糖蛋白質組學中基于化學反應的富集方法研究進展

包慧敏, 謝力琦, 陸豪杰

(復旦大學化學系, 生物醫(yī)學研究院和老年醫(yī)學研究中心 上海 200433)

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糖蛋白質組學中基于化學反應的富集方法研究進展

包慧敏, 謝力琦, 陸豪杰*

(復旦大學化學系, 生物醫(yī)學研究院和老年醫(yī)學研究中心 上海 200433)

蛋白質糖基化是一種廣泛存在的重要的蛋白質翻譯后修飾,糖基化肽在總酶解肽中占的比例不超過5%,這使得糖肽的分離富集成為糖蛋白質組學研究發(fā)展的關鍵技術之一。在諸多糖蛋白質組富集技術中,化學方法是富集技術的主導,本文從化學反應的角度介紹糖基化蛋白質富集的技術進展。富集過程按照連接和釋放分別討論,在連接過程中,重點介紹硼酸化學法、肼化學法、胺化學法和肟點擊法;在釋放過程中,以N-糖蛋白的酶釋放法和O-糖蛋白的β-消除法為主導,一并介紹了最新的氧化斷裂釋放的化學法。最后,討論總體富集策略的發(fā)展現(xiàn)狀。該文以糖蛋白富集的共價反應為核心,分析不同方法的優(yōu)缺點以及各技術在糖蛋白質組學研究中的應用和貢獻。

糖蛋白質組;蛋白質糖基化;糖蛋白;富集;連接/釋放;共價反應;綜述

蛋白質糖基化在細胞間的識別、信息交流和傳遞中發(fā)揮重要的生物學功能。糖基化蛋白質在病原對宿主的感染、癌癥的發(fā)生和轉移等生物過程中起重要的作用[1,2]。蛋白質糖基化的異常和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用在臨床上的腫瘤標志物中有一半以上是糖蛋白[3]。甲胎蛋白(AFP)就是一種被廣泛應用于肝癌早期臨床診斷的血清糖蛋白,肝癌病人甲胎蛋白糖鏈上的核心巖藻糖含量顯著增加[4,5]。已有研究表明,以蛋白質的核心巖藻糖化水平作為疾病診斷標志物比蛋白質水平更靈敏、更具特異性[6]。此外,用于前列腺癌診斷的前列腺特異性抗原(PSA)、用于胰腺癌監(jiān)測的癌抗原19-9(CA19-9)、用于乳腺癌監(jiān)測的癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原CA27-29和CA-125等都是糖基化蛋白質[7]。

哺乳動物蛋白質中超過50%發(fā)生了糖基化,但糖基化肽卻僅占蛋白質酶解肽的2%～5%[8],加上糖鏈的微觀不均一性以及在檢測過程中非糖肽對糖肽質譜信號的抑制,這些都限制了糖蛋白檢測的靈敏度[9]。將糖肽從復雜體系中高選擇性地分離富集出來并達到質譜可以檢測的水平是糖蛋白質組研究首先要解決的一個基礎問題。

目前已經(jīng)發(fā)展了多種糖蛋白的富集方法,按照作用原理可以分為通過非共價鍵連接的方法和通過化學反應形成共價鍵連接的方法。通過非共價鍵連接的方法包括親和法(凝聚素法和免疫法)和親水法。凝集素本身的特性使凝聚素法不具備普適性,且作用較弱[10,11]。免疫法利用抗原抗體結合的專一性,主要是在含有O-GlcNAc(O連接的N-乙酰葡糖胺)的糖蛋白或糖肽中應用,該方法缺乏通用性[12,13]。親水法利用糖鏈多羥基的親水性進行分離富集,由于肽段親水基團的干擾,不可避免地存在非特異性吸附[14,15]。以上非共價連接方法的共同特點是選擇性不好或普適性不夠;而共價連接法利用糖基本身的活性基團(多羥基或氧化后的醛基)與固定相上的功能基團形成的共價鍵為作用力,結合牢固,可承受強烈的洗滌條件,因而在富集過程中有更高的選擇性。

通過化學反應形成共價鍵進行富集的方法包括硼酸化學法、肼化學法、胺化學法和肟點擊法。其中硼酸化學法利用糖鏈的順式鄰二醇結構可形成環(huán)狀二酯進行富集,有條件溫和、反應可逆和不破壞糖鏈結構的特點;其他3類方法均需要將糖肽通過高碘酸鈉預氧化產(chǎn)生醛基,利用醛基的反應活性進行富集。由于共價連接法有高選擇性的突出優(yōu)點,加上和新型材料的兼容性,有越來越多的商品化試劑涌現(xiàn),共價連接法富集是糖蛋白質組學研究中最活躍的領域。共價連接法包括共價連接肽鏈和共價連接糖鏈,共價連接糖鏈居多,是本文重點討論的內容。

1 共價反應連接法

糖蛋白富集包括兩個關鍵過程:糖鏈的連接和釋放。糖鏈上特殊的鄰位多羥基結構,是糖蛋白富集中共價反應連接法的基礎。在連接過程中,根據(jù)糖鏈與外源功能基團的共價反應類型分為:硼酸化學法、肼化學法、胺化學法和肟點擊化學法。富集過程中共價連接反應原理見圖1。其中,硼酸化學法普適性強,能特異性富集所有順式鄰二醇結構的糖。肼化學法、胺化學法和肟點擊法這3種方法都需要預氧化,將多羥基結構通過氧化反應轉變?yōu)榉磻钚愿叩娜┗?醛基可以與酰肼發(fā)生肼腙反應(肼化學法),醛基可以與酰胺/苯胺發(fā)生胺化反應(胺化學法),醛基還可以與羥胺生成肟(肟點擊法)。所有的共價連接法在連接過程中對N-糖、O-糖等均沒有明顯的歧視效應。

圖 1 糖蛋白富集過程中共價連接反應原理圖Fig. 1 Schematic diagrams of covalent reactions for conjugation during glycoproteins enrichment a. oxidation of cis-diol groups on glycans to aldehyde groups; b-f. covalent coupling glycoproteins to solid phase. Chemical conjugation methods include (b) boronic acid chemistry between cis-diol groups and boronic acids, and covalent reactions between aldehyde groups and the other functionalized groups, such as (c) hydrazide, (d) reductive amination, (e) nonreductive amination and (f) oxime click chemistry.

1.1 硼酸化學法

硼酸化學法利用硼酸基與糖鏈上的順式二羥基的可逆結合進行富集,在堿性條件下,硼酸基與鄰位順式二醇發(fā)生酯化反應形成環(huán)狀二酯;當溶液調至酸性條件下時,反應逆向進行,環(huán)狀二酯發(fā)生水解釋放出完整糖肽[16]。該二酯的解離常數(shù)大約在10-3～10-4數(shù)量級,據(jù)硼酸衍生物和反應底物的不同而異[17]?？赡娣磻Y合常數(shù)低,伴隨著相對低的選擇性,將硼酸固定修飾在低吸附的固相表面將有助于該問題的解決。目前,有大量工作圍繞硼酸功能化新材料作為固相載體輔助糖蛋白的富集進行,均取得不錯的效果。

磁性納米顆粒擁有大的磁效應系數(shù),在溶液中容易分離,是一種理想的糖肽分離富集基質。本課題組[18]成功地合成了硼酸功能化的“核-衛(wèi)星”結構的新材料,以Fe3O4@SiO2為“核”,以硼酸功能化的金納米粒子Au@B(OH)2為“衛(wèi)星”,中間以長的有機鏈相連。金納米顆粒增加固相表面積,長的有機鏈減少了空間阻力,抑制了非特異性結合。將這一硼酸修飾的材料用于結腸癌組織中糖肽的富集,鑒定到155個糖蛋白,194個糖基化位點,其中有165個糖基化位點為首次報道(占85.1%)。由于合成材料表面不可能完全被硼酸基團覆蓋,所以材料表面非特異性吸附很難避免。進一步利用聚甲基丙烯酸甲酯修飾的納米顆粒競爭性地吸附非糖肽,通過兩種不同修飾表面的納米顆粒的協(xié)同作用,極大地提高了糖蛋白的選擇性,簡化了洗滌的步驟,糖肽的回收率提高到90%[19]。同時,也有報道將硼酸修飾到磁性碳納米管[20]、兩性離子包被的核殼結構的磁納米顆粒[21]上。介孔納米顆粒由于其具有高比表面積、大的孔容、均勻的孔徑分布等優(yōu)勢被用于蛋白質/肽的吸附,發(fā)展了兩步法合成硼酸功能化的介孔硅材(FDU-12-GA)并用于糖肽富集。將糖肽的檢測限降低了兩個數(shù)量級,大表面積和空間限域效應加速了反應的發(fā)生,上樣時間縮短到15 min[22]。更進一步,硼酸嫁接介孔材料MCM-41利用硼酸的選擇性和材料體積排阻的特點在糖肽富集中展現(xiàn)了優(yōu)良的選擇性(糖肽和非糖肽的物質的量比為1∶100)、高檢測靈敏度(fmol)、大結合容量(40 mg/g)和高回收率(高達88.10%)[23]。

樹枝狀材料有多位點和親水的特點,Wang等[24]將其功能化衍生,發(fā)現(xiàn)硼酸嫁接在樹枝狀材料上顯示了很多的優(yōu)點,如:有很好的酸解離常數(shù),可達到10-5～10-6mol/L,比單個硼酸鍵合高出3～4個數(shù)量級;HRP(horseradish peroxidase)的結合容量可達(0.41±0.06) μmol/g,鑒定到9個糖基化位點,檢出限達到10-14mol/L;結合/解離過程快,結合過程為1 min,解離過程為5 min,而通常硼酸粒子富集過程需1 h;對寡糖耐受。為了兼容體內糖蛋白存在的近中性環(huán)境,避免硼酸法在堿性條件下富集引起的糖蛋白降解。Zhang等[25]合成磁性核殼微球Fe3O4@PAA-AOPB,殼上修飾功能化苯硼基團,該基團的pKa接近7,可以與順式二醇形成五元環(huán)酯,該硼酸功能化的微球展現(xiàn)了對糖蛋白的高選擇性的優(yōu)點(HRP和牛血清白蛋白(BSA)的質量比達1∶80)。

劉震課題組[26]長期從事硼親和材料用于分離和分子識別的研究,他們總結出硼酸的親和力與硼酸鍵的pKa之間的規(guī)律。通常硼酸鍵pKa低,硼酸親和過程需要相對低的pH條件,同時具有較高的親和力。另外,硼酸的親和力與硼酸連接的配基結構以及硼酸修飾的支持介質有關,它們共同決定了親和反應過程中與硼酸親和作用力相競爭的二級作用力(氫鍵、離子鍵、疏水作用)的強弱,最終反映在硼酸的親和能力上。他們總結了低pKa的硼酸結構類型,做了糖類物質的高效硼親和固相標記[27],并發(fā)展了新的硼酸親和方法用于糖蛋白的測定[28,29]。他們的工作對功能化硼酸配基的結構給出了一定的理論指導,對現(xiàn)有工作結果給出了很好的解釋。目前硼酸化方法能夠在接近中性的條件下實現(xiàn)與順式二醇的反應,然而糖蛋白中有很多伯胺基團的存在,因此該方法離實際糖蛋白的富集還有很大的距離。

1.2 肼化學法

肼化學法和硼酸化學法同樣是利用糖蛋白糖環(huán)上的鄰二醇結構進行富集,不同的是肼化學法需要先將糖鏈上鄰二羥基的結構氧化成醛基,醛基與肼基發(fā)生共價反應生成腙鍵,故又稱肼腙法。肼化學反應法中的功能基團是肼基,可以是苯肼或酰肼,通過酰肼富集N-糖蛋白的選擇性可達90%[30]。

2003年,Zhang等[31]使用此反應建立了N-糖蛋白固相萃取(solid phase extraction ofN-linked glycopeptides, SPEG)法,將肼化學為基礎的方法用于N-糖肽富集。肼化學法可以結合不同的固定相,比如肼磁珠[32]、金納米顆粒[33]、聚合物[34]、樹枝狀聚合物[35],已發(fā)展了一系列功能化材料用于糖蛋白的選擇性富集。本課題組[34]設計并合成了肼基功能化的磁納米材料(Fe3O4@PMAH),通過聚合物包被磁納米顆粒,表面羧基與己二酸二酰肼形成肼功能化的磁球。豐富的肼基團可以高效并特異地富集糖肽,磁核便于溶液中的分離,親水的聚合物表面能夠減少非特異性吸附。為滿足低豐度痕量糖蛋白的檢測,需要發(fā)展更加靈敏、快速的富集新方法。本課題組[35]設計合成了肼功能化的樹枝狀材料,結合過濾輔助(FASP)技術用于高靈敏和高選擇性富集N-糖肽的研究。樹枝狀聚合物(PAMAM)可以溶解于水相,并且表面擁有豐富的反應基團,因此在保證滿足低豐度糖肽高效富集的同時,均相溶液反應保證了富集的重復性。將該方法應用于人血清樣品中糖肽的分析,成功檢測到158條糖肽,鑒定到60個不同的糖蛋白。

肼化學法和肽N糖酰胺酶F(PNGase F)結合富集N-糖蛋白在糖蛋白質組學中的應用最為廣泛[36,37],也可以結合其他酶選擇性地釋放特定的糖肽。肼化學法也可通過改變氧化反應的條件,選擇性氧化唾液酸的側鏈[38]、甘露糖片段的順式鄰二醇、葡萄糖片段的反式鄰二醇、O-GlcNAc蛋白質的乙酰葡糖氨基[39],實現(xiàn)對特定結構糖肽/糖蛋白的富集。肼化學反應法有反應專一性高、無位點偏向性、共價腙鍵穩(wěn)定的優(yōu)點;但肼化學法富集屬于多步驟反應,條件不易控制,且操作較復雜,還有耗時較長的缺點。

1.3 胺化學法

胺化學法反應的功能基團是氨基,糖鏈上經(jīng)過氧化后的醛基與固相載體上的氨基反應。胺化反應的關鍵步驟是羰基和氨基在酸性條件下生成Schiff堿,因Schiff堿的穩(wěn)定性較差,通常是通過NaBH4還原為穩(wěn)定的C-N單鍵最終形成穩(wěn)定的仲胺,稱為還原胺化法[40];或通過與能產(chǎn)生共軛的氨化物反應,比如苯胺,可以增強產(chǎn)物的穩(wěn)定性,稱為非還原胺化法。

和肼化學法相比,還原胺化減少了質譜分析前脫鹽的步驟,可以簡化操作。本課題組[41]設計并通過一步法合成了氨基功能化的磁性納米顆粒,用于N-糖基化肽的富集,縮短提取時間到4 h,糖肽的檢測靈敏度提高了2個數(shù)量級。在5 μL的人血清中鑒定到111個N-糖基化位點和108條糖基化肽,并成功將核酸酶B從牛血清中富集出來。在實際樣品中,胺化反應可能會存在肽上伯胺與醛基的副反應,使非糖肽競爭性地抑制氨基磁珠對糖肽的富集。根據(jù)胺化機理,胺化反應要先形成Schiff堿為中間態(tài),而在還原之前形成Schiff堿的過程是可逆的,大量存在的非糖肽會競爭性地和氧化后的醛基結合。鄒漢法課題組[42]通過預先對肽鏈進行二甲基化封閉再用胺化學法富集糖肽,大幅度地提高了糖肽富集的效果,N-糖基化位點鑒定數(shù)量提高了110%(從126個到264個),對于N端是Ser/Thr的N-糖肽,則從2個增加到25個。

胺化反應中間體Schiff堿不穩(wěn)定,不同于脂肪胺的是芳香胺與醛基反應產(chǎn)生的Schiff堿由于形成大的共軛體系可以增加其穩(wěn)定性,不需要將C=N雙鍵還原為C-N單鍵,而且共軛的Schiff堿在寬的pH范圍內穩(wěn)定[43],可以進一步簡化操作。用苯胺代替脂肪胺與寡糖鏈的還原端生成穩(wěn)定的胺化產(chǎn)物,該方法已經(jīng)成功地用于糖鏈衍生的質譜鑒定中[44]。本課題組[45]設計并合成了苯胺功能化的磁納米材料,將非還原胺化反應引入糖肽的富集中,發(fā)展了新的N-糖蛋白分離富集方法。

胺化學法與肼化學法類似,無偏向性,通過探索適合的含有共軛基團的試劑、發(fā)展非還原胺化,減少反應步驟,簡化操作。胺化學法是近幾年新發(fā)展的糖蛋白分離富集方法,利用胺化學法對糖蛋白大規(guī)模普適性分離富集的應用還有待進一步發(fā)展。

1.4 肟點擊化學法

肟化反應是含有羰基的化合物(醛、酮類)與羥胺作用生成含有肟基C=NOH的反應。該反應是典型的親核加成反應,經(jīng)過加成消除歷程。和酰肼比較,羥胺由于α-效應具有更強的親核能力[46]。加上條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定的優(yōu)勢,肟點擊化學被用于很多領域,在糖組學上已經(jīng)用于糖還原端標記的糖印跡[47]。受糖印跡的啟發(fā),肟點擊化學法被用于唾液酸化糖肽的富集[48]。

Zeng等[49]利用唾液酸側鏈的多羥基容易被氧化的特征,發(fā)展肟點擊的方法標記唾液酸化蛋白質,并用于活細胞表面唾液酸化蛋白質的標記和示蹤。步驟為:高碘酸鈉溫和氧化唾液酸產(chǎn)生醛基,苯胺催化與帶有生物素標簽的羥胺生成穩(wěn)定肟鍵,最后,鏈酶親核素富集細胞表面唾液酸化的糖蛋白。苯胺催化可以加速肟鍵生成,只需要低濃度的羥胺-生物素試劑,在中性條件下就可以標記細胞表面絕大部分唾液酸化的糖蛋白,同時不改變細胞活性。最近,發(fā)展了羥胺功能化的生物素作為連接分子,針對含有特定糖鏈(比如末端是唾液酸或半乳糖)的糖蛋白,通過肟化學法連接上生物素,最后通過商品化的鏈酶親核素樹脂分離富集,糖蛋白富集獲得高的特異性[50]。

以上工作集中在標記示蹤,本課題組[51]將肟點擊與新材料結合,發(fā)展了用于N-糖肽富集的方法。首先設計并合成了羥胺功能化的磁性納米顆粒,然后將氧化后的糖鏈通過肟化學連接。該方法富集過程在1 h以內,靈敏度提高到fmol水平,體現(xiàn)了良好的選擇性(糖肽和非糖肽的物質的量比為1∶100)和重復性(變異系數(shù)CVs<20%),同時運用該方法成功將人類大腸癌患者血清中的N-糖基化蛋白質分離出來。

綜上所述,硼酸化學法反應可逆、溫和,適合對完整糖蛋白的分析,但選擇性不高。醛基為基礎的肼化學法、胺化學法和肟化學法雖然有預氧化步驟,增加了實驗時間和操作的復雜度,但通過氧化產(chǎn)生的高活性醛基大大提高了糖肽富集的選擇性和特異性。結合不同特點的新材料,發(fā)展新的方法,可以滿足不同類型樣品的研究需要。

2 糖蛋白釋放方法

蛋白質主要的糖基化類型有兩種:一種是N-糖基化,糖基片段通過氮原子鏈接在天冬酰胺的側鏈上,PNGase F酶可以特異地切割天冬酰胺和糖鏈之間的連接;另一種為O-糖基化,糖基片段通過氧原子鏈接在絲氨酸或蘇氨酸的側鏈上,O-糖基化蛋白質在堿性條件下易發(fā)生β-消除反應。對于這兩類糖基化蛋白質,富集后的釋放原理見圖2。

圖 2 糖蛋白富集后的糖鏈或蛋白質的釋放方法示意圖Fig. 2 Schematic diagrams of the released glycans or proteins after glycoproteins enrichment a. N-glycosidase F (PNGase F) for N-glycoproteins, b. β-elimination to O-glycoproteins. GlcNAc: N-acetylglucosamine.

2.1N-糖蛋白的PNGase酶切法

酶切的方法可以用來分離糖鏈和肽鏈,常用的是PNGase和糖苷酶(glycosidase)兩類酶,糖苷酶包括糖苷內切酶(endoglycosidase, Endo)和糖苷外切酶(exoglycosidase, Exo)。

PNGase F是目前普遍使用的鑒定N-糖基化位點的酶,在糖基化的研究中應用廣泛。楊芃原課題組[52,53]將PNGase F酶結合同位素標記用于糖基化位點的定量研究。利用Endo不同亞型對糖型的專一性可以鑒定糖基化位點以及糖鏈結構信息。將Endo H與PNGAse F酶結合使用,從大鼠肝臟組織中鑒定到1 063個高甘露糖型和雜合型N-糖基化位點及相應的560個N-糖蛋白,其中大部分位點為首次發(fā)現(xiàn)[54]。錢小紅課題組[55,56]采用可特異性酶切復雜型核心巖藻糖結構的Endo F3酶從人血漿樣品中發(fā)現(xiàn)了超過100個含核心巖藻糖的糖基化位點,并發(fā)展了相應的MRM定量技術。對于過于復雜的糖鏈,將多種糖苷外切酶組合,即可分析糖鏈的組成、序列、連接和構象。促紅細胞生成素和人血漿銅藍蛋白的N-糖鏈結構得到精細解析就是成功的例子[57,58]。

2.2O-糖蛋白的β-消除法

O-糖蛋白缺乏如PNGase F這樣具有普適性的酶,O-糖基化蛋白質研究的發(fā)展受到一定的限制。在對O-糖蛋白分離富集的研究中,β-消除米氏加成(β-elimination/Michael addition reaction)法的應用最為廣泛。β-消除米氏加成法利用O-鏈接的糖蛋白在堿性條件下容易發(fā)生β-消除反應形成雙鍵,而反應生成的α、β不飽和雙鍵易與親核基團發(fā)生加成反應,在O-鏈接的位點處修飾上連接基團,并利用連接基團的特有性質來選擇性富集目標糖蛋白或糖肽。

Wells等[59]第一次將此方法從磷酸化肽的分析中遷移到O-糖肽的分離富集中,首次利用O-糖蛋白在堿性條件下發(fā)生β-消除反應產(chǎn)生不飽和雙鍵,然后再加入二硫蘇糖醇(DTT)或生物素戊胺(BAP)等親電試劑進行米氏加成反應,然后通過巰基親和柱或生物素親和柱對標記了的O-糖肽進行親和富集。他們發(fā)現(xiàn)在溫和的β-消除反應中O-糖肽要比磷酸化肽更容易發(fā)生反應,而且可以通過磷酸化酶的處理消除磷酸化肽的干擾。實驗不僅對合成的O-糖肽進行了成功的分析,而且對從鼠腦中純化的Synapsin Ⅰ、核孔復合物中的Lamin B receptor及nucleo porin Nup155進行了糖基化位點分析,還預測如果使用同位素標記的DTT可以進行定量分析。本課題組[60]使用氨水、甲基胺、二甲基胺3種親核試劑對β-消除后的O-糖肽進行米氏加成,對比了3種試劑的反應效果,并利用LC-MS測定了O-糖肽的糖基化位點。在此方法的反應條件下,磷酸化蛋白質或烷基化的半胱氨酸也容易發(fā)生消除加成反應,可以經(jīng)過磷酸化酶處理或對照反應來消除干擾。另外,比如烷基化的半胱氨酸也會同時發(fā)生反應,需要另外一些對照實驗來降低假陽性。

2.3 次氯酸鈉消除法

尋找化學試劑、通過化學反應氧化釋放糖鏈的研究一直在進行。N-溴代丁二酰亞胺(NBS)作為一種溫和的氧化試劑,可以對糖肽氧化脫羧,當肽鏈較短時,通過氧化斷裂可以得到完整糖鏈[61]。最近,Song等[62]報道了一種氧化釋放糖鏈(oxidative release of natural glycans,ORNG)的新方法。利用次氯酸鈉氧化,從N-糖蛋白和O-糖蛋白以及糖脂上釋放出糖鏈,分別獲得自由的還原態(tài)N-糖和被氧化為酸的O-糖,鞘糖脂則產(chǎn)生糖腈。

之前,次氯酸鈉已經(jīng)被用于蛋白質的降解,可以高效、選擇性地降解天然糖復合物中糖苷的配基部分[63]。次氯酸鈉可以幫助溶解酵母細胞壁并促進葡聚寡糖的提取[64],還能降解黏多糖(主要是葡糖氨基葡聚糖)[65,66]。目前尚沒有次氯酸鈉對糖蛋白的降解方面的系統(tǒng)研究。作為化學試劑,次氯酸鈉的氧化沒有選擇性,凡樣品中含有伯胺(比如肝磷脂、硫酸肝素)或含有巰基、碳碳雙鍵等結構,均會被部分氧化降解。通過加化學試劑氧化釋放糖鏈,此法可以與共價連接肽鏈的方法配合使用,作為糖鏈釋放的方法之一,糖蛋白質組學研究中也迫切需要一種無歧視的糖鏈釋放方法。

3 糖蛋白的富集策略

3.1 “top down”與“bottom up”策略

利用化學反應法對糖蛋白的分離富集進行研究的策略可分為“top-down”(捕獲糖蛋白)和“bottom-up”(捕獲糖肽)。硼酸化學法多采用“top down”策略,Sparbier等[67]利用硼酸修飾的磁珠對人血清中的糖蛋白進行了富集,證明了硼酸富集法和凝集素富集法的互補性。目前肼化學反應法多采用“bottom up”策略。Sun等[68]認為“top down”策略會受到蛋白質溶解性差和空間位阻的影響,而且被捕獲蛋白質經(jīng)酶解后的樣品仍然很復雜,因而“bottom up”策略富集效果更好。他們做了5個標準糖蛋白糖肽的富集實驗證明自己的觀點。

3.2 糖蛋白共價連接和釋放的整體策略

糖蛋白通過共價連接和釋放可以用于富集N-糖肽或N-糖鏈,固相萃取法富集糖蛋白的兩種流程見圖3,首先通過醛基的共價反應將糖蛋白連接在固相介質上,PNGase F酶切釋放N-糖肽或N-糖鏈進行分析。

圖 3 糖蛋白固相萃取富集策略Fig. 3 Strategies of solid-phase extraction for glycoproteins a. glycoproteins are conjugated to solid phase by glycans. N-linked peptides are then released by PNGase F and analyzed by LC-MS/MS. b. glycoproteins are conjugated to solid phase by N-terminal of peptides. N-glycans are then released by PNGase F and analyzed by LC-MS/MS.

Zhang等[31,69]發(fā)展了SPEG法,該方法分為4步:(1)高碘酸氧化糖鏈上的順式二羥基為醛基;(2)醛基和肼樹脂上的肼基反應生成腙;(3)胰蛋白酶處理固定在肼珠上的糖蛋白,洗去非糖基化的肽段;(4)PNGase F酶解處理,釋放特異性結合在肼珠上的N-糖肽。這是肼化學法富集N-糖肽的經(jīng)典方法。

之后,Zhang課題組[70]發(fā)展了一系列技術,豐富了蛋白糖鏈和糖蛋白的富集以及定量方法。其中以胺化反應為基礎,利用商品化的氨基樹脂,發(fā)展了GIG(glycoprotein immobilization for glycan extraction)方法富集糖鏈,通過PNGase F釋放N-糖鏈,羥胺釋放O-糖鏈,實現(xiàn)全部糖鏈的分析。在唾液酸化糖鏈的定量研究中,通過選擇性氧化唾液酸產(chǎn)生醛基,苯胺同位素試劑作為標簽連接在唾液酸端,通過質譜峰對唾液酸化蛋白質進行定量分析[71]。隨后將該法用于對CHO細胞的唾液酸化N-糖的定量研究,證實建立方法的實際應用價值[72,73]。同樣,以胺化反應為基礎發(fā)展了糖肽的標記試劑QUANTITY(quaternary amine containing isobaric tag for glycan)[74],可供4組樣品定量,并考察了作為定量方法的各項指標[75]。

前面提過的SPEG法是基于肼腙反應的原理建立的完整N-糖肽富集技術路線,目前該方法得到了廣泛應用[76,77]。最近建立的NGAG(N-linked glycans and glycosite-containing peptides)法[78]可以同時獲得N-糖蛋白、N-糖基化位點、N-糖鏈的信息,為全面系統(tǒng)研究N-糖蛋白提供了技術路線。

與此同時,該課題組[79]還發(fā)展了針對糖鏈的肼腙可逆萃取(reversible hydrazine solid-phase extraction, rHSPE)法。在肼樹脂上,于甲醇-乙酸(85∶15, v/v)溶液中將糖鏈固定,在體積分數(shù)為10%的甲酸水溶液中水解腙鍵釋放所有糖鏈,并應用該方法從血清中富集經(jīng)過PNGase F酶切得到的N-糖鏈。該方法利用肼腙法的無選擇富集和酸性條件可逆釋放糖鏈的特征,發(fā)展了糖肽可逆富集的新方法。

3.3 特殊糖蛋白的富集策略

3.3.1 末端是唾液酸的糖蛋白的富集

唾液酸化的糖蛋白廣泛參與人體的生理、病理過程。唾液酸通常位于糖蛋白的糖基化非還原末端,是糖基化修飾的終末步。通過改變氧化的條件,可實現(xiàn)選擇性地氧化唾液酸化的糖鏈/糖肽,具體方法為:選用溫和的條件(0～4 ℃, 1～2 mmol/L高碘酸鈉,<10 min)選擇性地氧化唾液酸側鏈的多羥基為醛基;富集后,酸性條件下可以選擇性地水解斷裂唾液酸的糖苷鍵,釋放得到去唾液酸的糖肽。Nilsson等[80]通過低溫度和低氧化劑濃度選擇性地將唾液酸的甘油側鏈氧化,肼固相載體富集加上酸水解糖苷鍵,富集唾液酸化的糖肽/糖蛋白獲得成功。

3.3.2O-GlcNAc修飾蛋白質的富集

O-GlcNAc修飾的蛋白質是一類特定的單糖糖基化蛋白質,由O-GlcNAc轉移酶和O-GlcNAc糖苷酶調控。Klement等[81]將SPEG方法拓展到O-GlcNAc修飾的蛋白質的研究中,不同的是肼腙法富集后使用羥胺水解切斷腙鍵的方法釋放糖肽。在果蠅蛋白酶體復合物的研究中,通過富集鑒定到4個O-GlcNAc蛋白質并能指認O-GlcNAc修飾位點。方法分為3步:(1)高碘酸鈉氧化O-GlcNAc蛋白糖環(huán)上的反式二醇(氨基葡萄糖3,4位),氧化開環(huán)生成醛基;(2)酰肼樹脂捕獲O-糖蛋白,結合胰蛋白酶酶解去除非糖肽;(3)在羥胺的條件下發(fā)生腙鍵斷裂,釋放出利于質譜分析的開環(huán)糖肟衍生物。該法主要的不足在于O-GlcNAc活性低,需要使用劇烈的衍生化條件,會導致側鏈副反應發(fā)生,比如位于N端的Ser/Thr殘基的氧化。同時,帶有O-GlcNAc肽段釋放的特異性和釋放效率均不能滿足大規(guī)模O-GlcNAc蛋白的鑒定要求,但仍然是現(xiàn)有方法的很好補充。

3.3.3 N端N-糖基化肽的富集

N-糖基化發(fā)生在肽段N端的糖肽(PGANs)在所有胰蛋白酶酶解的N-糖肽中僅占約10%,常規(guī)的方法很難鑒定到這個位點的糖基化。張玉奎課題組[82]發(fā)展了新的方法,通過琥珀?；x擇性標記肽鏈N端,以此輔助去糖基化酶發(fā)揮作用,從而實現(xiàn)PGANs的檢測。該課題組[83-85]還在糖肽富集的工作中做了很多整體柱,充分發(fā)揮了化學反應在糖蛋白研究中的特長。

3.3.4 富集方法的聯(lián)合使用

為了獲得更加豐富的糖蛋白信息,將不同的富集技術聯(lián)合使用,這在糖蛋白質組表達譜的深度挖掘中發(fā)揮著明顯的作用。肼化學法與傳統(tǒng)的凝集素富集結合,從小鼠組織中鑒定到2 352個糖蛋白和6 367個N-糖基化位點[86]。肼化學法與親水法(HILIC)結合在人肝組織中鑒定到14 480個N-糖肽,對應2 210個N-糖基化蛋白質,鑒定到4 783個N-糖基化位點[87]。

4 展望

目前,雖然估計有超過50%的蛋白質發(fā)生了糖基化,但現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫條目中只有約10%注釋為糖蛋白,這也反映了蛋白質糖基化研究的難度和意義。目前尚沒有一種技術可以富集細胞中所有的糖蛋白,已有的富集方法如凝集素親和層析法、共價連接固相捕獲法等已得到了很好的應用,但要實現(xiàn)更全面、更低豐度糖蛋白的鑒定和分析,有賴于富集新方法和新技術的不斷開發(fā)以及與質譜技術的更好結合。相信隨著各項分析技術的不斷成熟,糖蛋白質組將會在表達蛋白質組的進一步完善、疾病蛋白質組生物標志物的發(fā)現(xiàn)及藥物靶點的研究中發(fā)揮更大的作用。

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Research advances of enrichment approaches based on chemical reactions in glycoproteomics

BAO Huimin, XIE Liqi, LU Haojie*

(DepartmentofChemistry,InstitutesofBiomedicalSciencesandResearchCenteronAgingandMedicine,FudanUniversity,Shanghai200433,China)

Protein glycosylation is one of the most common and important post-translational modifications (PTMs) in mammalian cells. Glycopeptides usually exist at relatively low abundance (less than 5%) compared with non-glycosylated peptides. So, enrichment approaches are important for the analysis of glycoproteome. Approaches based on chemical reactions are the main trend, here we discuss them from chemical viewpoint. There are two main processes for enrichment of glycoproteins, glycoprotein conjugation and the release from solid phase. In conjugation process, we introduce four types of chemical reactions: one is boronic acid chemistry based on reaction between boronic acid andcis-diol groups on free glycans, and the other three are covalent reactions between aldehyde groups and functionalized groups, hydrazide for hydrazone ligation, alkylamine for reductive amination, aniline for nonreductive amination and aminooxy group for oxime click chemistry. In release process,N-glycosidase (PNGase) F forN-glycosylated proteins,β-elimination reaction forO-glycosylated proteins and a bleach method published recently are introduced, and the oxidative releasing of natural glycans is also introduced here. In addition, analysis strategies forN-/O-glycoproteins are discussed, including detection in glycoproteins and site-specific glycan occupancies. This review mainly focuses on the currently available chemical approaches based on covalent reactions for enrichment of glycoproteins, as well as new materials derivatized with different functional groups. We compare the advantages and disadvantages of different methods and try to evaluate the contribution and future trend based on authors viewpoint.

glycoproteome; protein glycosylation; glycoprotein; enrichment; conjugation/release; covalent reaction; review

10.3724/SP.J.1123.2016.09003

2016-09-01

國家重點研發(fā)項目(2016YFA0501303);國家自然科學基金(20905014,21335002); 上海市自然科學基金(14ZR1403600);上海市老年醫(yī)學臨床重點實驗室建設項目(13dz2260700).

Foundation item: National Key Research and Development Program (No. 2016YFA0501303); National Natural Science Foundation of China (Nos. 20905014, 21335002); Shanghai Natural Science Foundation (No. 14ZR1403600); Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine Construction Project (No. 13dz2260700).

O658

A

1000-8713(2016)12-1145-09

鄒漢法研究員紀念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(021)54237618,E-mail:luhaojie@fudan.edu.cn.