付翠群，沈國(guó)棟，沈 干，胡世蓮

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人胃癌SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性觀察

付翠群1,2，沈國(guó)棟1,2，沈 干1,2，胡世蓮1,2

目的 建立人胃癌SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株，觀察其生物學(xué)特性。方法 使用質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)，獲得高表達(dá)TCF7L2蛋白的胃癌細(xì)胞株SGC-7901/TCF7L2及其空轉(zhuǎn)對(duì)照組SGC-7901細(xì)胞株(SGC-7901/CON)。采用qRT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)SGC-7901/TCF7L2和SGC-7901/CON兩細(xì)胞株中的TCF7L2 mRNA和蛋白表達(dá)水平；光學(xué)顯微鏡下觀察并比較兩種細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)；劃痕實(shí)驗(yàn)比較兩者的遷移能力；用細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別檢測(cè)兩者對(duì)順鉑和卡鉑的耐藥情況；裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)比較兩者在體內(nèi)成瘤的能力。結(jié)果 經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)成功建立穩(wěn)定的SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株，其TCF7L2的mRNA和蛋白表達(dá)量均較SGC-7901/CON細(xì)胞株明顯升高；光鏡下SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞形態(tài)較對(duì)照細(xì)胞形態(tài)多樣，偽足增多，體積增大，胞質(zhì)內(nèi)顆粒物質(zhì)增多；遷移能力和對(duì)鉑類的耐受性較對(duì)照細(xì)胞明顯增強(qiáng)；SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤能力也明顯增強(qiáng)。結(jié)論 TCF7L2可以增強(qiáng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的惡性生物學(xué)特性，SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株的建立為胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究及其靶向藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)。

胃癌；SGC-7901/CON細(xì)胞株；SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株；TCF7L2

胃癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)胃癌發(fā)病率與致死率在惡性腫瘤中均居前列，嚴(yán)重危害人類健康[1]。早期胃癌經(jīng)外科手術(shù)和藥物化療容易治愈，但目前胃癌缺乏特異有效的標(biāo)志物分子，內(nèi)窺鏡技術(shù)接受率較低，使得我國(guó)大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)是晚期，失去了治療的最佳時(shí)期。因此，尋找與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)胃癌的早期診斷和藥物治療有很重要的臨床意義。已有研究[2]顯示W(wǎng)nt通路在結(jié)腸癌與乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈活化狀態(tài)，其中TCF7L2是該通路中的關(guān)鍵分子之一。該研究利用基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)建立高表達(dá)TCF7L2的胃癌細(xì)胞株SGC-7901/ TCF7L2，觀察其生物學(xué)特性變化，為研究胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和開發(fā)靶向藥物提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；TCF7L2 兔抗 mAb、β-actin兔mAb、抗兔IgG(美國(guó)CST公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑混合物(瑞士Roche公司)；顯影液(上海天能科技有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；RNeasy mini Kit(德國(guó)Qiagen GmbH公司)；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(美國(guó)Life Technologies公司)；Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)；引物TCF7L2、β-actin(日本TaKaRa公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)裸鼠(BALB/c-nu)10只，雌性，6～8周齡，25 g左右，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院分子實(shí)驗(yàn)室保存, 分別在含10 %小牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù) 轉(zhuǎn)染24 h前，在30 mm培養(yǎng)皿中接種適量密度的SGC7901細(xì)胞(約2×105/ml)，待細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)50%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。配制溶液1 ∶240 μl無(wú)血清培養(yǎng)基+10 μl Lipofectamine 2000，室溫孵育5 min；溶液2 ∶250 μl無(wú)血清培養(yǎng)基+2 μg TCF7L2表達(dá)質(zhì)粒，室溫孵育5 min；將溶液1與溶液2混合，室溫下放置20 min；將6孔板中的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2遍后，加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基；將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻；置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中保溫4～6 h；更換含有血清的全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將6孔板中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按照每孔1個(gè)細(xì)胞比例稀釋后加入96孔板，并加入適量purocymin進(jìn)行篩選[3]，最終獲得TCF7L2高表達(dá)的SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株和空轉(zhuǎn)對(duì)照組SGC-7901/CON細(xì)胞株。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 應(yīng)用倒置顯微鏡，對(duì)比觀察SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株的活體細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 Western blot法檢測(cè) 應(yīng)用RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑制成的混合物裂解細(xì)胞提取蛋白，具體實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)說(shuō)明書；應(yīng)用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液，于100 ℃水中煮沸5～10 min，冰上冷卻上樣；取出凝膠常規(guī)轉(zhuǎn)膜后在5%的脫脂奶粉中封閉2 h，加1 ∶1 000稀釋的β-actin兔mAb，搖床搖蕩孵育4 ℃過(guò)夜，PBST漂洗過(guò)后將膜與HRP結(jié)合的二抗(抗兔 IgG)1 ∶1 000稀釋室溫?fù)u蕩孵育2 h[4]。然后用PBST充分洗膜后將顯影液加于PVDF膜上，在顯影儀上顯影。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR) 應(yīng)用RNeasy mini Kit提取RNA，具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書；核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定抽提RNA的濃度，根據(jù)High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；以cDNA為模板，擴(kuò)增TCF7L2片段，選β-actin作為內(nèi)參[5-6]。TCF7L2上游引物：5′-AAACAGGAATCGTCCCAGAGTG-3′，下游引物：5′-CTCAGCTACGACCTTTGCTCTCA-3′；β-actin上游引物：5′-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，下游引物：5′-GCCGATCCACACGGAGTACTT-3′。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 將SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株分別接種到6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度約為80%時(shí)，用無(wú)菌移液器槍沿孔中軸線輕輕劃過(guò)，然后用37 ℃預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除漂浮細(xì)胞，加入培養(yǎng)基；置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)0、14 h后拍照，觀察劃痕愈合情況并測(cè)量。

1.3.7 耐藥實(shí)驗(yàn) 收集SGC-7901/CON及SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株，分別制成濃度為10×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液,接種于6孔板,每孔2 ml。分別加入5種不同濃度的化療藥物，即順鉑0.01、0.1、1、10、100 μmol/L,卡鉑0.01、0.1、1、10、100 μmol/L，每個(gè)藥物濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，另設(shè)2個(gè)復(fù)孔不加藥物作為空白對(duì)照。37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用PBS洗2次，用500 μl的0.25%胰酶消化10 min，再加入500 ml PBS,用1 ml移液槍吹打均勻，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算各組的平均值。

1.3.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 裸鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。將SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株用胰酶消化后，分別制成濃度為5×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，在每一只裸鼠的左側(cè)肋部皮下注入200 μl SGC-7901/CON的單細(xì)胞懸液，在上述裸鼠的右側(cè)肋部皮下注入200 μl SGC-7901/TCF7L2的單細(xì)胞懸液，共接種6只裸鼠，比較SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2的腫瘤生長(zhǎng)情況[7-8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSDt檢驗(yàn)，方差不齊者采用Games Howell檢驗(yàn)。兩組獨(dú)立樣本的比較，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布者采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若不服從正態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株顯微鏡下形態(tài)差異 在光學(xué)顯微鏡下觀察SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株和SGC-7901/CON細(xì)胞株形態(tài)差異。光鏡下SGC-7901/CON細(xì)胞形態(tài)一致，呈圓形，胞質(zhì)內(nèi)顆粒物質(zhì)較少，而SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞形態(tài)多樣，偽足增多，體積增大，胞質(zhì)內(nèi)顆粒物質(zhì)增多，見(jiàn)圖1。

2.2 TCF7L2在SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株中高表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，TCF7L2蛋白在SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞中的表達(dá)量較SGC-7901/CON細(xì)胞中明顯升高，見(jiàn)圖2，RT-PCR結(jié)果表明TCF7L2 mRNA在SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株中明顯較SGC-7901/CON細(xì)胞株高表達(dá)(P=0.02)，見(jiàn)圖3。

2.3 TCF7L2的高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移 光學(xué)顯微鏡下觀察顯示SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞14 h后爬行的距離明顯大于SGC-7901/CON細(xì)胞株，對(duì)兩者的結(jié)果進(jìn)行量化，結(jié)果顯示在14 h內(nèi)SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞爬行的距離明顯大于SGC-7901/CON細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，見(jiàn)圖4。

2.4 SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株對(duì)鉑類化療藥物的耐受性明顯強(qiáng)于SGC-7901/CON細(xì)胞株 耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)藥物濃度<100 μmol/L時(shí)，SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株對(duì)順鉑和卡鉑的耐藥性明顯強(qiáng)于SGC-7901/CON細(xì)胞株(P值均為0.03)，當(dāng)藥物濃度≥100 μmol/L時(shí)，SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株和SGC-7901/CON細(xì)胞株對(duì)順鉑和卡鉑的耐藥性無(wú)明顯差異(P=0.12，P=0.16)，見(jiàn)圖5。

圖1 顯微鏡下觀察SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異 ×200

圖2 Western blot檢測(cè)TCF7L2在SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株中的表達(dá)

圖3 RT-PCR檢測(cè)TCF7L2 mRNA在SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞中的表達(dá)

A：SGC-7901/CON細(xì)胞株；B： SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株；與SGC-7901/CON細(xì)胞株比較：*P<0.05

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2的轉(zhuǎn)移性 ×100

A：SGC-7901/CON細(xì)胞株；B：SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株；1：0 h；2：14 h；與SGC-7901/CON細(xì)胞株比較：**P<0.01

2.5 SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)較SGC-7901/CON細(xì)胞株更易成瘤 按1.2.8項(xiàng)建立小鼠模型，7 d后所有接種點(diǎn)均成瘤，生長(zhǎng)20 d后測(cè)量移植瘤的體積和質(zhì)量，結(jié)果顯示SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞移植瘤體積較SGC-7901/CON細(xì)胞的移植瘤大(P=0.02)，質(zhì)量也明顯較SGC-7901/CON細(xì)胞的移植瘤重(P=0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6。

3 討論

研究[9]顯示在胃癌的發(fā)展過(guò)程中Wnt信號(hào)異常激活，包括Wnt表達(dá)的頻率上調(diào)[10]，以及β-catenin/TCF4的核異位現(xiàn)象，初步確認(rèn)了Wnt通路參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。 TCF7L2是TCF家族的一員，是Wnt通路中最為重要的下游轉(zhuǎn)錄因子[11]。當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常激活時(shí)，未被降解的β-catenin進(jìn)入核內(nèi)，與 TCF7L2的相關(guān)結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，并與其他轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合使下游靶基因過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。 因此，TCF7L2基因的轉(zhuǎn)錄活性是維持細(xì)胞惡性表型所必需的，是開啟下游靶基因轉(zhuǎn)錄的先決條件，成為了Wnt信號(hào)通路的分子開關(guān)。

圖5 SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株對(duì)鉑類化療藥物的耐藥性差異

A：細(xì)胞株對(duì)順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)；B：細(xì)胞株對(duì)卡鉑耐藥實(shí)驗(yàn)；與SGC-7901/CON比較：*P<0.05,**P<0.01

本研究通過(guò)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得穩(wěn)定的SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株，SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株在形態(tài)學(xué)上較對(duì)照細(xì)胞形態(tài)多樣，偽足增多，體積增大，胞質(zhì)內(nèi)顆粒物質(zhì)增多。經(jīng)RT-PCR和Western blot證實(shí)該細(xì)胞株的TCF7L2基因和蛋白表達(dá)明顯增高。劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株的遷移能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞株。耐藥試驗(yàn)結(jié)果顯示SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株對(duì)鉑類的耐藥性明顯強(qiáng)于SGC7901/CON細(xì)胞株，小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)表明SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株在小鼠體內(nèi)成瘤能力較SGC-7901/CON細(xì)胞株明顯增強(qiáng)。SGC-7901/TCF7L2和SGC-7901/CON細(xì)胞株唯一的不同就是TCF7L2基因的表達(dá)量不同，由此可以說(shuō)明上述的現(xiàn)象是由TCF7L2基因過(guò)表達(dá)引起的。因此該研究證明TCF7L2基因可以增強(qiáng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的惡性生物學(xué)特性。

SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株的建立為胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供基礎(chǔ)，也為體外研究TCF7L2在胃癌的轉(zhuǎn)移、耐藥以及胃癌的不良預(yù)后方面中的作用提供模型。TCF7L2可能成為胃癌患者對(duì)化療的敏感性及不良預(yù)后的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)[13]。

圖6 SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的差異

A：移植瘤的最終質(zhì)量；B：移植瘤的最終體積；1：SGC-7901/CON細(xì)胞株；2：SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株；與SGC-7901/CON細(xì)胞株比較：*P<0.05

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Establishment of the human gastric cancer SGC-7901/TCF7L2 cell line and observing its biological characteristics

Fu Cuiqun1,2, Shen Guodong1,2, Shen Gan1,2，et al

(1DeptofGeriatrics,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001;2AnhuiProvincialKeyLaboratoryofTumorImmuneandNutritionalTherapy,Hefei230001)

ObjectiveToestablishhumangastriccancerSGC-7901/TCF7L2celllineandobserveitsbiologicalcharacteristics. MethodsStableplasmidtransfectiontechniquewasusedtoobtainhighTCF7L2proteinexpressionofgastriccancercelllineSGC-7901/TCF7L2andidlingcontrolSGC-7901celllines(SGC-7901/CON).RT-PCRandWesternblotwereusedtodetectSGC-7901/TCF7L2andSGC-7901/CONtwocelllinesofTCF7L2genemRNAandproteinexpressionlevels;undertheopticalmicroscope,toobserveandcomparethemorphologicaloftwocelllines.Woundhealingexperimentswereusedtocomparetheabilityofmigrationbetweenthetwocelllines.Cellcountsweredetectedbothcisplatinandcarboplatindrugresistance.Tumor-burdenedexperimentsinnudemicewereusedtocomparetheabilityoftumorigenicitybetweentwocelllines.ResultsStablytransfectedtechnologysuccessfullyestablishedstableSGC-7901/TCF7L2cellline,whichcomparedwithSGC-7901/CONcellline,mRNAandproteinexpressionofTCF7L2amountweresignificantlyincreased;undertheopticalmicroscope,SGC-7901/TCF7L2celllinehadmorphologicaldiversity,increasedpseudopodiaandvolume,moreparticulatematterinthecytoplasmofparticulatemattercomparedwithSGC-7901/CONcellline.Migrationandtoleranceofplatinumcomparedwithcontrolcelllinewassignificantlyenhanced.ThetumorigenicityofSGC-7901/TCF7L2celllineinmicealsosignificantlyenhanced. ConclusionTCF7L2genecanenhancethebiologicalcharacteristicsofmalignantgastriccancercelllineSGC-7901.TheestablishmentofSGC-7901/TCF7L2celllineprovidesthebasisfortheresearchondevelopmentandmechanismofgastriccancer,anditisalsohelpfulforthedevelopmentoftargeteddrugs.

gastriccancer;SGC-7901/CONcellline;SGC-7901/TCF7L2cellline;TCF7L2

安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：1408085MH167)；安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：1301042094)

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院老年病科，合肥 2300012腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001

付翠群，女， 碩士研究生； 胡世蓮，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail: hushilian@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.006.html

R 735.2

A

1000-1492(2016)11-1579-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.006

2016-07-04接收