劉慧 趙俊云 楊向竹 薛慧清 李彩彩 馬鑫 張娜 周然

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黃芪糖蛋白對膠原誘導性關節(jié)炎小鼠Th17/Treg細胞免疫平衡的影響

劉慧 趙俊云 楊向竹 薛慧清 李彩彩 馬鑫 張娜 周然

目的 研究16kD黃芪糖蛋白對膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型小鼠Th17/Treg細胞免疫平衡的影響，探討黃芪糖蛋白治療膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的免疫作用機理。方法 采用雄性Balb/c小鼠建立牛Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型，將造模成功的小鼠隨機分為CIA模型組、氫化可的松陽性對照組、黃芪糖蛋白高、中、低劑量組，另設空白對照組；各治療組腹腔注射藥物14天，對照組與模型組注射等體積生理鹽水。采用流式細胞術檢測各組小鼠外周血CD3+CD4+IL-17A+Th17細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例；Western blot法檢測各組小鼠脾組織中維甲酸相關孤獨受體γt(retinoid-related orphan receptor γt, RORγt)和叉頭狀轉錄因子3 (forkhead box protein 3,Foxp3)的蛋白表達水平。結果 流式檢測結果顯示,黃芪糖蛋白可顯著降低模型組小鼠外周血中CD3+CD4+IL-17A+Th17細胞比例(P<0.01)，提高CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的比例(P<0.01)。Western blot結果顯示黃芪糖蛋白可顯著降低模型組小鼠脾組織中RORγt的表達(P<0.01),提高Foxp3的表達(P<0.01)。結論 黃芪糖蛋白提高Foxp3的表達水平，降低RORγt的表達水平，恢復Th17/Treg細胞之間的平衡，可能是黃芪糖蛋白治療膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的機制之一。

黃芪糖蛋白； RORγt； Foxp3； 膠原誘導性關節(jié)炎小鼠

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以多關節(jié)滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特征的慢性自身免疫性疾病，致殘率極高[1]。到目前為止，雖然RA的病因及發(fā)病機制尚不明確，但T細胞功能紊亂，尤其是CD4+T細胞異?；罨赗A的發(fā)生發(fā)展中處于中心環(huán)節(jié)[2]。黃芪為傳統(tǒng)補中益氣中藥，具有補氣升陽、固表止汗等多種功效。本課題組通過水浸提法自膜莢黃芪的干燥根中分離出一種糖蛋白均一組分，即黃芪糖蛋白，進而從黃芪糖蛋白中分離純化出一種16kD組分，命名為AmRP10-16[3]。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪糖蛋白具有一定免疫抑制作用，且可改善佐劑性關節(jié)炎大鼠的關節(jié)炎癥[4-5]。本實驗以膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型小鼠為研究對象，予16kD AmGP腹腔注射給藥，以Th17/Treg細胞平衡為切入點研究16kD黃芪糖蛋白(astragalus membranaceus glycoprotein,AmGP)對CIA小鼠Th17、Treg細胞比例及其特異性轉錄因子維甲酸相關孤獨受體γt(retinoid-related orphan receptor γt, RORγt)和叉頭狀轉錄因子3 (forkhead box protein 3,Foxp3)蛋白表達的影響，探討AmGP治療CIA的免疫作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Balb/c雄性小鼠，90只，體質(zhì)量(18±2)g，清潔級，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。

1.2 主要藥物、試劑、儀器

AmGP為自制；弗氏完全佐劑，Sigma公司;膠原蛋白Ⅱ型(牛)，Chondrex公司；Anti-RORγt Purified、Anti-Foxp3 Purified，eBioscience公司；β-actin、HRP標記羊抗兔IgG、HRP標記羊抗小鼠IgG，北京博奧森生物技術有限公司；四甲基乙二胺，北京康為世紀生物科技有限公司；苯甲基磺酰氟、過硫酸銨、Tween-20、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、聚偏氟乙烯微孔轉移膜、5%脫脂奶粉、Tris、SDS、BCA蛋白定量試劑盒，Solarbio公司;Mouse IL-17A PE-Cy7 Antibody、Mouse CD4 FITC Antibody、Anti-Mouse CD25 APC、Anti-Mouse Foxp3 PE、Cocktail(PMA+Ionomysin+BFA)，美國BioLegend公司。

JY600C型電泳儀，北京君益東方電泳設備有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀，Tecan公司；流式細胞儀，美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備 Balb/c雄性小鼠80只，適應性喂養(yǎng)一周，參考文獻方法[6]，將溶解的CⅡ與等體積CFA在冰浴中充分乳化，以0.1 mL/只在小鼠腹部、背部和尾根部多點皮下注射，進行基礎免疫，當天記為第1天，第21天以同樣的方法加強免疫。以關節(jié)腫脹度評分標準評價模型復制是否成功。

1.3.2 分組及給藥 將造模成功的50只小鼠隨機分為模型組、氫化可的松(hydrocortisone，HC)陽性對照組、黃芪糖蛋白高、中、低劑量組，每組10只；基礎免疫后第42天開始給藥治療：HC組小鼠腹腔注射HC 10 mg/kg；AmGP低、中、高劑量組分別按0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg腹腔注射AmGP；正常組、模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水；注射體積均為0.4 mL/20 g，每天一次，共治療兩周。

1.4 指標檢測

1.4.1 關節(jié)腫脹度評分 采用0～4級關節(jié)評分法，關節(jié)炎得分計算方法為：0分，腳趾正?；驘o炎癥；1分，腳趾關節(jié)腫脹或輕度發(fā)紅；2分，趾關節(jié)和足趾發(fā)紅并且腫脹；3分，踝關節(jié)以下整個足爪發(fā)紅并且腫脹；4分，踝關節(jié)嚴重發(fā)紅且腫脹，關節(jié)有變形跡象。每隔3天觀察并記錄小鼠四肢關節(jié)病變情況，四肢關節(jié)評分累計之和為每只小鼠的多發(fā)性關節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)。AI值≥4分表示造模成功。

1.4.2 流式細胞術檢測 小鼠外周血Th17、Treg細胞比例第57天各組小鼠摘眼球取血，流式細胞儀檢測小鼠外周血Th17、Treg細胞比例，方法完全按照試劑盒說明進行。

1.4.3 Western blot法檢測 脾組織中RORγt、Foxp3蛋白的表達第57天處死小鼠，取各組小鼠脾組織，提取總蛋白并采用BCA法定量，取總蛋白40 μg 進行SDS-PAGE蛋白電泳、轉膜、雜交。顯影結果采用Quantity One軟件分析各組條帶灰度值，以目標蛋白與內(nèi)參比值反應脾組織蛋白表達情況。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 CIA小鼠的一般情況

正常組小鼠在整個實驗期間飲食正常，活潑，皮毛光澤；模型組小鼠進行免疫注射后可見食欲下降，體重減輕，皮毛黯淡干枯，并出現(xiàn)輕度脫毛現(xiàn)象，關節(jié)紅腫畸形，跛行。各藥物組小鼠關節(jié)紅腫均有所減輕，精神狀態(tài)及飲食較模型組均明顯改善。

2.2 CIA小鼠AI值

正常組小鼠足爪關節(jié)無紅腫現(xiàn)象，AI值為0；所有造模小鼠于基礎免疫后第22天開始出現(xiàn)關節(jié)腫脹、發(fā)紅等典型改變，并隨時間推移逐漸加重，造模小鼠于基礎免疫后第42天關節(jié)炎指數(shù)達到高峰，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨著各給藥組的持續(xù)用藥，AI值不斷降低；其中HC組小鼠關節(jié)炎指數(shù)最小，與模型組比較AI值降低明顯(P<0.01)；AmGP不同劑量組AI值較模型組均有不同程度降低(P<0.01)。結果見圖1。

圖1 黃芪糖蛋白對CIA小鼠關節(jié)炎指數(shù)影響的變化趨勢

2.3小鼠外周血Th17、Treg細胞比例

與正常組比較，模型組小鼠外周血Th17細胞比例升高，Treg細胞比例降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。治療后，與模型組比較，HC組與AmGP各劑量組Th17細胞比例不同程度降低，Treg細胞比例升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 黃芪糖蛋白對CIA小鼠外周血Th17、Treg細胞比例的影響

注： 與正常組比較，aP<0.01;與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.4 小鼠RORγt 、Foxp3蛋白的表達

Western blot檢測結果顯示，與正常組比較，模型組RORγt表達升高，F(xiàn)oxp3表達降低(P<0.01)；與模型組比較，HC組和AmGP中、高劑量組RORγt表達降低，F(xiàn)oxp3表達升高(P<0.01)。數(shù)據(jù)見表2，雜交結果如圖2。

注：A.正常組;B.模型組;C.HC組;D.AmGP低劑量組;E.AmGP中劑量組;F.AmGP高劑量組

組別nRORγt/β?actinFoxp3/β?actin正常組100．328±0．0190．525±0．016模型組100．439±0．012a0．325±0．031aHC組100．305±0．069b0．467±0．038bAmGP低劑量組100．421±0．0250．362±0．012AmGP中劑量組100．292±0．088b0．429±0．061bAmGP高劑量組100．341±0．011b0．448±0．027b

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3 討論

黃芪作為補氣藥在臨床廣泛應用于治療RA的多種經(jīng)方。近年研究表明，黃芪的多種有效成分，如黃芪多糖、黃芪總甙及黃芪黃酮等，具有免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[7]，且用于治療RA[8-10]。HC屬于腎上腺皮質(zhì)激素，具有抗感染、抑制免疫等藥理作用，是臨床治療RA療效明確的藥物，所以本文將其作為陽性對照。本文成功復制小鼠膠原誘導性關節(jié)炎模型，以Th17/Treg細胞平衡為切入點，探究AmGP作用于CIA小鼠的可能機制及療效。

Th17和Treg細胞是CD4+T細胞的兩個亞型。初始CD4+T細胞在IL-6和TGF-β的共同作用下，通過激活JAK-STAT3途徑，誘導RORγt基因的表達，促進初始CD4+T細胞向Th17細胞分化；而在TGF-β的單獨作用下，可通過激活JAK-STAT5信號途徑，上調(diào)Foxp3的表達，促使初始CD4+T細胞分化為Treg細胞[11]。Th17細胞可產(chǎn)生促炎因子IL-17?，F(xiàn)已明確Th17細胞及其特異性細胞因子IL-17在RA等自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用[12]。IL-17的促炎效應可誘導破骨細胞和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，促進滑膜炎癥、關節(jié)與骨的損傷[13]。CD4+CD25+Treg細胞可特異性表達轉錄因子Foxp3，通過分泌IL-10和TGF-β等抑炎細胞因子發(fā)揮抑制T細胞及抗原提呈細胞的功能，減少促炎因子和抗體的產(chǎn)生發(fā)揮免疫抑制作用。研究表明，Treg細胞數(shù)量減少、功能降低是RA患者免疫失調(diào)的重要原因[14]。由此可知，Th17和Treg細胞具有截然相反的免疫作用，Th17細胞可促進RA等自身免疫病的發(fā)生發(fā)展，而Treg細胞可減輕前者所導致的自身免疫性炎癥反應，從而維持機體的免疫平衡狀態(tài)，因此Th17/Treg細胞失衡在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

RORγt是Th17細胞的關鍵轉錄因子，可特異性地調(diào)節(jié)Th17細胞的分化及功能。Ivanov II等[15]研究表明，RORγt缺失的動物體內(nèi)，Th17細胞數(shù)量減少，發(fā)生自身免疫疾病的概率降低；同時還表明，無論體內(nèi)外誘導Th17細胞的分化都必須要有轉錄因子RORγt的參與。Foxp3是Treg細胞的標志分子，對Treg細胞的分化發(fā)育成熟及發(fā)揮免疫抑制作用方面起關鍵作用，也是Treg細胞最敏感的標記[16]，它與Th17的特異性轉錄因子RORγt相互拮抗[17]。RORγt/Foxp3平衡可確定初始CD4+T細胞在受到抗原刺激后向Th17或Treg細胞分化的方向[18]。因此，RORγt/Foxp3平衡可從根本上影響Th17/Treg細胞平衡，影響RA等自身免疫病的發(fā)生發(fā)展。

臨床RA患者外周血表達Foxp3的Treg細胞數(shù)量減少[19]，而血清及關節(jié)液中IL-17的表達則明顯升高[20]。牛倩等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血Th17細胞比例明顯升高，而Treg細胞比例明顯降低，提示RA中存在Th17/Treg細胞偏倚。Th17細胞的促炎作用與Treg細胞的抑炎作用在RA的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，恢復Th17/Treg細胞平衡對治療RA意義重大。

本文以16kD黃芪糖蛋白腹腔注射治療CIA小鼠，結果顯示，與模型組比較，AmGP各劑量組小鼠皮毛較光整，飲食、活動度、精神狀態(tài)均有改善，AI值降低(P<0.01)，說明AmGP可在一定程度上改善CIA模型小鼠的關節(jié)炎癥，抑制病情的發(fā)展。本研究結果顯示，CIA組小鼠外周血中Th17細胞比例升高，Treg細胞比例下降，與正常組比較差異顯著(P<0.01)。同時，CIA組小鼠的脾組織中RORγt表達明顯升高，F(xiàn)oxp3表達明顯降低，與正常組比較，差異顯著(P<0.01)，即外周血中Th17、Treg細胞的比例變化與其特異性轉錄因子的表達變化呈現(xiàn)相同的趨勢。Foxp3表達降低，Treg細胞的發(fā)育受到抑制，Treg細胞分泌的抑炎因子減少，免疫抑制作用減弱，同時RORγt表達升高，則促使Th17細胞分化，其分泌促炎因子也相應增多，Th17/Treg細胞平衡向Th17細胞方向偏倚，最終導致關節(jié)炎癥的發(fā)生。CIA小鼠經(jīng)16kDAmGP治療后，外周血中Th17細胞比例降低，Treg細胞比例升高，相應的，脾組織中RORγt表達降低，F(xiàn)oxp3表達升高，與模型組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明16kDAmGP可通過不同程度促進Treg細胞的分化增殖，抑制Th17細胞的分化增殖，有效地恢復Th17/Treg細胞平衡，使CIA模型小鼠的病情逐漸緩解。

16kD黃芪糖蛋白是本課題組在以往提取的黃芪糖蛋白的基礎上進一步分離純化，得到的分子量更小的天然糖蛋白活性分子。本文表明，16kD黃芪糖蛋白對CIA小鼠的治療作用可能是通過調(diào)節(jié)RORγt、Foxp3轉錄因子的表達水平，進而糾正Th17/Treg細胞平衡而實現(xiàn)的。關于16kD黃芪糖蛋白的其他免疫活性及量效關系的研究及其對RA作用機理的進一步探討將是下一步的研究方向。

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(本文編輯： 禹佳)

Influences of AmGP on Th17/Treg immune balance in CIA mice

LIUHui,ZHAOJun-yun,YANGXiang-zhu，etal.

SchoolofBasicMedicalScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

YANGXiang-zhu,E-mail:xiangzhuy@126.com

Objective To examine the impacts of 16kD astragalus membranaceus glycoprotein (AmGP) on the balance of Th17/Treg in CIA mice; and to investigate the effects of AmGP on CIA mice and its’ mechanism. Methods Bovine type Ⅱcollagen was used to establish CIA model. Mice were randomly divided into five groups: CIA model group, hydrocortisone(HC) positive control group, AmGP groups with low, medium and high dose. In addition, a normal group was built. The HC and AmGP groups were treated by HC or AmGP with intraperitoneal injection, while normal saline was used in the other groups，and the treatment was lasted for 2 weeks. Flow cytometry was used to detect the proportions of CD3+CD4+IL-17A+Th17 and CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in peripheral blood of the mice; The protein expressions of RORγt and Foxp3 were evaluated by western blot in mice spleen. Results It is showed that AmGP could significantly reduce the proportion of CD3+CD4+IL-17A+Th17 in peripheral blood of CIA mice (P<0.01). It could improve the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells (P<0.01). Western blot results indicated that AmGP could significantly decrease the expression of RORγt (P<0.01), while increase the expression of Foxp3 in spleen of CIA mice(P<0.01).Conclusion AmGP recovers the balance of Th17/Treg cells by improving the expressions of Foxp3,and reducing the expression of RORγt. This procedure may be one of the mechanisms for AmGP to cure the CIA mice.

Astragalus membranaceus glycoprotein； RORγt； Foxp3； CIA

國家國際科技合作專項(2013DFA30700)

100029 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院[劉慧(碩士研究生)、趙俊云、楊向竹、李彩彩(碩士研究生)、馬鑫、張娜]；山西中醫(yī)學院科研中心(薛慧清、周然)

劉慧(1989- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：16kD黃芪糖蛋白作用于CIA小鼠的免疫作用機理。E-mail：13671081286@163.com

楊向竹(1970- )，女，博士，副教授，碩士生導師。研究方向：中藥的現(xiàn)代物質(zhì)基礎。E-mail：xiangzhuy@126.com

R285

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.12.004

2016-05-16)