邵天舒，周長(zhǎng)明，李 輝，郭 雷

（北京市藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）是北京市藥品檢驗(yàn)所承擔(dān)的2019年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種之一。該產(chǎn)品是由18種氨基酸按一定比例配制而成的滅菌水溶液。作為臨床上常用的一類平衡型氨基酸補(bǔ)充劑，主要用于不能口服或經(jīng)腸道補(bǔ)給營(yíng)養(yǎng)以及營(yíng)養(yǎng)不能滿足需要的患者通過(guò)靜脈輸注以滿足機(jī)體獲取氨基酸合成蛋白質(zhì)的需要［1-3］。其中，甲硫氨酸作為人體自身不能合成的8種必需氨基酸之一，含量占該產(chǎn)品氨基酸總量的5% 左右。因甲硫氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)中的硫元素帶有兩對(duì)孤對(duì)電子，極易與氧化劑發(fā)生氧化反應(yīng)生成甲硫氨酸亞砜，進(jìn)一步氧化還可生成甲硫氨酸砜（圖1）。已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述兩種物質(zhì)均存在引發(fā)肝癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)［4-6］：其中甲硫氨酸亞砜可能通過(guò)參與DNA甲基化而刺激小鼠肝癌的形成；而甲硫氨酸砜則可通過(guò)抑制酶前體降解途徑提高肝癌細(xì)胞中谷氨酰胺合成酶的活性，而后者是肝癌的一個(gè)重要分子標(biāo)記物。本品在生產(chǎn)灌裝過(guò)程中，若工藝控制不嚴(yán)極易混入氧氣，造成產(chǎn)品中存在一定量的氧殘留，可導(dǎo)致甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜的產(chǎn)生。

Figure 1 Generation of methionine sulfoxide and methionine sulfone Met: Methionine; MSO: Methionine sulfoxide; MSO2: Methionine sulfone

現(xiàn)行的法定標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)藥典》二部復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）品種項(xiàng)下尚未對(duì)甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜作為特定雜質(zhì)進(jìn)行控制［7］，造成產(chǎn)品質(zhì)量存在一定風(fēng)險(xiǎn)。為精準(zhǔn)控制產(chǎn)品工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量，在此次國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)的探索性研究過(guò)程中，本研究探索并建立了一種采用鄰苯二甲醛-巰基丙酸溶液為衍生劑，利用液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行柱前衍生，通過(guò)C18柱、梯度洗脫對(duì)甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜與其他氨基酸的衍生物進(jìn)行分離，并采用高靈敏度的熒光檢測(cè)器測(cè)定的分析方法，對(duì)此次評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)涉及的國(guó)內(nèi)7 家生產(chǎn)企業(yè)共計(jì)155 批樣品中甲硫氨酸的雜質(zhì)含量進(jìn)行了考察，并對(duì)部分企業(yè)的產(chǎn)品中甲硫氨酸亞砜含量偏高的原因進(jìn)行了初步探究。結(jié)果顯示，建立的方法在專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、定量限、檢測(cè)限和溶液穩(wěn)定性等一系列方法學(xué)指標(biāo)均良好，并在一定程度上優(yōu)于現(xiàn)有的其他測(cè)定方法。樣品中甲硫氨酸亞砜含量與樣品殘氧量存在一定相關(guān)性，而與抗氧劑的添加量并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

1 儀器與試劑

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（配有自動(dòng)進(jìn)樣器及FLD 檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；METTLERXA205 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；METTLER Seven Easy型酸度計(jì)（瑞士梅特勒公司）；GS1型頂空氣體測(cè)定儀（殘氧量測(cè)定用，英國(guó)Systech公司）。

甲硫氨酸亞砜（純度：99.9%，批號(hào)：BCBZ3966）、甲硫氨酸砜（純度：99.9%，批號(hào)：BCBV2699）、鄰苯二甲醛（美國(guó)Sigma 公司）；復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）（共涉及國(guó)內(nèi)7家企業(yè)（代號(hào)分別為B（11批）、F（40 批）、H（8 批）、G（16 批）、L（42 批）、C（1批）、D（37批）），3個(gè)規(guī)格（總氨基酸含量分別為5%、8.5% 及11.4%），共計(jì)155 批，均為2019年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品）；乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜純；其他試劑均為市售分析純；水為Millipore超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent Poroshell 120 EC-C18，3.0 mm×100 mm，2.7 μm），以醋酸鈉/四氫呋喃溶液（三水合乙酸鈉2.72 g 用適量水溶解，加入三乙胺180 μL、乙二胺四乙酸二鈉0.1 g、四氫呋喃3 mL，混勻加水至1000 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至7.2）為流動(dòng)相A，以醋酸鈉溶液（三水合乙酸鈉2.72 g 加至水200 mL 中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至7.2）-乙腈-甲醇（200∶400∶400）為流動(dòng)相B；按表1 進(jìn)行梯度洗脫；流動(dòng)相流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)233 nm，發(fā)射波長(zhǎng)441 nm；自動(dòng)進(jìn)樣器控溫8 ℃；采用儀器自動(dòng)程序進(jìn)樣：①吸取硼酸鹽緩沖液5 μL；②吸取衍生劑1 μL；③吸取水0 μL（洗滌進(jìn)樣針）；④吸取樣品1 μL；⑤吸取水1 μL；⑥在空氣中以最大速度混合6次；⑦等待1 min；⑧進(jìn)樣。

Table 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 衍生劑（鄰苯二甲醛-巰基丙酸溶液） 取鄰苯二甲醛80 mg，加入0.4 mol/L 硼酸緩沖液（pH 10.2）7 mL、乙腈1 mL、巰基丙酸125 μL，混勻，4 ℃保存。

2.2.2 硼酸鹽緩沖液 取硼酸鈉15.25 g，加水100 mL溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10.2。

2.2.3 對(duì)照品溶液 取甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜對(duì)照品各約50 mg，精密稱定，置100 mL量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置100 mL 量瓶，加水稀釋至刻度，制成每1 mL 約含甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜各5 μg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密量取復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）樣品2 mL，置20 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.5 空白對(duì)照溶液 除不加甲硫氨酸外，照《中華人民共和國(guó)藥典》復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）處方配制含其余17 種氨基酸及輔料焦亞硫酸鈉的溶液，作為空白對(duì)照溶液。

2.2.6 供試品添加對(duì)照品溶液 量取復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）樣品2 mL，置20 mL 量瓶中，并加入甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸砜對(duì)照品，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.3 結(jié) 果

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取空白溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液以及供試品添加對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果顯示對(duì)照品圖譜中甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜峰型良好，兩者分離度為9.52，供試品圖譜中兩者與前后雜峰分離度分別為4.93、2.19，空白輔料無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取甲硫氨酸亞砜對(duì)照品10.25 mg 至100 mL 量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻，作為甲硫氨酸亞砜對(duì)照品貯備液（甲硫氨酸亞砜質(zhì)量濃度：0.1025 mg/mL）；精密稱取甲硫氨酸砜對(duì)照品10.44 mg 至100 mL 量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻，作為甲硫氨酸砜對(duì)照品貯備液（甲硫氨酸砜質(zhì)量濃度：0.1044 mg/mL）；精密量取上述對(duì)照品貯備液各5 mL，置同一50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為混合線性對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述混合線性對(duì)照品貯備液0.25，0.5，2.5，5.0，7.5 mL，置20 mL 量瓶，加水稀釋至刻度，并取混合線性對(duì)照品貯備液原液，作為線性試驗(yàn)溶液。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，以各對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，按最小二乘法計(jì)算線性回歸方程。甲硫氨酸亞砜在0.1281 ～10.2500 μg/mL范圍內(nèi)，甲硫氨酸亞砜溶液的質(zhì)量濃度與峰面積的線性方程為Y =58.746x- 1.0501，r= 0.9999；甲硫氨酸砜在0.2610 ～10.4400 μg/mL范圍內(nèi)，甲硫氨酸砜溶液的質(zhì)量濃度與峰面積的線性方程為Y =47.240x- 1.0157，r= 0.9998。表明兩者在一定的范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系均良好。

2.3.3 檢測(cè)限與定量限 取線性試驗(yàn)用甲硫氨酸亞砜對(duì)照品貯備液（甲硫氨酸亞砜質(zhì)量濃度：0.1025 mg/mL）、甲硫氨酸砜對(duì)照品貯備液（甲硫氨酸砜質(zhì)量濃度：0.1044 mg/mL）各1mL，分別置100 mL 量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻。再將上述稀釋后的甲硫氨酸亞砜溶液、甲硫氨酸砜溶液逐級(jí)稀釋后注入液相色譜儀測(cè)定，至信噪比S/N 作為10∶1 為定量限，S/N 為3∶1 作為檢測(cè)限。結(jié)果：甲硫氨酸亞砜定量限為0.13 μg/mL，檢測(cè)限為0.04 μg/mL；甲硫氨酸砜定量限為0.26 μg/mL，檢測(cè)限為0.09 μg/mL。

Figure 2 HPLC chromatograms of system suitability testA:Standard solution; B:Sample solution; C:Blank solution; D:Sample solution with standard.1:Methionine sulfoxide; 2:Methionine sulfone

2.3.4 回收率 精密量取復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）樣品（批號(hào)：1118100305）2 mL，置20 mL量瓶，分別加入甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜混合對(duì)照品貯備液（含甲硫氨酸亞砜10.25 μg/mL 及甲硫氨酸砜10.44 μg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，各質(zhì)量濃度分別平行配制3份，分別精密量取上述各對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法分別計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.5 精密度 取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，甲硫氨酸亞砜峰面積RSD 為0.36%，甲硫氨酸砜峰面積RSD為0.64%。

2.3.6 重復(fù)性 取樣品（批號(hào)：1118100305），按照“2.2.4”項(xiàng)下供試品溶液配制方法配制6 份，作為重復(fù)性樣品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，重復(fù)性樣品溶液中甲硫氨酸亞砜含量的平均值為0.49 μg/mL，RSD 為0.71%；甲硫氨酸砜含量的平均值為0.23 μg/mL，RSD%為1.29%。

Table 2 Results of methionine sulfoxide and methionine sulfone recovery tests(n = 9)

2.3.7 穩(wěn)定性 取“2.4”項(xiàng)下供試品（批號(hào)：1118100305）溶液分別于0、2、4、8、12、16 h 進(jìn)樣，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，甲硫氨酸亞砜峰面積RSD 為0.12%，甲硫氨酸砜峰面積RSD 為0.30%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 樣品甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜的測(cè)定結(jié)果 取本品，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)7個(gè)廠家的155批樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

Table 3 Results of methionine sulfoxide and methionine sulfone determination from sample

2.3.9 樣品殘氧量的測(cè)定結(jié)果 取本品，用頂空氣體測(cè)定儀對(duì)7 個(gè)廠家的155 批樣品上部空間氣體中氧氣比例進(jìn)行了檢測(cè)，B、F、H、G、L、C、D 廠家產(chǎn)品殘氧量均值分別為0.091%、0.053%、0.127%、0.000%、0.065%、0.004%、0.041%。

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇

現(xiàn)有文獻(xiàn)資料中，可同時(shí)測(cè)定多種氨基酸混合產(chǎn)物中甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜的方法有肖玉霞等［8］的氨基酸分析儀法和李莉等［9］的HPLC直接測(cè)定法，上述方法雖均有一定的優(yōu)勢(shì)，但也存在諸多不足之處：氨基酸分析儀法需單獨(dú)購(gòu)置特定的儀器，成本較高，且該方法涉及的樣品系明膠水解產(chǎn)物，與復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）的氨基酸組成存在一定差異，是否適用于本品尚不可知；HPLC 直接測(cè)定法為保證甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜的分離，需將色譜柱柱溫嚴(yán)格控制在4 ℃，因而需配備帶有冷卻功能并精確控溫的柱溫箱，且該方法所用流動(dòng)相為含有離子對(duì)試劑的100% 水相且pH 低至1.9 對(duì)C18柱有一定損害，不利于大批量長(zhǎng)期測(cè)定用，此外因其測(cè)定波長(zhǎng)選用205 nm的末端吸收波長(zhǎng)，在檢測(cè)限和定量限方面也不及本方法靈敏。當(dāng)前，柱前衍生化測(cè)定的方法已成為氨基酸類化合物測(cè)定的一種常用方法［10-11］。本方法通過(guò)采用適當(dāng)?shù)木彌_體系及流動(dòng)相梯度洗脫條件，使樣品中的18 種氨基酸衍生產(chǎn)物均在15 min前洗脫，殘余的過(guò)量衍生劑在25 min之后洗脫，而待測(cè)的甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸砜的衍生產(chǎn)物在此兩者之間的水平基線區(qū)段出峰，避免了樣品中的其他18 種組分的干擾，同時(shí)選用檢測(cè)靈敏度更高的熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。此外，本實(shí)驗(yàn)還針對(duì)樣品自動(dòng)進(jìn)樣器柱前衍生程序中的關(guān)鍵項(xiàng)目鄰苯二甲醛（OPA）用量進(jìn)行了摸索，分別嘗試吸取OPA 0.5、1.0、2.0 μL。發(fā)現(xiàn)當(dāng)OPA 用量從0.5 μL增至1.0 μL時(shí)，相應(yīng)峰面積亦有所增大；但從1.0 μL 增至2.0 μL 時(shí)，不僅相應(yīng)峰面積不再增大，且在保留時(shí)間26 min 左右出現(xiàn)的過(guò)量的衍生劑峰明顯展寬，并對(duì)樣品中甲硫氨酸砜峰造成了一定干擾，故OPA 用量定為1.0 μL 為宜。全部方法學(xué)驗(yàn)證的一系列指標(biāo)均符合《中華人民共和國(guó)藥典》［12］。

3.2 甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜限度的確定

按本研究建立的方法對(duì)155 批樣品測(cè)定了甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸砜含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各批次樣品中均有甲硫氨酸亞砜檢出，不同廠家產(chǎn)品間甲硫氨酸亞砜含量差異較大，H企業(yè)產(chǎn)品的甲硫氨酸亞砜含量最高（均值達(dá)0.78%）；而G企業(yè)產(chǎn)品的甲硫氨酸亞砜含量最低（均值僅為0.05%）。另有D 企業(yè)的22 批樣品中檢出甲硫氨酸砜。由于《中華人民共和國(guó)藥典》該品種項(xiàng)下未涉及甲硫氨酸亞砜與甲硫氨酸砜的控制，而國(guó)外藥典亦未收錄此品種，按照復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）說(shuō)明書(shū)中最大日使用劑量計(jì)算，甲硫氨酸每日最大攝入量為7 g左右。參考ICH Q3b新藥制劑中雜質(zhì)限度的指導(dǎo)原則［13］，每日最大攝入劑量在100 mg ～2 g的，雜質(zhì)限度為0.2%（相對(duì)原料藥的百分比，下同）；每日最大攝入劑量在2 g 以上的，雜質(zhì)限度為0.15%，擬定復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜含量均不得過(guò)甲硫氨酸標(biāo)示量的0.2%。依據(jù)擬定的標(biāo)準(zhǔn)限度，155 批樣品中有27批甲硫氨酸亞砜含量超出限度，占比17.4%；甲硫氨酸砜含量均未超出限度。

3.3 雜質(zhì)來(lái)源分析

通過(guò)對(duì)各生產(chǎn)廠家所用甲硫氨酸原料藥的測(cè)定，均未檢出甲硫氨酸亞砜及甲硫氨酸砜，表明這兩種雜質(zhì)均非原料帶入，而是在制劑生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的。由于這兩種雜質(zhì)均是甲硫氨酸的氧化產(chǎn)物，其生成可能與產(chǎn)品生產(chǎn)灌裝過(guò)程中混入的氧氣有關(guān)。通過(guò)7 家生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品殘氧量均值的比較可見(jiàn)，H 企業(yè)產(chǎn)品殘氧量整體水平最高，其次是B 企業(yè)產(chǎn)品，而H 企業(yè)產(chǎn)品甲硫氨酸亞砜含量均值亦最高，B企業(yè)產(chǎn)品甲硫氨酸亞砜含量均值排第二位；而產(chǎn)品甲硫氨酸亞砜含量最低的G 企業(yè)，其產(chǎn)品殘氧量接近為零。表明甲硫氨酸氧化雜質(zhì)的產(chǎn)生與產(chǎn)品中殘留氧有明顯關(guān)聯(lián)。另外，H、B企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品均為5% 規(guī)格，依照藥典處方規(guī)定其抗氧劑焦亞硫酸鈉添加量為0.3 g/L，是8.5%、11.4%規(guī)格產(chǎn)品焦亞硫酸鈉添加量（0.03 g/L）的10倍，但前者甲硫氨酸氧化雜質(zhì)的含量均值卻比后者更高，此結(jié)果提示添加的抗氧劑是否發(fā)揮了預(yù)想的作用亦值得商榷。因此，為更好控制產(chǎn)品質(zhì)量，建議生產(chǎn)廠家進(jìn)一步優(yōu)化充氮工藝，同時(shí)對(duì)不同類型包材對(duì)產(chǎn)品殘氧量的影響進(jìn)行深入研究，以減少甲硫氨酸氧化雜質(zhì)的產(chǎn)生。同時(shí)建議在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增訂甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸砜的檢查項(xiàng)目，以對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行更為有效的控制。