蛋白質甲基化修飾的蛋白質組學分析方法新進展

王科云, 葉明亮, 鄒漢法

(中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室,國家色譜研究分析中心, 遼寧大連 116023)

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蛋白質甲基化修飾的蛋白質組學分析方法新進展

王科云, 葉明亮*, 鄒漢法#

(中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室,國家色譜研究分析中心, 遼寧大連 116023)

蛋白質的甲基化修飾是一類重要的翻譯后修飾。但與磷酸化、糖基化和泛素化等翻譯后修飾相比,甲基化修飾的蛋白質組學分析方法開發(fā)還是一個較新的研究領域。近幾年,由于甲基化修飾在表觀遺傳調控中的重要作用,這一修飾類型得到了越來越多的關注,相關的分析技術和分析方法也取得了較多進展。其中,基于質譜的蛋白質組學分析方法在甲基化修飾中發(fā)揮著關鍵的作用,實現(xiàn)了這一甲基化修飾的高通量分析。該綜述將從甲基化修飾的分離富集、假陽性率控制以及定量蛋白質組學等方面對一些蛋白質甲基化修飾的分析技術和方法的最新進展進行介紹。

蛋白質甲基化修飾;選擇性富集;可信度控制;定量蛋白組學;綜述

蛋白質的甲基化修飾由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)依賴的甲基轉移酶催化產(chǎn)生[1,2],是最常見的蛋白質翻譯后修飾之一。甲基化修飾在很多生理過程的調控中發(fā)揮著重要的作用[3]。研究表明:蛋白質甲基化可以調節(jié)目標蛋白質分子內(nèi)或分子間的相互作用;影響它們和RNA的親和作用,從而影響多種細胞進程,如轉錄調節(jié)、細胞定位、核糖體裝配、RNA加工、不均一核糖核酸核糖體蛋白(hnRNPs)的成熟、蛋白質-蛋白質相互作用、準確翻譯、細胞核運輸、蛋白質與核酸的運輸和代謝、細胞內(nèi)信號傳導等[4-6]。最近發(fā)現(xiàn)的具有賴氨酸去甲基化活性的酶[7,8]說明蛋白質的賴氨酸甲基化修飾也是一類動態(tài)調控的修飾類型,這進一步促使研究人員深入研究甲基化修飾在生理過程中的調控作用。到目前為止,對組蛋白以及參與轉錄翻譯過程的蛋白質上的甲基化已經(jīng)有了比較深入的研究[5,9-12],但對其他蛋白質上發(fā)生的甲基化修飾參與的調控過程的認識還比較欠缺。目前已知的大多數(shù)甲基化事件發(fā)生在精氨酸和賴氨酸殘基上,屬于N-甲基化,并且存在不同的甲基化類型,比如賴氨酸可以發(fā)生單甲基化、二甲基化和三甲基化,而精氨酸能發(fā)生單甲基化、對稱二甲基化和非對稱二甲基化[13]。除了N-甲基化,甲基化修飾還可以發(fā)生在氧和硫中心原子上[13],但相關的研究還比較少。雖然已有大量的文獻報道蛋白質的甲基化修飾,由于甲基化的多樣性及復雜性,在蛋白質組學水平上鑒定甲基化位點仍然十分困難,這主要是因為蛋白質中甲基的引入除了增加甲基化氨基酸殘基的空間位阻和減少氨基酸殘基的氫鍵作用力外,并沒有顯著改變氨基酸殘基的凈電荷或者等電點[14],這使甲基化蛋白質/肽段的高效分離富集比較困難,極大地影響了分析的靈敏度。

甲基化肽段的分離富集是對甲基化蛋白質組(methylome)[15]進行深入研究的關鍵。蛋白質的甲基化是一種低豐度的翻譯后修飾類型,因而在基于質譜的“鳥槍法”[16]蛋白質組學研究中容易受到非甲基化肽段的干擾而難以得到高效的鑒定。目前用于甲基化蛋白質/肽段分離的方法主要包括基于抗體的免疫沉淀法、基于結合結構域的免疫沉淀法和色譜分離法。這些富集處理可以顯著提高樣品中甲基化肽段的豐度,從而使低豐度的甲基化肽段也可以被鑒定到,因而是深入研究甲基化修飾的一個關鍵步驟。假陽性率(false discovery rate, FDR)的控制是甲基化修飾研究中另一個需要重視的問題。甲基化引入的相對分子質量差異(+14 Da)與很多氨基酸之間的相對分子質量差異相同[17],因而在基于質譜的分析中,單純依靠相對分子質量之間的差異很難將甲基化修飾與可能發(fā)生的氨基酸替換有效區(qū)分開,所以會引入很大的不確定性。為了提高鑒定結果的可信度,重標甲硫氨酸-細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記(heavy methyl stable isotope labelling by amino acids in cell culture, hM-SILAC)技術被用來在甲基化修飾上引入額外的質量差異,從而提升甲基化修飾與氨基酸替換的質量區(qū)分度。此外,基于定量蛋白質組學的研究策略也在甲基化修飾的研究中得到了廣泛的應用。通過與細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記(stable isotope labelling by amino acids in cell culture, SILAC)技術相結合,可以對不同生理狀況下甲基化修飾的豐度進行定量分析,從而更加深入地研究甲基化修飾參與的生理過程。到目前為止,基于質譜的“鳥槍法”分析策略在甲基化修飾的高通量研究中發(fā)揮了關鍵的作用,也取得了一系列的重要進展。在本綜述中,我們將從甲基化修飾蛋白質/肽段的分離富集、假陽性率的控制、定量分析等方面來介紹甲基化蛋白質組的研究新進展。

1 甲基化修飾蛋白質/肽段的分離富集

蛋白質甲基化修飾的豐度很低,在進行液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS/MS)分析時,甲基化肽段的鑒定經(jīng)常會受到高豐度非甲基化肽段的干擾。因此,對甲基化修飾進行深入研究的關鍵步驟就是對樣品進行預處理,提高甲基化肽段的豐度?；诳贵w的免疫沉淀方法是蛋白質組學研究中很常見的一種分離翻譯后修飾肽段的方法,這一方法已經(jīng)在蛋白質的乙酰化修飾[18,19]、泛素化修飾[20,21]等翻譯后修飾的研究中得到了廣泛的應用。但由于甲基化引入的修飾基團比較小,對修飾后的氨基酸殘基的理化性質改變也比較小,所以在利用抗體進行分離富集的時候,富集特異性比較差,尤其是對于賴氨酸甲基化[22,23],其檢測靈敏度及特異性完全依賴于制備抗體的質量。2014年,CST(Cell Signaling Technology)公司開發(fā)了一類針對甲基化模體(motif)的廣譜抗體[24],這類抗體對甲基化修飾肽段具有比較高的結合能力和特異性,在單次實驗中從人源細胞系和老鼠組織樣品中鑒定到超過1 000個精氨酸甲基化修飾位點和160個以上的賴氨酸甲基化修飾位點。這些抗體在后續(xù)的研究中得到了廣泛的應用,被用于甲基化位點的規(guī)?；b定以及甲基化修飾的定量研究[25,26],極大地促進了甲基化修飾的深入研究。Garcia課題組[27]開發(fā)了一類賴氨酸甲基化抗體,從HeLa細胞中鑒定到493個甲基化肽段,對應413個蛋白質上的552個賴氨酸甲基化位點,取得了比較好的分離效果。并在后續(xù)的研究中從食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)細胞中鑒定到多達1 800個賴氨酸單甲基化修飾位點[28],是到目前為止單次實驗鑒定到的最大的賴氨酸甲基化位點數(shù)據(jù)集。與二甲基化和三甲基化相比,賴氨酸單甲基化修飾對賴氨酸殘基的理化性質改變比較小,這一特點使得化學富集和特異性抗體的制備都比較困難。趙英明課題組[29]巧妙地通過化學衍生法在單甲基化的賴氨酸殘基上添加一個丙?；鶊F,而二甲基化賴氨酸和三甲基化賴氨酸不能與丙酸酐(propionic anhydride)反應,因此該方法可以特異性地對單甲基化賴氨酸進行衍生化反應,而且該反應在細胞裂解液中的效率高達98%以上;衍生得到的丙酰-單甲基化基團化學結構復雜度提高,可以制備特異性較高的抗體,用來對單甲基化修飾的賴氨酸肽段進行親和富集;最后通過高通量的質譜分析以達到賴氨酸單甲基化修飾的規(guī)模化鑒定。作者對多種人源細胞(HeLa、K562、SW620、A549和SMM7721細胞)進行了分析,共鑒定出446個修飾位點,對應398個蛋白質,大多數(shù)修飾位點都屬首次發(fā)現(xiàn)；作者還將該方法用于人肝癌組織樣品分析,鑒定出59個修飾位點,對應49個蛋白質。

近年來,基于甲基化賴氨酸結合結構域的親和方法也被引入甲基化蛋白質組的研究中,主要用于賴氨酸甲基化蛋白質的分離。Gozani研究組[22,23]利用含甲基化賴氨酸結合結構域的蛋白質為富集工具,對賴氨酸甲基化的蛋白質進行了分離。L3MBTL1蛋白質的三重惡性腦瘤域(the triple malignant brain tumor domains, 3×MBT)含有一個能識別甲基化賴氨酸的結合口袋,其特異性不受周圍氨基酸殘基的影響。作者制備了一種固載了3×MBT結合結構域的功能化樹脂,對HEK293T細胞中單甲基化和二甲基化賴氨酸的蛋白質進行分離并用質譜分析,成功鑒定了上百個甲基化事件。與此同時,Shawn研究組[30]利用HP1β上的染色質域對賴氨酸甲基化修飾的蛋白質進行分離,鑒定到一個高質量的HP1β相互作用蛋白質組數(shù)據(jù)集?；诮Y合結構域的甲基化蛋白質組的研究不僅擴展了已知的賴氨酸甲基化位點數(shù)據(jù)集,還加深了對甲基化引導的相互作用網(wǎng)絡的理解[30]。但這類結合結構域對甲基化肽段的作用力比較弱,所以不能有效地應用于甲基化肽段的富集,因而即使對甲基化蛋白質進行分離,酶解后樣品的復雜度還是很高,難以實現(xiàn)甲基化位點的高效鑒定[23]。

另外,基于親水色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)[31]、等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)以及強陽離子交換色譜(strong cation exchange chromatography, SCX)[31]的色譜分離方法也在甲基化修飾的高通量分析中得到了成功的應用。精氨酸的甲基化修飾容易發(fā)生在蛋白質的親水區(qū)域內(nèi),因而經(jīng)酶解得到的精氨酸甲基化肽段的親水性一般會比較強,可以通過親水色譜法對甲基化肽段進行一定程度的富集[31]。在對hM-SILAC標記的HeLa細胞的研究中,Acuto研究組[31]利用HILIC分離成功鑒定到131個蛋白質上的249個精氨酸甲基化位點,其中有190個位點是之前沒有報道過的新位點。另外,發(fā)生甲基化修飾后的賴氨酸殘基和精氨酸殘基的碳端(C端)不容易被胰蛋白酶識別而導致漏切。因為甲基化修飾不會改變賴氨酸殘基和精氨酸殘基的帶電性質,這些漏切肽段會比普通的酶切肽段多帶一些正電荷,因而可以利用SCX對這些甲基化肽段進行分離。該研究組[31]利用低pH范圍的離線SCX分離策略,成功地鑒定到39個精氨酸甲基化位點,其中25個位點是之前沒有報道過的新位點。但是低pH范圍的SCX分離條件下,非甲基化的漏切肽段和含有組氨酸的肽段也會多帶一些正電荷,因而會對甲基化肽段的高效分離造成干擾。該研究組[31]報道,在甲基化肽段比較集中的SCX餾分中,含有組氨酸的肽段占全部肽段的60%～70%,極大地影響了分離的特異性。因為漏切位置多出的賴氨酸或者精氨酸,這些帶有漏切位點的甲基化肽段的等電點比普通酶切肽段的等電點高,因而可以利用等電聚焦對甲基化肽段進行分離。該研究組[31]通過分析包含已知精氨酸甲基化位點的肽段,發(fā)現(xiàn)90%以上的精氨酸甲基化肽段的等電點都大于9,因而可以利用這一性質對精氨酸甲基化肽段進行分離。在接下來的實驗中,作者利用等電聚焦分離和質譜分析,成功地鑒定到66個精氨酸甲基化位點,其中34個是新位點。但是由于缺乏pH范圍合適的梯度膠條(IPG strip),一些堿性太強的甲基化肽段不能得到很好的回收,因而影響了最終鑒定的甲基化位點數(shù)目。

另外一種方法是添加帶有反應基團的甲基供體對甲基化蛋白質進行標記[32,33],對帶有反應基團的蛋白質進行基于“生物正交化學”[34]的分離,然后通過質譜分析對這些甲基化蛋白質進行鑒定。Luo課題組[32,33]將SAM類似物的標記策略應用于全細胞體系蛋白質甲基化位點的修飾,結合生物素-親和素富集技術及質譜檢測技術發(fā)展了一種基于SAM類似物的生物正交蛋白質底物譜技術。由于這些SAM類似物的結構與天然的SAM存在比較大的差異,因而通過基因工程手段獲得的能夠特異性識別對應SAM類似物的甲基轉移酶研究策略僅能獲得某一個甲基轉移酶的底物蛋白質譜,不能真正成為甲基化蛋白質組學研究的工具。為了尋找一種能被天然的蛋白質甲基轉移酶廣泛利用的SAM類似物,并應用于甲基化蛋白質組學的研究,趙宗保課題組和鄒漢法課題組[35]針對一株SAM營養(yǎng)缺陷型酵母發(fā)展了一種基于allyl-SAM代謝標記的甲基化蛋白質組學研究策略。釀酒酵母被敲除掉基因SAM1和SAM2后自身不能合成SAM。在培養(yǎng)酵母的時候,添加能被甲基轉移酶廣譜利用的SAM類似物allyl-SAM,它可以在SAM轉運蛋白的作用下進入胞內(nèi)并對潛在的甲基化底物蛋白質進行烯丙基化修飾。通過合成含生物素官能團的探針分子,借助“生物正交化學”反應對烯丙基修飾的蛋白質進行捕獲并利用生物素與親和素樹脂之間的相互作用對目標蛋白質進行分離。通過質譜分析檢測及數(shù)據(jù)庫搜索鑒定,成功實現(xiàn)了釀酒酵母甲基化蛋白質組的規(guī)?；治?為釀酒酵母甲基化功能的深入研究奠定了基礎。對鑒定結果進行詳細的分析,共篩選出167個目標甲基化蛋白質,其中24%的蛋白質之前曾被證實為甲基化蛋白質,另外76%的甲基化事件則為首次發(fā)現(xiàn)。對得到的甲基化蛋白質組學數(shù)據(jù)進行生物信息學分析,結果表明細胞質和核糖體是釀酒酵母甲基化蛋白質豐度比較高的區(qū)域,而甲基化蛋白質的生物學功能較多涉及mRNA結合、核糖體裝配、生物大分子復合、連接酶活性以及參與細胞質翻譯和氨基酸代謝等,這表明甲基化修飾可能在這些生理過程中發(fā)揮著重要的調控作用?；凇吧镎换瘜W”的方法,其最主要的缺點是只能鑒定到甲基化蛋白質而不能鑒定到具體的甲基化位點,限制了這類方法在甲基化蛋白質組學研究中的廣泛應用。

目前,這些分離富集方法在應用于甲基化蛋白質/肽段分析時都存在特異性差的缺點,嚴重阻礙了蛋白質甲基化修飾的高通量分析。因而,該領域的研究重點在于開發(fā)選擇性更高的甲基化肽段分離方法,為規(guī)?；治黾谆揎椊M及闡釋甲基化參與調控的生理過程提供重要的技術支撐。

2 甲基化修飾鑒定的可信度控制

假陽性率的控制是蛋白質甲基化研究中另外一個需要關注的問題。甲基化修飾引入的相對分子質量差異(+14 Da)與很多氨基酸之間的相對分子質量差異相同。因而在基于質譜的分析中很難有效區(qū)分甲基化修飾與可能發(fā)生的氨基酸替換[17]。hM-SILAC策略通常被用來提高鑒定結果的可信度。2004年,Ong等[17]發(fā)展了一種基于抗體富集和細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記相結合的鑒定和定量甲基化位點的方法。這一方法的大致流程如圖1所示:輕標樣品中加入正常的甲硫氨酸,重標樣品中加入同位素標記的甲硫氨酸;在細胞培養(yǎng)時,添加的甲硫氨酸可以在SAM合成酶的作用下轉化為甲基供體-SAM,從而在輕標樣品和重標樣品中引入不同的同位素標簽。將輕標樣品和重標樣品按照1∶1混合,在基于質譜的鑒定過程中,不同標記的同一條甲基化肽段將成對出現(xiàn),它們除了相對分子質量上的差異外,物理化學性質基本一致。這一策略首先通過數(shù)據(jù)庫搜索鑒定肽段序列和修飾位點,然后比較其一級譜的XIC(extracted ion current)圖,借助甲基化位點的定量信息進一步確定甲基化位點。通過這一策略對鑒定的甲基化肽段進行后續(xù)確認，可以顯著提高位點鑒定的可信度。另外,在該策略中,同一條肽段相當于通過兩張獨立的質譜碎裂譜圖得到鑒定,進一步增加了鑒定的可靠性。通過結合抗體富集和hM-SILAC策略,作者在宮頸癌細胞(HeLa)中共鑒定到33個甲基化蛋白質上的59個甲基化位點。但由于甲基化抗體的富集特異性不是很高,所以鑒定的甲基化位點數(shù)目受到了限制。hM-SILAC策略可以顯著提高甲基化鑒定的可信度,但是這一方法也存在不足。首先,[13CD3]-甲硫氨酸不僅可以標記發(fā)生甲基化的氨基酸殘基,它自身也會參與蛋白質的合成,這就增加了后續(xù)數(shù)據(jù)庫檢索和分析的復雜性,也會對鑒定結果的可信度造成影響。其次,SAM-依賴的蛋白質甲基化伴隨著副產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸的產(chǎn)生。半胱氨酸合酶是細胞自身存在的一種重要的酶,能以甲基四氫葉酸酯作為甲基供體在高半胱氨酸上加一個甲基使其生成甲硫氨酸[36]。因此,雖然在細胞培養(yǎng)基中有標記的甲硫氨酸,但無標記的甲硫氨酸也可以由細胞自身合成,從而產(chǎn)生無標記的SAM。細胞的這一生理過程使重標樣品標記不完全,從而使分析復雜化,而且會增加分析結果的假陰性。

圖 1 hM-SILAC策略的分析流程Fig. 1 Workflow of the hM-SILAC approach

圖 2 MILS策略的分析流程Fig. 2 Overview of workflow for the MILS strategy MILS: methylation by isotope labeled SAM; SAM: S-adenosyl methionine.

為了克服傳統(tǒng)的hM-SILAC標記方法的缺陷,鄒漢法課題組與趙宗保課題組[37]合作發(fā)展了一種借助SAM營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株研究甲基化蛋白質組的方法(見圖2)。釀酒酵母在敲除基因SAM1和SAM2后自身不能合成SAM。通過在細胞培養(yǎng)基中添加同位素標記的SAM直接標記甲基化位點。然后利用在線多維液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術對釀酒酵母中的甲基化蛋白質和位點進行全面的鑒定分析。在SAM缺陷型細胞中,甲硫氨酸不能轉變?yōu)镾AM,因而添加的SAM是唯一的甲基供體,成對的峰(色譜峰面積1∶1)只會出現(xiàn)在含甲基化修飾的肽段上,可以極大地提高鑒定的可信度。在該文章中,作者還提出了一種MILS(methylation by isotope labeled SAM)假陽性控制策略,極大地提高了鑒定的可信度。傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)篩選策略考慮所有鑒定的肽段或者是有修飾的肽段,通過調節(jié)打分值來控制鑒定結果的假陽性率。但在甲基化修飾的研究中,由于多個可變修飾的引入,檢索空間急劇增大,假陽性率也會隨之提高,這就需要很高的打分值才能確保最終結果的可信度,而這會損失掉大量的甲基化位點信息。但在MILS策略中,同一條甲基化肽段可以通過成對出現(xiàn)的、由輕標和重標引入的兩個獨立的質譜數(shù)據(jù)進行鑒定,二級譜連續(xù)的b/y離子進一步提高了鑒定的可信度。通過對釀酒酵母細胞的甲基化蛋白質組進行全面分析,共鑒定了43個甲基化蛋白質,包括分布在64個甲基化中心的68個甲基化事件。這一結果表明釀酒酵母中超過2.6%的蛋白質可以發(fā)生甲基化修飾,這是迄今為止來自釀酒酵母的最全面的甲基化位點鑒定結果,發(fā)生在不同氨基酸殘基上的甲基化事件按數(shù)量排序如下:賴氨酸?精氨酸>天冬氨酸>天冬酰胺≈谷酰胺≈組氨酸>谷氨酸>半胱氨酸。此外,在重標SAM標記的樣品中基本上沒有鑒定到重標甲硫氨酸,說明這一方法有效地克服了傳統(tǒng)hM-SILAC方法的缺陷,加入的重標SAM并沒有轉化為重標甲硫氨酸,極大地提高了鑒定結果的可信度。但由于該方法未經(jīng)過抗體富集,對低豐度甲基化修飾肽段可能存在漏檢,一些已知的甲基化事件并未鑒定到。Acuto研究組[25]提出了一種標記策略iMethyl-SILAC(isomethionine methyl-SILAC)來避免含有甲硫氨酸肽段的干擾。在該策略中,作者利用兩種同位素標記的甲硫氨酸(見圖3)對樣品中的甲基化位點進行標記。T淋巴細胞分別在含有不同同位素標記的甲硫氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng),在收取細胞的時候按照細胞數(shù)目1∶1混合,然后進行液相色譜-串聯(lián)質譜分析。通過iMethyl-SILAC標記策略,酶解得到序列相同的甲基化肽段會帶有4 Da的相對分子質量差異,并成對(1∶1)出現(xiàn),而序列相同的含有甲硫氨酸的肽段相對分子質量基本相同,不會對甲基化肽段的假陽性率控制造成干擾。作者通過iMethyl-SILAC標記策略獲得了比傳統(tǒng)hM-SILAC策略更好的假陽性控制結果。通過結合抗體富集和SCX分級,作者從人源T細胞(human T cells)中共鑒定到1 257個蛋白質上的2 502個精氨酸甲基化位點,這是到目前為止單次實驗鑒定的最大精氨酸甲基化位點數(shù)據(jù)集。

圖 3 iMethyl-SILAC策略中使用的甲硫氨酸的結構Fig. 3 Structures of the methionine used in the iMethyl-SILAC strategy iMethyl-SILAC: isomethionine methyl-stable isotope labelling by amino acids in cell culture.

雖然通過hM-SILAC策略可以極大地提高甲基化位點鑒定的可信度,但這類方法也存在一定的局限性。由于同位素標簽是在細胞培養(yǎng)過程中引入的,因而難以用于組織樣品中甲基化位點的標記。為了實現(xiàn)組織樣品中甲基化修飾位點的高可信度鑒定,需要開發(fā)新的控制假陽性率的方法。

3 甲基化修飾的定量分析

蛋白質甲基化一直被認為是一種很穩(wěn)定的翻譯后修飾,直到2006年發(fā)現(xiàn)賴氨酸去甲基化酶[38],越來越多的證據(jù)表明蛋白質的甲基化修飾是一類動態(tài)調控的修飾類型[3]。研究不同生理狀態(tài)下甲基化水平的變化對于闡釋甲基化參與的調控過程十分重要,因而蛋白質甲基化的研究越來越側重于定量水平的分析。Shawn研究組[30]利用HP1β富集以及SILAC標記對DNA損傷修復過程中賴氨酸甲基化的動態(tài)變化情況進行了研究,利用LC-MRM-MS策略[39]對14個蛋白質上的19個賴氨酸甲基化位點在DNA損傷修復過程中的含量進行了定量分析。在依托泊甙(etoposide)的刺激之下,DNA-PKcs(catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase)第3 248位賴氨酸上的二甲基化含量上調了一百多倍,而蛋白質Ku80第7位賴氨酸的三甲基化含量則下調了一百多倍。這一結果表明,賴氨酸的甲基化修飾是高度動態(tài)變化的。Nielsen研究組[26]利用放線菌素-D(actinomycin D)抑制RNA聚合酶的轉錄活性,結合SILAC技術對轉錄過程中精氨酸甲基化的動態(tài)變化情況進行了分析。他們的結果表明,在抑制轉錄的幾個小時之內(nèi),有部分精氨酸修飾位點的單甲基化水平出現(xiàn)了明顯的下調,而這些位點的二甲基化水平和對應蛋白質的表達水平并沒有發(fā)生明顯的改變,這一結果表明精氨酸的單甲基化修飾可能存在著單獨的調控途徑。Nguyen研究組[28]利用賴氨酸單甲基化抗體和SILAC標記定量技術對正常的ESCC細胞和過表達SMYD2的ESCC細胞的賴氨酸單甲基化修飾水平進行分析,利用LLY-507(5-cyano-2′-[4-[2-(3-methyl-1H-indol-1-yl)ethyl]-1-piperazinyl]-N-[3-(1-pyrrolidinyl)propyl]-[1,1′-biphenyl]-3-carboxamide)對SMYD2進行抑制或者利用shRNA(short hairpin RNA)對SMYD2進行基因沉默,發(fā)現(xiàn)了35個具有下調趨勢的賴氨酸單甲基化修飾位點。為了研究T細胞的激活是否會對精氨酸的甲基化水平造成影響,Acuto課題組[25]利用抗體富集與SILAC標記定量技術對激活前后的精氨酸甲基化修飾水平進行了研究,共獲得365個甲基化肽段的定量信息,對應202個蛋白質上319個甲基化位點。另外,該研究組也對這些蛋白質表達水平的變化進行了分析,并利用對應蛋白質的定量信息對甲基化肽段的含量變化進行了校正,從而得到甲基化占有率方面的信息。他們的結果表明:27/282 (9.6%)的精氨酸甲基化位點的位點占有率確實因為T細胞的激活而發(fā)生了顯著性的變化。

目前,甲基化修飾的定量研究還處于比較初級的階段,主要集中在不同生理狀態(tài)下甲基化水平的差異分析上。甲基化修飾的絕對占有率對于深入研究甲基化的調控功能至關重要,這也是甲基化修飾定量研究的下一步努力方向。

4 展望

到目前為止,甲基化修飾的蛋白質組學研究還是一個較新的領域。鑒于甲基化修飾在很多生理過程的調控中都發(fā)揮著關鍵作用,而對甲基化修飾進行高通量分析對于深入了解甲基化修飾的調控機理至關重要,所以甲基化修飾的研究方法還需要進一步的發(fā)展。今后的研究重點包括開發(fā)選擇性更高的甲基化肽段分離方法、組織樣品中甲基化修飾位點的高可信度鑒定、甲基化修飾位點絕對占有率的分析,這些研究方向的突破也將為甲基化修飾組的規(guī)?；治黾瓣U釋甲基化參與調控的生理過程提供重要的技術支撐。

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Recent advances in proteomic analysis of protein methylation

WANG Keyun, YE Mingliang*, ZOU Hanfa#

(KeyLaboratoryofSeparationScienceforAnalyticalChemistry,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,NationalChromatographicResearchandAnalysisCenter,Dalian116023,China)

Protein methylation is one of the most important post-modificational modifications. Compared with the widely studied phoshporylation, glycosylation and ubiquitylation, the methylome analysis is still at nascent stage. In recent years, more and more attentions have been drawn to the researches of protein methylation for its important role in the epigenetic regulation and considerable advances have been achieved. Of them, the MS based proteomic approaches play a key role by achieving the high-throughput analysis of protein methylation. In this review, advances in proteomic analysis of protein methylation are summarized in three aspects: selective enrichment, identification confidence controlling and quantitative analysis.

protein methylation; selective enrichment; confidence controlling; quantitative proteomics; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08023

2016-08-22

基金委杰出青年基金(21525524);國家重點研發(fā)計劃(2016YFA0501402).

Foundation item: National Science Fund of China for Distinguished Young Scholars (No. 21525524); China State Key Basic Research Program Grants (No. 2016YFA0501402). # 鄒漢法研究員已于2016年4月25日去世。他是我們的導師,也是我國杰出的分析化學家,在蛋白質組等復雜體系的分離分析方面發(fā)展了多項具有原始創(chuàng)新意義的新型分析方法。蛋白質甲基化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾,但是其分析水平還比較低,是鄒老師領導我們致力攻克的一個重要難題。謹以此文紀念鄒老師,希望我們能在不遠的將來取得技術突破,解決這一分析難題。

O658

A

1000-8713(2016)12-1161-07

鄒漢法研究員紀念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0411)84379620,E-mail:mingliang@dicp.ac.cn.