼠血清TG、LDL-C、HDL-C及APOA-I水平的影響

注： 與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖1 APOA-I mRNA擴增產(chǎn)物溶解峰圖

圖2 β-Actin RNA擴增產(chǎn)物溶解峰圖

3.2.2 APOA-I mRNA基因 在小腸和肝臟中相對表達量在小腸中，APOA-I mRNA 2在四個實驗組中均有不同的表達，在四逆散組APOA-I mRNA表達量最高，約為模型組的2.4倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組APOA-I mRNA的表達量約是模型組的1.5倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，枳實組的APOA-I mRNA的表達量與模型組表達量相當(dāng)，差異不顯著(P>0.05)。在肝臟中，四逆散組APOA-I mRNA的表達量約是模型組的5倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。枳實組APOA-I mRNA的表達量約是模型組的3倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組APOA-I mRNA的表達量約是模型組的2.2倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將模型組mRNA的相對表達量作為一個單位，由此計算出四組小腸和肝臟中APOA-I mRNA的相對表達量。四逆散組、枳實組、對照組的肝臟APOA-I mRNA的表達量均比小腸中的高。

表3 APOA-I mRNA在小腸和肝臟中的相對表達量

注： 與模型組比較，aP<0.05。

4 討論

脂質(zhì)在體內(nèi)的過量積累能夠直接引起高脂血癥，進而誘發(fā)各種疾病。鑒于飲食是導(dǎo)致人類高脂血癥發(fā)生的重要原因，因此在實驗研究中模擬高脂血癥的發(fā)病規(guī)律，用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠高脂血癥模型以研究相關(guān)病理生理改變，對干預(yù)目前高脂血癥的發(fā)生發(fā)展有一定的意義[8]。

中醫(yī)治療高脂血癥是以“郁”“痰”“瘀”為根本出發(fā)，四逆散以柴胡疏肝解郁，透熱邪于外；枳實行氣導(dǎo)滯，散積結(jié)于內(nèi)；柴胡與枳實配伍可奏升清降濁之功。芍藥柔肝養(yǎng)血斂陰，與柴胡共奏疏經(jīng)通絡(luò)之效而無耗傷陰血之弊；炙甘草益脾和胃而安中。四藥合用疏肝和脾，調(diào)達氣機，促進臟腑功能復(fù)常，運化水濕痰液，避免聚而成痰[9]。研究證實組成四逆散的四味中藥的成分均有不同程度的降血脂作用，甘草酸通過促進血管壁細胞脂質(zhì)外流降低了血清TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)水平進而調(diào)節(jié)血管壁的脂質(zhì)沉積[10]。芍藥苷可減少動脈粥樣硬化模型小鼠血清中TC和TG水平，使其腹主動脈脂質(zhì)沉積顯著減少[11]。柴胡可改善四氧嘧啶誘導(dǎo)的高脂血癥小鼠血清中TG、TC、LDL-C升高及HDL-C降低的情況[12]。枳實能夠通過改善高脂血癥患者內(nèi)皮功能以降低血清TC、TG和、LDL-C含量，升高HDL-C含量[13]。本實驗證實四逆散可顯著干預(yù)高脂血癥小鼠血清的TG、LDL-C上升水平且可升高HDL-C的水平。

四逆散降血脂的機制之一可能是影響肝臟APOA-I mRNA基因的表達促使APOA-I分泌增多，APOA-I約占HDL蛋白組成的70%，因而血清APOA-I的濃度與HDL-C水平密切相關(guān)。新生的APOA-I作為ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運子的配體可以促進巨噬細胞內(nèi)膽固醇流出并與之形成新的HDL，新生及圓盤狀HDL不斷地從外周組織攝取磷脂和游離膽固醇逐漸成為成熟的HDL，進行脂質(zhì)結(jié)合和分化無脂APOA-I，進一步激活卵磷脂膽固醇脂酰基轉(zhuǎn)移酶促進膽固醇的酯化以實現(xiàn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運[14-15]，實現(xiàn)膽固醇在肝外組織的清除，達到干預(yù)血脂的目的。

四逆散[16]具有一定的防止肝損傷的作用且均優(yōu)于方中單味藥柴胡[17]、白芍[18]、枳實[19]和甘草[20]，在降脂治療過程配合四逆散干預(yù)血脂代謝途徑，可達到降脂保肝目的。

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(本文編輯： 董歷華)

Effects ofSinipowder on blood lipid metabolism in mice with hyperlipidemia

WUYue，ZHUFeng，LIUJian-Ping，etal.

ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Taiyuan030024，China

LIYong-min，E-mail：liyongmin2001@sina.com

Objective To observe the effects ofSinipowder on C57BL/6J mice with hyperlipidemia and explore its mechanism. Methods 40 C57BL/6 mice were randomly divided into blank control group，hyperlipidemia group，hyperlipidemia plusSinipowder (0.9 mg/g weight) group and hyperlipidemia plus fructus aurantii immaturus (0.9mg/g weight). Blank control group were fed with normal diet and the other groups were fed with high fat diet. Mice were received gavage administration with corresponding drug，Sinipowder and fructus aurantii immaturus were intervened for 90 days. The automatic biochemistry analyzers method was used to measure the levels of TG，LDL-C，HDL-C in serum. Elisa methods were used to detect the APOA-I levels in serum. Real-time PCR methods were used to detect the APOA-I mRNA expression changes in liver and small intestine. Results Compared with hyperlipidemia group，Sinipowder could decrease the levels of TG and LDL-C(P<0.05)，increase the levels of HDL-C and improve the level of APOA-I in serum(P<0.05). The mRNA expressions of APOA-I in liver was increased inSinipowder combined hyperlipidemia group. ConclusionSinipowder may be to promote the expression of mRNA APOA-I in liver and increase APOA-I secretion to interfere with blood lipid level.

Sinipowder； Hyperlipidemia； Apolipoprotein A-1

河北北方學(xué)院創(chuàng)新人才培育基金(CXRC1319)；河北省中醫(yī)藥管理局課題(2015171)

030024 太原，山西中醫(yī)學(xué)院(吳越)；河北北方學(xué)院中醫(yī)學(xué)院(朱峰、李永民)；中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院(劉建平)

吳越(1991- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治心血管疾病。E-mail：dawn_233@163.com

李永民(1970- )，博士，教授。研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)、中藥藥理學(xué)。E-mail：liyongmin2001@sina.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.12.003

2016-07-22)