下調(diào)HER2降低自噬活性抑制人肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移作用的體外研究

馮媛媛，伍宏山，張志宏，龍新華，周揚，童未來，劉志禮，劉家明△

下調(diào)HER2降低自噬活性抑制人肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移作用的體外研究

馮媛媛1，伍宏山2，張志宏2，龍新華2，周揚2，童未來2，劉志禮2，劉家明2△

目的探討下調(diào)HER2表達(dá)是否抑制細(xì)胞自噬活性，從而影響人肺癌細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲。方法采用濃度5 μmol/L自噬抑制劑3-MA、10 μmol/L HER2抑制劑Neratinib分別作用人肺癌細(xì)胞A549。Western blot檢測肺癌細(xì)胞A549中HER2、Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）蛋白表達(dá)水平；Wound healing和Transwell invasion實驗檢測細(xì)胞遷徙、侵襲能力；四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果Neratinib和自噬抑制劑（3-MA）作用24 h后，細(xì)胞HER2、Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）蛋白表達(dá)水平顯著低于陰性對照組；Neratinib、自噬抑制劑（3-MA）處理組的細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲能力顯著低于陰性對照細(xì)胞。結(jié)論下調(diào)HER2能降低人肺癌細(xì)胞A549的自噬活性并抑制其增殖、遷徙和侵襲。

肺腫瘤；自噬；細(xì)胞增殖；受體，erbB-2；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷徙

細(xì)胞自噬（autophagy or autophagocytosis）是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，Atg）的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程。有研究表明，包括肺癌在內(nèi)多種腫瘤的形成與自噬過程密切相關(guān)［1-4］。同時也有研究顯示，HER2信號通路激活能改變細(xì)胞的自噬水平［5］。但是，HER2是否通過改變細(xì)胞自噬活性影響肺癌細(xì)胞的遷徙和侵襲及其分子機(jī)制尚不明確。本研究以人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞為研究對象，用Neratinib處理人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞，觀察A549細(xì)胞的自噬活性，為進(jìn)一步探討HER2在肺癌細(xì)胞中的作用提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料（1）細(xì)胞株：人源肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫。（2）試劑：DMEM（高）培養(yǎng)基（Solarbio公司）、胎牛血清（Trans Gen公司）、Transwell侵襲小室（8.0 μm孔徑PC膜，美國Corning公司）、基質(zhì)膠（美國BD公司）、Western blot上樣蛋白Marker和PVDF膜（美國Formentas公司）、一抗（美國Santa Cruz公司）、二抗（北京中杉金橋公司）、Neratinib、3-MA（美國abmole）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將A549細(xì)胞置于DMEM高糖培養(yǎng)基中（內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及鏈霉素100 mg/L），在37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中貼壁培養(yǎng)。

1.2.2Western blot檢測HER2、Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）蛋白表達(dá)水平10 μmol/L HER2抑制劑Neratinib、5 μmol/L自噬抑制劑（3-MA）作用人肺癌細(xì)胞A549 24 h（分別為Neratinib處理組、3-MA處理組），PBS替代藥物作為陰性對照組，收集細(xì)胞，RIPA裂解，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（鼠抗人HER2，1∶2 000；兔抗人Beclin-1，1∶1 000；兔抗人LC3B，1∶3 000；鼠抗人β-actin，1∶2 500）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（山羊抗鼠和山羊抗兔，1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑（TIANGEN，PA112）化學(xué)發(fā)光、壓片、拍照，用Image J軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Wound healing檢測細(xì)胞遷徙能力取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗，常規(guī)消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞形成單層貼壁細(xì)胞，用10 μmol/L Neratinib、5 μmol/L 3-MA分別作用細(xì)胞（PBS替代藥物為陰性對照組）24 h后，用10 μL槍頭在單層細(xì)胞表面劃一直線。用PBS漂洗2次去除劃落的細(xì)胞；加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕中細(xì)胞遷移情況并拍照，Image J軟件測量遷徙距離，計算各組細(xì)胞遷徙率。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell invasion檢測細(xì)胞侵襲能力應(yīng)用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實驗。將用10 μmol/L Neratinib及5 μmol/L 3-MA作用24 h后的細(xì)胞用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，取150 μL細(xì)胞懸液接種小室，然后將小室放入加有600 μL/孔含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，吸棄上室液體，用PBS漂洗2次，95%乙醇固定10 min，用棉簽擦凈小室膜上側(cè)未遷移的細(xì)胞，4 g/L結(jié)晶紫染色20 min，PBS漂洗2次。倒置顯微鏡下隨機(jī)讀取10個視野，觀察細(xì)胞穿膜情況并拍照，Image J分析軟件計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測細(xì)胞增殖能力根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，選取效果最好的10 μmol/L Neratinib、5 μmol/L 3-MA作為最終實驗濃度。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗，常規(guī)消化貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL接種于無菌96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)12 h。待細(xì)胞貼壁良好，分別加入濃度10 μmol/L Neratinib、5 μmol/L 3-MA作用24、48、72、96 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL。孵育4 h后，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL。微振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處光密度（OD）值。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，各組細(xì)胞遷徙、侵襲及增殖能力差異情況比較采用方差分析和LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Neratinib及3-MA對A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）表達(dá)的影響與陰性對照組相比，3-MA處理組的Beclin-1蛋白及LC3BⅡ/Ⅰ表達(dá)水平明顯降低；Neratinib處理組的HER2、Beclin-1蛋白及LC3BⅡ/Ⅰ表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。提示在人源肺癌A549細(xì)胞中，改變HER2的表達(dá)能調(diào)控細(xì)胞自噬的活性。

Fig.1The effect of Neratinib and 3-MA on Beclin-1 and LC3B(Ⅱ/Ⅰ)protein expressions in A549 cells圖1 Neratinib及3-MA對A549細(xì)胞蛋白Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）表達(dá)水平的影響

2.2 Neratinib及3-MA對A549細(xì)胞遷徙能力的影響Neratinib處理組、3-MA處理組24 h遷徙率分別為11.1%±1.4%、10.5%±1.2%，均低于陰性對照組的42.9%±2.4%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=27.430，P＜0.05），見圖2。提示HER2低表達(dá)及細(xì)胞自噬活性水平能降低抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞遷徙。

2.3 Neratinib及3-MA對A549細(xì)胞侵襲能力的影響Neratinib處理組、3-MA處理組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為40±8、59±10，均顯著低于陰性對照組的113± 13，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.246，P＜0.05），見圖3。提示HER2低表達(dá)及細(xì)胞自噬活性水平降低能抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞侵襲。

2.4 Neratinib及3-MA對A549細(xì)胞增殖能力的影響與陰性對照組比較，在作用48、72、96 h后Neratinib及3-MA能有效抑制A549細(xì)胞的增殖（F分別為15.213、4.965、5.366，均P＜0.05），見圖4。

3 討論

細(xì)胞自噬作為真核生物界一種普遍存在的生命現(xiàn)象，對生物的發(fā)育、生長等多種過程具有重要的生理意義［6］。細(xì)胞自噬（又稱為Ⅱ型細(xì)胞死亡），是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體［7］，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新［8-10］。無論是腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞，保持一種基礎(chǔ)、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的。生物體內(nèi)破損或衰老的細(xì)胞器、長壽命蛋白質(zhì)、錯誤合成或折疊的蛋白質(zhì)等都需要及時清除，而這主要靠自噬來完成，因此，自噬具有維持細(xì)胞自穩(wěn)的功能。同時，自噬的產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)又可為細(xì)胞提供一定的能量和合成底物。而腫瘤細(xì)胞本身具有高代謝的特點，對營養(yǎng)和能量的需求比正常細(xì)胞更高，所以細(xì)胞自噬水平對腫瘤細(xì)胞的形成具有重要意義。

Beclin-1基因是酵母Atg6基因的同源體，作為一種抑癌基因，在腫瘤的形成中起著重要作用［11］。有研究表明上調(diào)Beclin-1可以促進(jìn)自噬的發(fā)生［12］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1主要通過與PI3K結(jié)合后與之形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)其他自噬相關(guān)基因，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平，因此，Beclin-1與細(xì)胞的自噬活性具有密切聯(lián)系［13-14］。

Fig.2The cell migration ability detected by Wound healing assay in three groups of A549 cells圖2 Wound healing實驗檢測3組A549細(xì)胞的遷徙能力

Fig.3The cell invasion ability detected by Tanswell invasion assay in three groups of A549 cells圖3 Transwell invasion實驗檢測3組A549細(xì)胞的侵襲能力

Fig.4The cell proliferation detected by MTT assay in three groups of A549 cells圖4 MTT實驗檢測3組A549細(xì)胞的增殖能力

LC3是一種可以用來示蹤自噬形成的蛋白，對細(xì)胞自噬體的形成至關(guān)重要，其存在兩種形式：LC3-Ⅰ（胞漿型）與LC3-Ⅱ（膜型）。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)自噬水平被激活時，胞漿型LC3經(jīng)過泛素樣的加工修飾后形成膜型LC3［15］，而LC3有3種同源基因，即LC3A、LC3B及LC3C，其中LC3B已被證實位于自噬溶酶體上，因此LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可作為檢驗自噬發(fā)生的指標(biāo)［16-17］。

人類表皮生長因子受體2（HER2/neu）是由位于染色體17q21上的原癌基因ErbB2/HER2/neu編碼的一種跨膜受體酪氨酸激酶，激活胞內(nèi)信號通路從而參與細(xì)胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)［18-19］。且HER2在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)［20-21］。也有研究表明，HER2激活RAS-MAPK和PI3K分別促進(jìn)和抑制細(xì)胞的自噬活性［5］。但是HER2是否通過改變自噬活性從而影響肺癌細(xì)胞的惡性表型尚不明確。筆者推測HER2可能通過調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的自噬水平，從而改變其惡性表型。

為了證實此推測，本組實驗利用自噬抑制劑3-MA處理人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，PBS替代作為陰性對照，結(jié)果顯示經(jīng)3-MA處理后的肺癌A549細(xì)胞的增殖遷徙和侵襲能力明顯被抑制，且自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3B（Ⅱ/Ⅰ）表達(dá)降低，這提示下調(diào)自噬水平能抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖、遷徙和侵襲能力。同時利用HER2抑制劑Neratinib處理人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，PBS替代作為陰性對照，經(jīng)Western blot檢測顯示在處理的細(xì)胞中HER2、Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）蛋白表達(dá)水平顯著低于陰性對照組，這提示改變HER2在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)水平能顯著改變肺癌細(xì)胞的自噬水平。采用MTT、Wound healing和Transwell invasion實驗檢測細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲情況，結(jié)果顯示Neratinib處理的細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲能力顯著低于陰性對照組細(xì)胞，這些結(jié)果表明HER2在肺癌細(xì)胞遷徙侵襲中起著重要作用。

綜上，下調(diào)HER2可使肺癌細(xì)胞的自噬活性下降，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲，為肺癌的轉(zhuǎn)移防治提供了新思路。但是，本研究僅采用一種細(xì)胞系進(jìn)行體外研究，而細(xì)胞的自噬水平還需更多的相關(guān)實驗檢測。此外，體內(nèi)微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲轉(zhuǎn)移非常重要，因此還需進(jìn)一步的體內(nèi)、外實驗來證實HER2調(diào)控細(xì)胞自噬的水平對肺癌細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲的影響。

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（2016-07-10收稿2016-08-30修回）

（本文編輯閆娟）

The inhibition of autophagy suppresses proliferation and metastasis of lung cancer cells via down-regulation of HER2

FENG Yuanyuan1,WU Hongshan2,ZHANG Zhihong2,LONG Xinhua2,ZHOU Yang2, TONG Weilai2,LIU Zhili2,LIU Jiaming2△
1 Department of Basic Medicine,Nanchang University,Nanchang 330006,China; 2 Department of Orthopdeics,the First Affiliated Hospital of Nanchang University△

ObjectiveTo investigate whether the down-regulation of HER2 can inhibit the autophagy of cells and influence the proliferation and metastasis of lung cancer cells.MethodsThe 5 μmol/L of autophagy inhibitor(3-MA)and 10 μmol/L of HER2 inhibitor(Neratinib)were used to treat human lung cancer A549 cells.Western blot assay was used to detect the protein expressions of HER2,Beclin-1 and LC3B(Ⅱ/Ⅰ)in A549 cells.Wound healing and Transwell invasion methods were used to detect the invasion and migration ability of A549 cells.MTT assay was performed to evaluate the cell proliferation.ResultsWestern blot analysis showed that the protein expressions of HER2,Beclin-1 and LC3B(Ⅱ/Ⅰ) were significantly declined in A549 cells treated with Neratinib and 3-MA for 24 h compared to cells in control group.The cell proliferation,migration and invasion ability were significantly decreased in A549 cells treated with Neratinib and 3-MA thanthoseofcontrolcells.ConclusionTheinhibitionofHER2proteincansuppresstheautophagyandproliferationofA549cells.

lung neoplasms;autophagy;cell proliferation;receptor,erbB-2;cell invasion;cell migration

R734.2

A

10.11958/20160610

江西省自然科學(xué)基金項目（2014ZBAB205012，20151BAB215026）

1南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部（郵編330006）；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科

馮媛媛（1994），女，碩士研究生，主要從事腫瘤的分子機(jī)制方面研究

△通訊作者E-mail:liujiamingdr@hotmail.com