奶牛布魯氏菌抗體檢測(cè)常用方法的篩選

毛愛民范 鋒楊芝芬陸宇超金嘉旻施銘煜

(1.無錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,江蘇無錫 214021; 2.無錫市惠山區(qū)堰橋街道獸醫(yī)站,江蘇無錫 214021)

奶牛布魯氏菌抗體檢測(cè)常用方法的篩選

毛愛民1范 鋒1楊芝芬1陸宇超1金嘉旻1施銘煜2

(1.無錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,江蘇無錫 214021; 2.無錫市惠山區(qū)堰橋街道獸醫(yī)站,江蘇無錫 214021)

目前，奶牛布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)最常用的方法包括虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和酶聯(lián)免疫法（EILSA）、金標(biāo)試紙法（GICA）。前兩種是國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，后2種是近年來才開始使用，但沒列入國家標(biāo)準(zhǔn)的新方法。為了篩選出最適合的檢測(cè)方法，我們對(duì)近5年來留存的奶?；⒓t平板檢測(cè)為陽性血清82份、陰性血清100份和40份人工調(diào)配的布病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行了4種方法的比較，結(jié)果顯示，EILSA法特異性強(qiáng)，靈敏度最高，GICA操作最簡便，耗時(shí)最少。因此，在奶牛布病檢測(cè)方法上選用GICA、EILSA組合較為合適。

布病 ELISA GICA

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患傳染病。以生殖器官和胎膜發(fā)生炎癥，引起流產(chǎn)、不孕和關(guān)節(jié)炎、睪丸炎等為特征?；疾?dòng)物長期帶菌，成為世界性分布，有不同程度的流行，給畜牧業(yè)和人類健康帶來嚴(yán)重危害。本病在我國分布較廣，在某些地區(qū)的流行相當(dāng)嚴(yán)重。在自然條件下，布魯氏菌病的易感動(dòng)物范圍很廣，其中主要是羊、牛、豬。本病在流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化均缺乏明顯特征，而且多數(shù)病畜呈隱性感染，因此，在診斷時(shí)，應(yīng)采取多種方法互相配合，才能得出正確診斷結(jié)果。目前，我國布病最常用的檢疫技術(shù)是血清學(xué)診斷，國標(biāo)方法有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)以及乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)。但在臨床上用得最多的是虎紅平板凝集試驗(yàn)，該方法雖然時(shí)間短，操作簡便，但容易出現(xiàn)假陽性、假陰性等情況，給診斷帶來一定困難，因此，為挑選出操作簡便、準(zhǔn)確率高的方法，我們對(duì)目前國內(nèi)外使用較多的虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和酶聯(lián)免疫法（EILSA）、金標(biāo)試紙法（GICA）四種方法進(jìn)行了比較，檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清

廠家：青島易邦公司，批號(hào)：20160402。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清

1.3 虎紅平板抗原

廠家：青島易邦公司，批號(hào)：20160403。

1.4 試管凝集抗原

廠家：青島易邦公司，批號(hào)：20160201。

1.5 膠體金試紙條

廠家：韓國安捷生產(chǎn)的牛布病金標(biāo)試紙卡。

1.6 酶聯(lián)免疫試劑盒

由表1可知，血液組水蛭素活性為(76.171 9±0.390 6)U/g，配合飼料組水蛭素活性為(75.390 6±0.391 8)U/g。血液組水蛭素活性略高于配合飼料組，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，差異性不顯著（P＞0.05）。

廠家：美國IDEXX牛布氏桿菌抗體檢測(cè)試劑盒 。

1.7 血清樣品

2013年起收集的奶牛血清虎紅試驗(yàn)陽性82份、陰性100份。冷凍于-20℃保存，使用前統(tǒng)一解凍。

1.8 人工樣品

標(biāo)準(zhǔn)陽性血清按1：2，1：4，1：8，1：16… … 1：1024梯度稀釋至10個(gè)濃度的樣本，每個(gè)濃度各5份，共50份待檢樣本。

1.9 檢測(cè)方法

RBT、SAT按GB/T 18646-2002動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)規(guī)范操作，GICA、ELISA按產(chǎn)品說明書操作。

1.9.1 GICA法：將未開封的試紙卡和檢測(cè)樣品恢復(fù)至室溫；用吸管吸取血清，向平坦放置的試紙卡加樣孔中緩慢滴入1滴；取出試紙卡包裝中的稀釋液，用吸管吸取，向試紙卡的加樣孔緩慢滴入2滴；5min判斷結(jié)果，10min后的結(jié)果無效。陽性：C線顯示紅色色帶，T線也顯示紅色色帶，無論顏色深淺均判為陽性。陰性：C線顯示紅色色帶，T線不顯示紅色色帶，判為陰性。無效：C線不顯示紅色色帶，無論T線是否顯示紅色色帶，該試紙均判為無效。

1.9.2 ELISA 法：取出包被反應(yīng)板，在記錄表上記錄好每個(gè)樣品的相應(yīng)位置。每個(gè)孔中加入190μl “稀釋緩沖液N.2”，在一個(gè)適當(dāng)孔加入10μl未稀釋的陰性對(duì)照。在兩個(gè)適當(dāng)孔分別加入10μl未稀釋的陽性對(duì)照。在剩余孔加入10μl未稀釋的樣品。使用微量板振蕩器充分混勻孔中內(nèi)容物。蓋上蓋板（蓋子，鋁箔膜或粘貼膜）進(jìn)行孵育：單個(gè)樣品在18℃～26℃條件下孵育1h（±5min）（短期孵育模式）或者在18℃～26℃條件下孵育16～24h（過夜孵育模式）?；旌蠘悠罚涸?8-26℃條件下孵育1h（±5min）（短期孵育模式）。用近300μl 左右的洗滌溶液，每個(gè)板孔洗滌3 次。在每一次洗滌后，吸去每個(gè)板孔中的液體。在最后一次甩板后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液體。在洗滌和加入下一個(gè)試劑前，避免微量板變干。每孔加入100μl 稀釋好的酶標(biāo)抗體。蓋上蓋板（蓋子，鋁箔膜或粘貼膜），在18℃～26℃條件下孵育30min（±3 min）。重復(fù)洗滌步驟，然后每孔加入100μl TMB 底物溶液N.13。在18℃～26℃條件下避光孵育20 min（±3 min）。每孔加入100μl 終止液N.3。輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板。仔細(xì)擦拭反應(yīng)板底部。將酶標(biāo)儀空氣調(diào)零。測(cè)量并記錄樣品和對(duì)照在450nm 下的吸光值。結(jié)果判定，單個(gè)血清：樣品的S/P百分率小于或等于110%時(shí)，認(rèn)為樣品中不存在布魯氏菌特異性抗體，判為陰性。樣品的S/P百分率在110%～120%之間時(shí)，判為可疑。樣品的S/P百分率大于或等于120%時(shí)，認(rèn)為樣品中存在布魯氏菌特異性抗體，判為陽性?；旌涎澹簶悠返腟/P百分率小于20%時(shí)，認(rèn)為樣品中不存在布魯氏菌特異性抗體，判為陰性；樣品的S/P百分率大于或等于20%時(shí)，認(rèn)為樣品中存在布魯氏菌特異性抗體，判為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)182份血清樣品和50份人工樣品整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)

同一實(shí)驗(yàn)的所有樣本都是盡量統(tǒng)籌時(shí)間一同開展，經(jīng)比較，采用GICA時(shí)間最短1小時(shí)內(nèi)就測(cè)得所有結(jié)果，SAT法耗時(shí)最長。

2.2 結(jié)果

2.2.1 血清樣本檢測(cè)結(jié)果

表2 布病抗體檢測(cè)4種常用方法檢測(cè)結(jié)果表

以 SAT為標(biāo)準(zhǔn)，RBT、GICA、EILSA假陽性率分別為6.1%、6.1%、0。假陰性率分別為0、2%、1%。

2.2.2 人工樣本檢測(cè)結(jié)果

表3 布病抗體檢測(cè)4種常用方法陽性最低檢出濃度表

最低檢出濃度按照同一濃度5份樣本中有至少3份呈陽性為準(zhǔn)。檢測(cè)結(jié)果顯示，EILSA檢測(cè)靈敏度最大，RBT、GICA靈敏度基本一致，較低。

3 小結(jié)

（1）布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌引起的一種人畜共患傳染病，屬于我國的二類傳染病。奶牛是布魯氏桿菌易感的動(dòng)物，一旦在牛群中發(fā)生，將導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，因此，奶牛布病是各級(jí)獸醫(yī)機(jī)構(gòu)必檢項(xiàng)目。檢測(cè)奶牛布病的試驗(yàn)方法多達(dá)10多種，但臨床上常見的就是3～4種。目前我國布病的血清學(xué)診斷主要使用RBT、SAT。實(shí)驗(yàn)證明，這2種方法都會(huì)出現(xiàn)一定比例的假陰性和假陽性，我國大部分地區(qū)，實(shí)行的是RBT初篩，SAT復(fù)核的配套方式來監(jiān)測(cè)監(jiān)控奶牛布病。國際標(biāo)準(zhǔn)中，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織OIE國際貿(mào)易指定試驗(yàn)為BBATs（緩沖布病抗原試驗(yàn)）、ELISA和CFT（補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)）。SAT過去一直是許多國家布病診斷的常規(guī)血清學(xué)方法，但單獨(dú)應(yīng)用SAT可能出現(xiàn)假陽性或假陰性，而且不是所有感染動(dòng)物都出現(xiàn)具有診斷意義的抗體水平，因而易造成誤診和漏診。特別是SAT用于牛布病檢測(cè)時(shí)結(jié)果不令人滿意，OIE已經(jīng)于2000年宣布不主張用于國際貿(mào)易。

（2）本次試驗(yàn)的顯示，GICA相對(duì)于RBT，檢測(cè)結(jié)果基本趨于一致，而且GICA出現(xiàn)假陰性的結(jié)果要小于RBT。ELISA相對(duì)于SAT，無論是敏感度還是特異性，前者都優(yōu)于后者，而且在時(shí)間效率上，前者更是有著天然的優(yōu)勢(shì)。SAT由于采用人工目測(cè)比對(duì)，很容易出現(xiàn)臨界值難以判斷，經(jīng)常得出可疑的結(jié)論，需耗費(fèi)精力二次檢疫。GICA、ELISA都能使用血漿進(jìn)行檢測(cè)，而RBT必須用血清才能檢測(cè)，無錫市目前在奶牛結(jié)核病檢測(cè)上使用的r-干擾素釋放法，檢測(cè)材料也需要血漿，用GICA、ELISA組合，可以解決采一次抗凝血同時(shí)解決所有項(xiàng)目的檢測(cè)任務(wù)，在無錫地區(qū)經(jīng)過實(shí)際檢驗(yàn)，從提高效率和準(zhǔn)確率出發(fā)，奶牛布病檢測(cè)方法更適合使用GICA、EILSA組合。但從檢測(cè)成本來看，GICA、EILSA配套相對(duì)高于RBT、SAT，在經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)大面積推廣會(huì)存在困難。

[1] 于力，于康震.動(dòng)物傳染病學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.