miR-486、miR-499在肺癌患者血漿中的表達及臨床價值

楊陽，楊晴，賈友超，李小芳，楊華，張倩，彭鑫宇，臧愛民△

miR-486、miR-499在肺癌患者血漿中的表達及臨床價值

楊陽1，2，楊晴3，賈友超2，李小芳2，楊華2，張倩2，彭鑫宇4，臧愛民2△

目的探討miR-486和miR-499在肺癌患者血漿中的表達及臨床意義，分析其在非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC）中表達的差異。方法收集35例肺癌患者（其中NSCLC組21例，SCLC組14例）及30例健康者（對照組）血樣標本，運用qPCR的方法測定各組血漿miR-486、miR-499的表達量，分析NSCLC和SCLC患者血漿中miR-486和miR-499的表達量與各臨床特征的關系。對所有入組者血漿miRNA的相對表達量進行ROC曲線分析，計算曲線下面積（AUC）、最佳臨界值及其敏感度和特異度。結果NSCLC和SCLC組中血漿miR-486、miR-499的相對表達量均低于對照組（P＜0.05）。NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征患者間表達差異均無統(tǒng)計學意義；而TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表達越低（P＜0.05）。SCLC組分期越晚，miR-486表達越低；而miR-499在不同臨床特征患者間表達差異均無統(tǒng)計學意義。miR-486診斷肺癌的AUC為0.83（95%CI為0.73～0.93），敏感度和特異度分別為90.0%和68.6%，最佳診斷界值為1.02；miR-499診斷肺癌的AUC為0.75（95%CI為0.62～0.88），敏感度和特異度分別為60.0%和94.3%，對肺癌的最佳診斷界值為0.32。結論血漿miR-486、miR-499在肺癌患者中表達下調(diào)，可能預示預后不良，有望作為肺癌潛在篩查及預后的指標。

癌，非小細胞肺；微RNAs；血漿；敏感性與特異性；診斷，鑒別；miR-486；miR-499

近些年來惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率不斷攀升，2015年我國新患惡性腫瘤人數(shù)有42 924 292例，因惡性腫瘤死亡人數(shù)達2 814 000例，其中肺癌的發(fā)病率和死亡率高居首位［1］。研究顯示，2/3的肺癌患者確診時往往已經(jīng)是晚期，由于缺少有效的治療方法，5年生存率只有15%左右［2］。因此，迫切需要找到早期診斷肺癌的有效方法。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小分子RNA，能調(diào)節(jié)特定的信使RNA，在肺癌組織及外周循環(huán)中miRNA的表達不但參與肺癌發(fā)生、發(fā)展，而且還與疾病的診斷、分期、進展和預后密切相關［3］。血漿中的miRNA無論在體內(nèi)和體外都以一種穩(wěn)定狀態(tài)存在，不容易受到體內(nèi)內(nèi)源性核糖核酸酶及體外強酸、強堿、高溫環(huán)境的影響，具備了作為潛在腫瘤標志物的基本條件［4-5］。有研究證實血漿中miR-486-5-p可能發(fā)揮腫瘤抑制作用，可能作為非小細胞肺癌（NSCLC）診斷、治療、預后評判的潛在指標［6］。NSCLC血漿中miR-499的表達可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。在應用抗腫瘤化療藥物的過程中，血漿中miR-499還可能參與調(diào)節(jié)某些腫瘤相關基因，從而導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸、入侵及轉(zhuǎn)移，最終導致預后不良［7］。既往大多數(shù)研究關注的熱點集中在NSCLC的血漿中miRNA的表達情況，本實驗通過分析NSCLC、小細胞肺癌（SCLC）患者血漿中miR-486、miR-499的表達情況，探討其作為抑癌基因的作用，為肺癌診斷及預后判斷提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2014年1月—2015年1月河北大學附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的肺癌患者35例，以2004年版WHO肺腫瘤組織學分類標準為依據(jù)，經(jīng)支氣管鏡或者肺腫物穿刺病理結果證實為肺惡性腫瘤。35例中NSCLC 21例（NSCLC組），其中腺癌14例、鱗癌7例；SCLC 14例（SCLC組）。NSCLC組男12例，女9例，年齡≤60歲者12例，吸煙者10例。SCLC組男11例，女3例，年齡≤60歲者5例，吸煙者10例。納入標準：（1）姓名、年齡、性別、吸煙史、家族史等個人資料完整。（2）入院前從未接受放療、化療或其他針對腫瘤的治療。另取常規(guī)體檢人群30例為對照組，既往均無任何腫瘤病史，其中男16例，女14例，年齡≤60歲者14例，吸煙者14例。3組性別（χ2=2.693）、年齡≤60歲（χ2=1.570）、吸煙（χ2=2.619）構成差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有入組者均簽署知情同意書，并經(jīng)過本院倫理委員會批準。

1.2 主要儀器與試劑實時熒光PCR儀（美國Bio-Rad，CFX96）；高速低溫離心機（美國Thermo CENTRIFUGE PK 121R）、移液器（Eppendorf）；漩渦振蕩器、干浴恒溫器（江蘇其林貝爾）；通風櫥、凍存盒（Invitrogen）；-80℃冰箱（Thermo）；miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control 10 pmol（德國QIAgen，貨號：219610）；RNase-free水（碧云天）、無水乙醇（廣州化學試劑廠）；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection kit（美國GeneCopoeia公司）。

1.3 血液標本的收集與儲存用EDTA抗凝管收集各組患者外周血5 mL，于4℃、2 000 r/min離心10 min，將分離得到的上層血漿2 h內(nèi)分裝至EP管中置于-80℃長期保存。

1.4 熒光定量PCR法檢測miR-499和miR-486的表達水平解凍血漿樣本，于離心管中按照200 μL血漿加入1 000 μL QIAzol Lysis Reagent裂解液（1∶5）裂解樣品。按試劑盒說明書提取總RNA。檢測RNA濃度、純度，由于血漿樣本中的RNA為游離的RNA，RNA含量較低，無法通過電泳法得到證實，本研究僅通過qPCR結果來判定。按試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄引物序列見表1。miRNA熒光定量檢測：采用熒光定量PCR法檢測miR-499和miR-486在各組血漿樣本中的表達水平。miR-499、miR-486及cel-39mimic（內(nèi)參）的上下游引物均購自廣州金域醫(yī)學檢驗中心。qPCR檢測反應液的配制：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix；2 μL qPCR Forward Primer（2 μmol/L）；1 μL Universal PCR primer（2 μmol/L）；2 μL First strand cDNA；5 μL ddH2O。qPCR反應程序：95℃預變性10 min，循環(huán)1次；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，重復40個循環(huán)，然后進行熔解曲線分析。每個組織樣本做3次平行試驗，采用2-ΔΔCt來分析miRNA的相對表達量。

Tab.1Primer sequences of reverse transcrption表1 逆轉(zhuǎn)錄引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理。計量資料符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標準差描述，不符合正態(tài)分布的用M（P25，P75）描述。非正態(tài)分布的計量資料2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。利用ROC曲線分析miR-486和miR-499表達量診斷肺癌最佳臨界值、敏感度與特異度。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組miR-486、miR-499表達水平比較NSCLC組和SCLC組中miR-486、miR-499表達水平均低于對照組（P＜0.05），SCLC組與NSCLC組間差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.2Comparison of relative expression levels of miR-486 and miR-499 between three groups表2 各組miR-486、miR-499的相對表達水平比較M（P25，P75）

2.2 NSCLC組miR-486和miR-499的相對表達量與臨床特征的關系NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征間差異均無統(tǒng)計學意義；而TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表達越低（P＜0.05），見表3。

Tab.3Relationship between plasma expression levels of miR-486 and miR-499 with clinical features in NSCLC group表3 NSCLC組血漿中miR-486、miR-499的表達與臨床特征的關系M（P25，P75）

2.3 SCLC組miR-486和miR-499的相對表達量與臨床特征的關系SCLC組血漿miR-486在腫瘤局限期和廣泛期間表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即分期越廣泛miR-486表達越低；而miR-499在不同臨床特征間差異均無統(tǒng)計學意義，見表4。

Tab.4Relationship between plasma expression levels of miR-486 and miR-499 with clinical features in the SCLC group表4 SCLC組血漿中miR-486、miR-499的表達與臨床特征的關系M（P25，P75）

2.4 miR-486和miR-499的相對表達量對肺癌的診斷價值ROC曲線顯示，miR-486診斷肺癌的曲線下面積（AUC）為0.83（95%CI：0.73～0.93），敏感度和特異度分別為90.0%和68.6%，最佳診斷界值為1.02；miR-499診斷肺癌的AUC為0.75（95%CI：0.62～0.88），敏感度和特異度分別為60.0%和94.3%，對肺癌的最佳診斷界值為0.32，見圖1。。

Fig.1ROC curves of relative plasma expressions of miR-486 and miR-499 in the diagnostic value of lung cancer圖1 血漿中miR-486和miR-499相對表達量對肺癌診斷價值的ROC曲線

3 討論

miRNAs是一類高度保守、長度很短的非編碼調(diào)控單鏈RNA，長度約19～25 nt，其廣泛存在于真核生物體內(nèi)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、外侵轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)歸預后等多個環(huán)節(jié)［8］。Croce實驗室研究顯示，超過半數(shù)的miRNA基因存在于腫瘤相關基因中，miR-15a、miR-16a在慢性淋巴細胞白血病標本中表達缺失或下調(diào)［9］。有研究認為，miR-21、miR-210、miR-126、miR-486可以作為診斷NSCLC的參考指標［10］。Hu等［11］研究證實，NSCLC患者共有11種miRNA的表達量較正常情況下上調(diào)5倍之多，其中miR-1、miR-499、miR-486、miR-30d與NSCLC總生存率相關，有望作為NSCLC患者的預后指標。

本研究結果顯示，NSCLC組和SCLC組血漿中miR-486表達水平均明顯低于對照組，與既往研究結果基本一致［10-11］，且ROC曲線示miR-486診斷肺癌的AUC為0.83，接近0.90，具有中等診斷效率，提示血漿中miRNA-486表達水平的高低可能成為肺癌的非侵入性生物標志物，可用于肺癌早期檢測。NSCLC組血漿miR-486在不同臨床特征間差異均無統(tǒng)計學意義；而在SCLC組中分期越晚，miR-486表達越低，提示miR-486可能是SCLC預后的影響因素。

目前，有關血漿miR-499的研究通常集中在心肌損傷和心肌梗死之間的關聯(lián)［12］。急性心肌梗死患者血漿中miR-499低表達，預示其可能成為早期檢測心肌損傷的生物標志物［12］。Donaldson等［13］研究發(fā)現(xiàn)，血漿miR-499在慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者中明顯升高。Vinci等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-499在NSCLC組和對照組中表達差異并無統(tǒng)計學意義；本研究結果顯示，血漿miR-499在NSCLC和SCLC患者中表達水平均低于對照組，與Vinci等［14］學者的研究結論不完全相同，考慮可能與血漿中miR-499含量偏低，樣本量小及操作者的技術水平有關，需要大規(guī)模前瞻性臨床試驗進一步驗證。NSCLC患者的TNM分期越晚、分化程度越低，miR-499表達越低，與既往研究結果類似［7,14］，提示血漿miR-499有可能作為NSCLC預后的生物標志物。

綜上所述，血漿miR-486、miR-489在肺癌患者中表達下調(diào)，均有可能與肺癌的發(fā)生及預后密切相關，有望作為肺癌潛在篩查及預后指標。但是本研究樣本量較小、血漿中的miRNA的量較少，定量PCR的準確性可能降低，這2個miRNA是否為肺癌特異來源尚有待確定。

[1]Chen WQ，Zheng RS，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.doi：10.3322/ caac.21338.

[2]Siegel R，DeSantis C，Virgo K，et al.Cancer treatment and survivorship statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62（4）：220-241.doi：10.3322/caac.21149.

[3]Stefani G，Slack FJ.Small non-coding RNAs in animal development［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（3）：219-230.doi：10.1038/ nrm2347.

[4]Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of miRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18（10）：997-1006.doi:10.1038/cr.2008.282.

[5]Ho AS，Huang X，Cao H，et al.Circulating miR-210 as a novel hypoxia marker in pancreatic cancer［J］.Transl Oncol，2010，3（2）：109-113.

[6]Wang J，Tian X，Han R，et al.Down-regulation of miR-486-5p contributes to tumor progression and metastasis by targeting protumorigenic ARHGAP5 in lung cancer［J］.Oncogene，2014，33（9）：1181-1189.doi：10.1038/onc.2013.42.

[7]Qiu F，Yang L，Ling X，et al.Sequence variation in mature miRNA-499 confers unfavorable prognosis of lung cancer patients treated with platinum-based chemotherapy［J］.Clin Cancer Res，2015，21（7）：1602-1613.doi：10.1158/1078-0432.CCR-14-1174.

[8]Chen X，Hu ZB，Wang WJ，et al.Identification of ten serum miRNAs from a genome-wide serum miRNA expression profile as novel non—invasive biomarkers for non-small cell lung cancer diagnosis［J］.Int J Cancer，2012，130（7）：1620-1628.doi：10.1002/ijc.26177.

[9]Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human miRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：2999-3004.doi：10.1073/pnas.0307323101.

[10]Shen J，Todd NW，Zhang H，et al.Plasma miRNAs as potential biomarkers for non-small-cell lung cancer［J］.Lab Invest，2011，91（4）：579-587.doi：10.1038/labinvest.2010.194.

[11]Hu Z，Chen X，Zhao Y，et al.Serum miRNA signatures identified in a genome-wide serum miRNA expression profiling predict survival of non-small-cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2010，28（10）：1721-1726.doi：10.1200/JCO.2009.24.9342.

[12]Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating miRNA：a novel potentialbiomarkerforearlydiagnosisofacutemyocardial infarction in humans［J］.Eur Heart，2010，31（6）：659-666.doi：10.1093/eurheartj/ehq013.

[13]Donaldson A，Natanek SA，Lewis A，et al.Increased skeletal muscle-specific miRNA in the blood of patients with COPD［J］. Thorax，2013，68（12）：1140-1149.doi：10.1136/thoraxjnl-2012-203129.

[14]Vinci S，Gelmini S，Pratesi N，et al.Genetic variants in miR-146a，miR-149，miR-196a2，miR-499 and their influence on relative expression in lung cancers［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49（12）：2073-2080.doi：10.1515/CCLM.2011.708.

（2016-06-12收稿2016-09-19修回）

（本文編輯陸榮展）

The expression and clinical significance of plasma miR-486 and miR-499 in patients with lung cancer

YANG Yang1,2,YANG Qing3,JIA Youchao2,LI Xiaofang2,YANG Hua2,ZHANG Qian2,PENG Xinyu4,ZANG Aimin2△
1 Hebei University,Baoding 071002,China;2 Hebei Key Laboratory of Cancer Radiotherapy and Chemotherapy,Department of Medical Oncology,the Affiliated Hospital of Hebei University;3 Department of Blood Transfusion, 4 Department of Hepatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Hebei University△

ObjectiveTo explore the expression levels of miR-486 and miR-499 in the plasma of lung cancer patients,and analyze their expression differences in non-small cell lung cancer(NSCLC)and small cell lung cancer(SCLC). MethodsBlood samples were collected in 35 patients with lung cancer(21 NSCLC and 14 SCLC)and 30 healthy persons (control group).The real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of plasma miR-486 and miR-499 in two groups.The plasma levels of miRNA-486 and miRNA-499 and their correlation with various clinical features in NSCLC and SCLC patients were analyzed.The receiver operating characteristic curves（ROC）of miRNA expressions were analyzed.The area under a curve（AUC）,threshold and the sensitivity and specificity were calculated.ResultsThe expression levels of miR-486 and miR-499 were significantly lower in NSCLC and SCLC groups than those of the control group（P＜0.05).There were no significant differences in the expression of miR-486 between different clinical features in NSCLC group.For the late cancer TNM staging,the tumor differentiation was lower,and the miR-499 expression level was lower(P＜0.05).In SCLC group,for the late cancer staging,there was a lower expression level of miR-486.There were no significant differences in the expressions of miR-499 between different clinical features.The miRNA-486 AUC in the diagnosis of lung cancer was 0.83(95%CI:0.73-0.93),the sensitivity and specialty rates were 90.0%and 68.6% respectively,and the best diagnostic value was 1.02.The miRNA-499 AUC in the diagnosis of lung cancer was 0.75(95% CI:0.62-0.88),the sensitivity and specialty rates were 60.0%and 94.3%respectively,and the best diagnostic boundary value was 0.18 for lung cancer.ConclusionThe plasma expression levels of miR-499 and miR-486 are down-regulated in lung cancer patients,which suggest a poor prognosis and can be used as potential screening and prognostic indicators forlung cancer.

carcinoma,non-small-cell lung；microRNAs；plasma；sensitivity and specificity；diagnosis,differential；miR-486；miR-499

R734.2

A

10.11958/20160528

2015年河北省政府資助臨床醫(yī)學優(yōu)秀人才項目（361007）

1河北大學（郵編071002）；2河北省放化療機制與規(guī)程重點實驗室，河北大學附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；3輸血科，4肝膽外科

楊陽（1985），男，碩士在讀，主要從事肺癌分子生物學研究

△通訊作者E-mail:booszam@sina.com