腺苷酸活化蛋白激酶增強(qiáng)乳腺癌對(duì)多柔比星化療敏感性的機(jī)制

崔文賢，許柯青，李元國，陳桂金，陸小群

常州市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 常州 213011

腺苷酸活化蛋白激酶增強(qiáng)乳腺癌對(duì)多柔比星化療敏感性的機(jī)制

崔文賢，許柯青，李元國，陳桂金，陸小群

常州市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 常州 213011

背景與目的：腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)在調(diào)控細(xì)胞代謝和能量平衡方面起著重要作用，并與細(xì)胞增殖、生存和多種信號(hào)通路密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)AMPK參與腫瘤的抑制和耐藥。該研究旨在探討AMPK對(duì)多柔比星抑制乳腺癌作用的影響及其機(jī)制。方法：采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)多柔比星作用后對(duì)MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞增殖的影響；Hoechst染色法觀察各組細(xì)胞凋亡形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)3組細(xì)胞多柔比星累積量；蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)各組細(xì)胞中耐藥蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：多柔比星對(duì)MCF-7/adr細(xì)胞增殖抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性，其作用24、48 h的IC50值分別為(36.8±2.1)和(28.8±1.3)μg/mL。過表達(dá)AMPKα可增加多柔比星對(duì)MCF-7/adr細(xì)胞的生長抑制作用，呈劑量和時(shí)間依賴性，其作用24、48 h的IC50值分別為(16.0±0.7)和(4.2±0.2)μg/mL。熒光形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)多柔比星聯(lián)合AMPKα能誘導(dǎo)MCF-7/adr細(xì)胞凋亡。1.0 μg/mL多柔比星作用48 h后，MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞的凋亡率分別為(12.0±1.4)%、(12.7±1.6)%和(32.0±4.2)%，MCF-7/adr細(xì)胞中AMPKα過表達(dá)明顯提高M(jìn)CF-7/adr細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性。熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)顯示，過表達(dá)AMPKα能明顯提高細(xì)胞內(nèi)多柔比星的累積量，具有濃度依賴性。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MCF-7/adr和MCF-7/ adr-vector細(xì)胞比較，MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞中Bax、細(xì)胞色素c(Cyto c)的釋放、caspase-3和多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶降解產(chǎn)物(cleaved PARP)蛋白表達(dá)明顯增加，而細(xì)胞外排泵P-糖蛋白(P-gp)和Bcl-2蛋白表達(dá)降低。結(jié)論：AMPKα可通過抑制耐藥細(xì)胞外排泵以及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)乳腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)多柔比星的化療敏感性。

乳腺癌；耐藥；腺苷酸活化蛋白激酶；凋亡；多柔比星

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，居女性各類惡性腫瘤死亡率的首位。近年來，由于早期發(fā)現(xiàn)和輔助治療的改進(jìn)，乳腺癌的治療療效已明顯提升，其中多柔比星(doxorubicin)顯示出對(duì)晚期乳腺癌獨(dú)特的療效，延長乳腺癌患者生存期［1］。

然而，如果多柔比星出現(xiàn)耐藥或達(dá)到累積量，乳腺癌臨床治療就相對(duì)困難。因此，尋找可靠的靶點(diǎn)來提高乳腺癌對(duì)多柔比星敏感性可能是乳腺癌治療上的突破點(diǎn)。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的代謝和能量平衡［2］。同時(shí)，大量研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞中存在能量異常的現(xiàn)象［3］，在大部分乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)AMPK低表達(dá)［4］。在人肺癌、卵巢癌，腎細(xì)胞癌中均表明AMPK的活化能增強(qiáng)化療敏感性［5-7］。因此AMPK的靶向治療有望成為預(yù)防和治療乳腺癌的新手段。本實(shí)驗(yàn)采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)法、蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)、Hoechst染色及流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)等技術(shù)，研究AMPKα高表達(dá)在乳腺癌化療中對(duì)多柔比星抗腫瘤作用的影響，并深入研究其相關(guān)機(jī)制。

1　　材料和方法

1.1材料

耐多柔比星乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/adr購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。AMPKα、Bax、細(xì)胞色素c(Cyto c)、caspase-3、Bcl-2、cleaved-PARP和P-gp抗體購自美國Santa Cruz公司。MTT、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒及Hochest染色試劑盒購自美國Sigma公司。AMPKα抑制劑(compound C)購自美國Sigma公司。4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自上海浩然生物技術(shù)有限公司。多柔比星購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

在耐多柔比星細(xì)胞株MCF-7/adr中構(gòu)建過表達(dá)AMPKα的穩(wěn)定株，以MCF-7/adr細(xì)胞感染表達(dá)全長AMPKα的慢病毒質(zhì)粒，且以感染空白病毒質(zhì)粒為對(duì)照細(xì)胞，命名為MCF-7/adr-vector。感染后3天觀察綠色熒光表達(dá)情況。出現(xiàn)綠色熒光表達(dá)后加入含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選后采用Western blot進(jìn)行鑒定，將穩(wěn)定表達(dá)AMPKα的克隆命名為MCF-7/ adr-AMPKα。將上述細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，置于在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)及傳代。

1.2.2細(xì)胞毒性測(cè)定

采用MTT法，將生長良好的MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，空白組加等量的培養(yǎng)液，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中溫育過夜后，棄去培養(yǎng)液，分別用0、0.1、1、5、10、20和40 μg/mL多柔比星處理細(xì)胞24和48 h，各取3個(gè)平行孔，再加入終濃度0.5 g/L的MTT，培養(yǎng)4 h，用每孔100 μL的DMSO溶解沉淀3 h后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度(D)值測(cè)定。測(cè)定波長490 nm，參考波長630 nm，計(jì)算其抑制率及多柔比星對(duì)這3種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。細(xì)胞存活率=(D實(shí)驗(yàn)組平均值/D空白組平均值) ×100%。

1.2.3Hoechst 染色檢測(cè)AMPKα過表達(dá)對(duì)MCF-7/adr細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

將處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞(2×105個(gè)/mL)接種于24孔板，加入1.0 μg/mL多柔比星，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液。作用48 h后離心，棄上清液，用PBS洗2次，離心去上清液(370×g，5 min)。加固定液(甲醇∶乙酸=3∶1)，4 ℃固定10 min。采用Hoechst33258 (5 μL/mL) 染色5 min。356 nm紫外激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

1.0 μg/mL多柔比星作用MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞48 h后，重懸于Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液(1×)中，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻，室溫避光溫育10 min，1 000×g離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液(1×)輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴中避光放置10 min；用FACS流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品，采用Cell Quest軟件(Becton)及Modifit軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5細(xì)胞內(nèi)多柔比星濃度測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)液洗滌2次，將細(xì)胞終濃度調(diào)至1×104個(gè)/mL，培養(yǎng)3天后加入不同濃度多柔比星，放入溫育箱中培養(yǎng)3 h，細(xì)胞用冷PBS洗2次，洗去培養(yǎng)基中的多柔比星。應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度，檢測(cè)波長530 nm，激發(fā)波長為485 nm。

1.2.6Western blot法檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞接種于6孔板中，然后用5和10 μg/mL多柔比星處理24 h后，細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，冷PBS液沖洗2遍，采用細(xì)胞刮片收集細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，進(jìn)行蛋白定量，制備好的蛋白樣品置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每泳道?0 g蛋白上樣，經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。室溫封閉3 h，加一抗，室溫下溫育2 h。再加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫下溫育1 h，采用NBT/BCIP系統(tǒng)顯色，記錄結(jié)果并進(jìn)行光密度值掃描分析，除以β-actin光密度值所得的比值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料的比較采用方差分析(ANOVA)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1慢病毒感染MCF-7/adr細(xì)胞后AMPKα表達(dá)的情況

慢病毒感染成功后，用熒光顯微鏡檢測(cè)目的基因的表達(dá)(圖1)。構(gòu)建的慢病毒基因組中均帶有綠色熒光蛋白基因，MCF-7/adr-vector和MCF-7/adr-AMPKα均帶有較強(qiáng)的綠色熒光，表明慢病毒基因組在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

2.2AMPKα過表達(dá)增強(qiáng)MCF-7/adr細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AMPKα慢病毒質(zhì)粒的MCF-7/adr細(xì)胞中AMPKα蛋白過表達(dá)(圖2)。多柔比星作用乳腺癌MCF-7/adr細(xì)胞、MCF-7/adr-vector細(xì)胞及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞24和48 h后，對(duì)這3種細(xì)胞均呈現(xiàn)濃度依賴性的生長抑制作用(圖3和4)。多柔比星對(duì)MCF-7/adr和MCF-7/adr-vector細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用相似，作用24 h的IC50值分別為(36.8±2.1)和(33.3±1.9)μg/mL，作用48 h的IC50值分別為(28.8±1.3)和(26.2±1.5)μg/mL。過表達(dá)AMPKα明顯增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞MCF-7/adr-AMPKα對(duì)多柔比星的敏感性，作用24 h的IC50值為(16.0±0.7)μg/mL，作用48 h的IC50值為(4.2±0.2)μg/mL。

圖1　　熒光顯微鏡觀察MCF-7/adr細(xì)胞轉(zhuǎn)染后AMPKα的表達(dá)Fig. 1 Expression of AMPKα in transfected-MCF-7/adr cells was observed by fluorescence microscope A, B: MCF-7/adr-vector; C, D: MCF-7/adr-AMPKα

圖2　　Western blot法檢測(cè)MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞中腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)的表達(dá)情況Fig. 2 The expression of AMPKα in MCF-7/adr, MCF-7/adrvector and MCF-7/adr-AMPKα cells was detected by Western blot

圖3　　多柔比星作用24 h后對(duì)MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞的存活率影響Fig. 3 The effect of adriamycin on the viability of MCF-7/ adr, MCF-7/adr-vector and MCF-7/adr-AMPKα cells after 24 h treatment

圖 4　多柔比星作用48 h后對(duì)MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞的存活率影響Fig. 4 The effect of adriamycin on the viability of MCF-7/ adr, MCF-7/adr-vector and MCF-7/adr-AMPKα cells after 48 h treatment

2.3過表達(dá)AMPKα聯(lián)合多柔比星對(duì)MCF-7/ adr細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

Hoechst實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多柔比星作用前，3種細(xì)胞均無明顯形態(tài)學(xué)變化，熒光較均勻。多柔比星作用后，與MCF-7/adr和MCF-7/adrvector細(xì)胞相比，過表達(dá)AMPKα的細(xì)胞呈現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮、核碎裂以及凋亡小體等細(xì)胞凋亡特征，表明多柔比星聯(lián)合AMPKα能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡(圖5)。

2.4過表達(dá)AMPKα增加多柔比星對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)多柔比星對(duì)MCF-7/adr、MCF-7/adrvector和MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞凋亡率的影響。圖6所示，1.0 μg/mL多柔比星作用細(xì)胞48 h，與MCF-7/adr-vector和MCF-7/adr細(xì)胞組相比，能明顯提高M(jìn)CF-7/adr-AMPKα細(xì)胞的凋亡率。MCF-7/adr和MCF-7/adr-vector細(xì)胞總凋亡率略高于對(duì)照組，分別為(12.0±1.4)%、(12.7±1.6)%和(5.2±0.4)%、(6.1±0.6)%，而過表達(dá)AMPKα的MCF-7/adr細(xì)胞總凋亡率明顯高于對(duì)照組(32.0±4.2)%和(4.4±0.5)%。

圖5　　Hoechst 33258熒光核染色對(duì)多柔比星作用前后MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響Fig. 5 Fluorescent staining of nuclei in adriamycin-treated or untreated MCF-7/adr, MCF-7/adr-vector and MCF-7/adr-AMPKα cells by Hoechst 33258

圖6　　多柔比星作用前后MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector和MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞凋亡率的變化Fig. 6 Flow cytometry analysis of adriamycin induced apoptosis in MCF-7/adr, MCF-7/adr-vector and MCF-7/adr-AMPKα cells using Annexin Ⅴ-FITC/PI

表1　過表達(dá)AMPKα對(duì)細(xì)胞內(nèi)多柔比星累積的影響Tab. 1 The effect of AMPKα overexpression on intracellular accumulation of adriamycin

2.5過表達(dá)AMPKα對(duì)細(xì)胞內(nèi)多柔比星累積的影響

多柔比星具有熒光效應(yīng)，可作為細(xì)胞內(nèi)化療藥物累積的指示劑［8］。利用熒光酶標(biāo)儀對(duì)3種細(xì)胞內(nèi)多柔比星的積累量進(jìn)行測(cè)定。過表達(dá)AMPKα能明顯提高細(xì)胞內(nèi)多柔比星的累積量，具有濃度依賴性。

2.6過表達(dá)AMPKα聯(lián)合多柔比星對(duì)p-糖蛋白(P-gp)及凋亡相關(guān)通路的影響

多柔比星作用3種細(xì)胞后，與MCF-7/adr和MCF-7/adr-vector細(xì)胞相比，MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞中P-gp表達(dá)量明顯降低，加入AMPKα抑制劑compound C后，MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞中P-gp表達(dá)量增加。此外，MCF-7/adr-AMPKα細(xì)胞中Bax、Cyt-c、cleaved PARP、caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少。加入compound C后，Bax、Cyt-c、cleaved PARP、caspase-3蛋白表達(dá)有所減少，而Bcl-2蛋白表達(dá)有所增加，提示AMPKα過表達(dá)既能降低藥物外排泵P-gp蛋白表達(dá)水平，增加多柔比星在細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，又能激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，增強(qiáng)多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用(圖7)。

圖7　　多柔比星以及多柔比星聯(lián)合AMPK抑制劑作用后，MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα 細(xì)胞中P-gp蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig. 7 The expression of P-gp and apoptosis related proteins in MCF-7/adr, MCF-7/adr-vector and MCF-7/adr-AMPK cells after adriamycin treatment or adriamycin combined with AMPK inhibitor

3　　討論

乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其治療和預(yù)后一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的化療藥物在治療中占有重要地位，多柔比星仍然是最為有效和常用的乳腺癌化療藥物。但是臨床上患者在經(jīng)歷數(shù)次多柔比星化療后產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，嚴(yán)重影響化療效果［9］。因此，提高多柔比星化療敏感性在乳腺癌治療中具有重要的作用。

研究表明，在不同實(shí)體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)能量代謝異常，已被證實(shí)是腫瘤細(xì)胞的重要特征［10］。與正常細(xì)胞相比，在卵巢癌、宮頸癌、肺癌和乳腺癌等多種腫瘤中均檢測(cè)到低表達(dá)的AMPK［11］。Pradelli等［12］發(fā)現(xiàn)，通過激活A(yù)MPK可增強(qiáng)Jurkat和白血病細(xì)胞的凋亡。AMPK還可控制某些蛋白如抑癌基因p53、p27的磷酸化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期阻滯及生長抑制［13-14］。研究表明，腫瘤抑制因子LKB1和TSC2參與AMPK介導(dǎo)的抗腫瘤作用［15］。此外，AMPK被電離輻射(ionizing radiation, IR)激活后能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，不同的AMPK亞型及表達(dá)差異與卵巢癌的分級(jí)和預(yù)后有密切關(guān)系［17］。但AMPK的過表達(dá)是否能增強(qiáng)乳腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性目前尚無報(bào)道。

本研究顯示，多柔比星對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞有一定的生長抑制作用，但是多柔比星對(duì)過表達(dá)AMPKα的乳腺癌耐藥細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性，提示AMPKα高表達(dá)可顯著提高M(jìn)CF-7/adr耐藥細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，多柔比星作用對(duì)照細(xì)胞和過表達(dá)AMPKα的細(xì)胞后，MCF-7/ adr-AMPKα細(xì)胞凋亡效果明顯增加，表明AMPK具有增加多柔比星對(duì)MCF-7/adr細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡敏感性的作用。為了進(jìn)一步了解AMPK與多柔比星聯(lián)合作用的機(jī)制，我們進(jìn)行對(duì)照細(xì)胞和過表達(dá)AMPKα的細(xì)胞對(duì)多柔比星積累量的檢測(cè)。結(jié)果顯示，過表達(dá)AMPKα能明顯提高細(xì)胞內(nèi)多柔比星的累積量。這些結(jié)果表明AMPK過表達(dá)的細(xì)胞能夠促進(jìn)多柔比星進(jìn)入乳腺癌耐藥細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效果，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

研究報(bào)道，AMPK在抑制腫瘤增殖方面具有直接作用和間接作用，直接作用主要抑制mTOR、P-gp和COX-2等蛋白的活性或表達(dá)，此外，還可增加抑癌基因的活性。AMPK也通過間接機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤活性，例如AMPK的表達(dá)能抑制胰島素和IGF-1的分泌以及雌激素(E2)的合成和瘦素的分泌，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖以及影響能量的利用［18］。

為了闡明MCF-7/adr細(xì)胞中AMPK提高多柔比星在細(xì)胞中的積累并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了耐藥細(xì)胞中藥物外排泵P-糖蛋白(P-gp)及凋亡通路中抑癌及促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多柔比星作用細(xì)胞后，過表達(dá)AMPKα的MCF-7/adr細(xì)胞中耐藥蛋白P-gp、促凋亡蛋白Bax、Cyto c、caspase-3及其底物cleaved PARP的表達(dá)均明顯上調(diào)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)。加入AMPK抑制劑compound C后，促凋亡蛋白及P-gp蛋白有所增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)反而減少。這些結(jié)果表明，AMPKα過表達(dá)可以抑制耐藥蛋白P-gp的表達(dá)促進(jìn)多柔比星進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，增強(qiáng)多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。

綜上所述，AMPKα過表達(dá)在乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/adr中不僅影響了耐藥表型，而且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這為解決乳腺癌耐藥問題提供了新的思路和治療靶點(diǎn)。AMPK與多柔比星聯(lián)合方案有可能成為新的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，并在此基礎(chǔ)上尋找更好的靶向藥物，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化靶向治療，最終達(dá)到延長患者生存時(shí)間和提高生活質(zhì)量的目的。

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Mechanism of AMPK-enhanced chemosensitivity of breast cancer MCF-7/adr cells to adriamycin

CUI Wenxian, XU Keqing, LI Yuanguo, CHEN Guijin, LU Xiaoqun
(Clinical Laboratory, Changzhou Seventh People’s Hospital, Changzhou 213011, Jiangsu Province, China)
Correspondence to: CUI Wenxian E-mail: swhx2015@163.com

Background and purpose: AMP-activated protein kinase (AMPK) plays an important role in the regulation of cell metabolism and energy balance and is associated with cell proliferation, survival and multiple signaling pathways. Recent reports found that AMPK is involved in tumor suppression and drug resistance. The aim of this study was to explore the effect of AMPK on the anti-tumor effect of adriamycin and underlying mechanism in breast cancer MCF-7/adr cells. Methods: The anti-proliferative effects of adriamycin was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay in MCF-7/adr, MCF-7/adr-vector and MCF-7/adr-AMPKα cells. The cell morphology in each group was stained with the fluorescent dye Hoechst 33528, and the effects on apoptosis induction were examined by flow cytometry (FCM). The intracellular concentration of adriamycin was detected by fluorescence assay. The resistance- and apoptosis-related proteins were analyzed by Western blot. Results: The growth of breast cancer MCF-7/adr cells was inhibited by adriamycin in a dose- and time-dependent manner. The IC50values at 24 and 48 h were (36.8±2.1) and (28.8±1.3) μg/mL, respectively. AMPKα over-expression enhanced the cytotoxic effect of adriamycin in MCF-7/adr-AMPKα cells in a dose- and time-dependent manner. Its IC50values at 24 and 48 h were (16.0±0.7) and (4.2±0.2) μg/mL, respectively. Fluorescent morphological assay showed that AMPKα overexpression contributed to adriamycin induced apoptosis in MCF-7/adr-AMPKα cells. After treatment with 1.0 μg/mL adriamycin for 48 h, the apoptosis rates of MCF-7/adr, MCF-7/adr-vector and MCF-7/adr-AMPKα cells were (12.0±1.4)%, (12.7±1.6)% and (32.0±4.2)%, respectively, indicating that overexpression of AMPKα enhanced the adriamycin-induced apoptosis in MCF-7/adr cells. Fluorescence microplate assay showed that over expression of AMPKα significantly increased the intracellular accumulation of adriamycin, in a concentration dependent manner. Western blot analysis showed that, compared with MCF-7/adr and MCF-7/adr-vector cells, the expressions of Bax, caspase-3 and cleaved PARP proteins were increased. Meanwhile, Bcl-2 and P-gp protein expressions were decreased in MCF-7/adr-AMPKα cells. Furthermore, the release of cytochrome c from mitochondria into the cytosol was also observed in MCF-7/adr-AMPKα cells. Conclusion: AMPKα overexpression can enhance the chemosensitivity of breast cancer MCF-7/adr cells to adriamycin through inhibiting the drug efflux transporter and regulating the expression of apoptosis-related proteins.

Breast cancer；Drug resistance；AMP-activated protein kinase；Apoptosis；Adriamycin

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.005

R737.9

A

1007-3639(2016)11-0908-08

崔文賢E-mail:swhx2015@163.com

（2015-12-01

2016-03-08）